Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010
371
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA P24 CỦA HIV-1
PHÂN TYPE AE CỦA BỆNH NHÂN Ở HÀ NỘI
EXPRESSION OF GENE ENCODING P24 PROTEIN
FROM HIV-1 SUBTYPE CRF_01AE OF PATIEN IN HANOI

SVTH: Phạm Thị Kim Thảo
Lớp 05SH, Khoa Hoá, Trường Đại học Bách Khoa
GVHD: PGS.TS. Đinh Duy Kháng
Phòng Vi sinh vật phân tử, Viện công nghệ sinh học, Viện khoa học Việt Nam

TÓM TẮT
HIV-1 CRF01_AE là phân type chiếm tỷ lệ lây nhiễm cao tại Việt Nam và các nước Đông
Nam Á. Sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc, văcxin chưa thực sự có hiệu lực và các tệ nạn
xã hội đang góp phần làm cho đại dịch HIV lan tràn với tốc độ chóng mặt. Vì vậy việc chẩn đoán
sớm nhiễm HIV là biện pháp tốt nhất để ngăn chặn sự lây nhiễm trong cộng đồng và đảm bảo an
toàn trong công tác truyền máu. Hiện nay trên thị trường có nhiều kit chẩn đoán HIV dựa trên cơ
sở các protein tái tổ hợp gp120, gp41 và p24 nhưng giá thành rất cao và chưa phù hợp với các phân
týp HIV đang lưu hành ở Việt Nam. Sự phát hiện protein p24 của HIV-1 giúp chẩn đoán sớm nhiễm
HIV, theo dõi diễn tiến của bệnh và đánh giá hiệu quả của liệu pháp kháng retrovirus.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã biểu hiện thành công protein tái tổ hợp p24 trong tế
bào E.coli BL21 star
TM
DE3, tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện và tinh sạch bằng cột Ni
2+
-Resin để
tạo kit chẩn đoán. Protein tái tổ hợp thu được phản ứng đặc hiệu với huyết thanh của bệnh nhân
nhiễm HIV bằng phương pháp Western Blot.
ABSTRACT
HIV-1 CRF01_AE appears to be the cause of high proportion of infections in Viet Nam and

HIV-1 là type lưu hành chủ yếu và gây đại dịch trên toàn cầu. HIV-1 gồm bốn phân
nhóm chính M, N, O, P, trong đó Nhóm M chiếm 90% các trường hợp nhiễm HIV-1. Có ít
nhất là 9 phân type di truyền, gồm A, B, C, D, F, G, H, J, K và các thể tái tổ hợp (CRFs).
Có khoảng 30 thể tái tổ hợp đã được phát hiện mới. Các phân type này phân bố theo từng
vùng địa lý khác nhau. Hiện nay, type CRF01_AE (tái tổ hợp vật chất di truyền giữa typ A
và E) là phân typ gây đại dịch ở các nước Đông Nam Á và cũng là phân nhóm chiếm đến
97% phân typ HIV-1 lưu hành tại Việt Nam.
Việc chế tạo các kit chẩn đoán đòi hỏi phải dựa trên sự lưu hành phân typ trong
nước thì mới đảm bảo được tính chính xác và độ nhạy cao, đồng thời hạ giá thành sản
phẩm. Các bộ Kit này dựa trên cơ sở các protein gp120, gp41 và p24 tái tổ hợp. Đáng lưu ý
là p24, là protein nucleocapsit hay còn gọi là protein lõi, có vai trò quan trọng ở các giai
đoạn khác nhau trong chu trình sống của HIV. Trước tiên p24 tham gia vào quá trình cởi
áo sau khi virus xâm nhập, nó ảnh hưởng đến mối liên kết giữa RNA và DNA trong giai
đoạn đầu của quá trình nhiễm, hoạt động như là yếu tố hỗ trợ (cofactor) cho enzym phiên
mã ngược, làm nhiệm vụ nhận biết các dấu hiệu đóng gói, trung gian cho sự kết hợp giữa
hai phân tử RNA khác nhau để hình thành genom của hạt virion HIV-1 mới.
Trong chẩn đoán, p24 là kháng nguyên đặc hiệu của HIV. P24 xuất hiện sớm nhất,
2 – 3 tuần sau nhiễm HIV và duy trì trong suốt giai đoạn cấp tính của nhiễm trùng HIV.
Sau đó, kháng nguyên p24 giảm dần đồng thời có sự xuất hiện kháng thể p24. Điều này
báo hiệu giai đoạn không triệu chứng của nhiễm HIV. Vài tháng cho tới vài năm sau nhiễm
trùng, kháng thể p24 mất đi, kháng nguyên p24 tái xuất hiện, báo hiệu giai đoạn xuất hiện
triệu chứng của bệnh (AIDS). Đây là cơ sở để xây dựng các phác đồ điều trị cho những
bệnh nhân nhiễm HIV.
Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu
biểu hiện gen mã hóa p24 của HIV-1 phân typ A/E của bệnh nhân ở Hà Nội”
2. Nguyên liệu và phương pháp
2.1. Nguyên liệu
Gen p24 của HIV phân type đã được tách dòng thành công trong vector tái tổ hợp pCR2.1-
p24AE.
2.2. Phương pháp nghiên cứu

Nuôi vi khuẩn trong môi trường LB bổ sung ampicilin (0,1mg/ml) và X-gal (0,1mg/ml),
nuôi 37°C qua đêm, chọn 11 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh tách plasmid, điện di
kiểm tra hình2A. Chọn 5 plasmid ở Hình 2A đường chạy số 3, 5,6, 7, 8, cắt kiểm tra bằng
Bam HI và Xho I, Căn cứ vào kết quả ở hình 2B đường chạy 2, 3, 4 văng ra hai băng, có
khả năng chúng tôi tạo được plasmid tái tổ hợp dòng trung gian mang gen kích thước
khoảng 584bp.
Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010
374

Hình 2. Kết quả tạo vector tái tổ hợp dòng trung gian pCR2.1.p24AEBam-Xho
A. Kết quả tách chiết plasmid dòng trung gian. B. Kết quả kiểm tra plasmid dòng trung gian bằng enzym giới
hạn Bam HI và Xho I. ĐC 1A-11A. Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc trắng; ĐC X. Plasmid tách chiết từ khuẩn
lạc xanh; ĐC M. Thang ADN chuẩn; ĐC 1B-5B. Plasmid 3,5, 6, 7, 8 cắt bằng enzym giới hạn Bam HI và
Xho I; ĐC6B. Sản phẩm PCR gen p24chạy bằng cặp mồi biểu hiện.
Kết quả giải trình tự và dịch mã ra các axit amin trên cơ sở lý thuyết, cho phép
chúng tôi khẳng định rằng đã tách dòng thành công vector dòng trung gian và đoạn gen
p24 thu được trong vector pET32a+ có khung đọc đúng, có mã khởi đầu và kết thúc, không
có điểm kết thúc ở vùng khởi động, đảm bảo cho quá trình biểu hiện thông suốt.
Xử lý plasmid pCR2.1.p24AEBam-Xho và pET32a+ bởi hai enzym Bam HI và
Xho I. Tiến hành phản ứng gắn tạo vector biểu hiện pET32a+.p24, sau đó biến nạp vào tế
bào E.coli DH5α, trải trên LB bổ sung ampicilin. Thu các khuẩn lạc đã nuôi cấy tách chiết
plasmid, rồi cắt kiểm tra bằng Bam HI và Xho I.

Hình3. Trình gen p24 và kết quả cắt kiểm tra các vector dòng tái tổ hợp pET32a+.p24 bằng enzym giới hạn.
Vị trí cắt của Bam HI. GGATCC; Vị trí cắt của Xho I. CTCGAG

Hình 4. Kết thiết kế vector biểu hiện
A. Kiểm tra sản phẩm thôi gel; B. kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET32a+p24 tách từ E.coli;C. Kiểmm tra các
vector pET32a+ dòng tái tổ hợp mang gen p24 bằng Bam HI và Xho I; ĐC1A.gen p24 thu được sau xử lý
Bam HI và Xho I; ĐC 2A plasmid pET32a+ đã được cắt mở vòng bằng Bam HI và Xho I, M. thang DNA

quá trình tinh chế, imidazol được sử dụng như chất
cạnh tranh Ni
2+
trong phức hợp Ni
2+
-histidine. Các
protein lẫn trong dịch chiết protein tái tổ hợp tan được
loại bỏ hiệu quả khỏi protein tái tổ hợp ở nồng độ
imidazol 50 mM. Sau đó protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột nhờ buffer đẩy (Native
Elution Buffer), chúng tôi thu 8 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1ml. Sau khi tinh chế, protein
tái tổ hợp được kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel polyacrylamit (Hình 6).
Hỗn hợp từ phân đoạn 1 – 6 ở hình 6 chúng tôi tiến hành xác định nồng độ bằng
phương pháp Bardford thì hàm lượng protein thu được là 0,5mg/ml trong 100ml dịch nuôi
cấy. Sử dụng 5µl protein tái tổ hợp được sinh sạch để tiến hành thí nghiệm
Hình 5. Biểu hiện tối ưu protein p24
ĐC M: Thang protein chuẩn,
ĐC1: protein dòng mang plasmid
tái tổ hợp không được cảm ứng
IPTG, ĐC2: dòng plasmid mang
vecter tái tổ hợp cảm ứng IPTG

Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010
376

Hình 6. kết quả tinh sạch của các phân đoạn protein thu được
M thang protein chuẩn, ĐC F: mẫu protein trước tinh sạch, ĐC 1 – 8: tương ứng các phân
đoạn thu được sau tinh sạch.

Biểu đồ 1. Đồ thị đường chuẩn để xác định nồng độ protein p24 tái tổ hợp



[1] Seidman C. E., Struhl K., Sheen J., Jessen T. (1997), Current Protocols in Molecular
Biology,pp.1.8.1-1.8.10
[2] Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., 1989: Molecular cloning: A laboratory
manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
[3] Bradford, M. M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of
Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.
Anal. Biochem. 72:248-254.
[4] Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide
gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S
A. 76(9):4350-4.