VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
******************
VŨ VĂN LỢI
TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE
ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM
TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Hà Nội - 2012
1Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn


Hà Nội – 2012
2Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
i LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến và TS. Phạm Thị
Bích Hợp, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phan Thị Hồng Thảo và các cán bộ Phòng Công nghệ
lên men, Viện Công nghệ sinh học đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này.
Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa Học và Công nghệ
Việt Nam, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen Quốc gia, nơi tôi làm việc, đã tạo
điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: CNHD.ĐT.004/08-1
ĐT.07.08/CNSHCB thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực
công nghiệp chế biến đến năm 2020.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn động
viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Vũ Văn Lợi

Cặp bazơ (base pair)
2
cDNA
DNA bổ trợ (Complementary DNA)
3
DEPC
Diethyl pyrocarbonate
4
his
Histidine dehydrogenase
5
DNA
Deoxyribonucleic acid
6
dNTP
Deoxynucleotide
7
EDTA
Ethylene diamine tetra-acetic acid
8
EtBr
Ethidium bromide
9
kb
Kilo bazơ
10
kDa
Kilo Dalton
11
LiP

RT-PCR
Phản ứng phiên mã ngược chuỗi polymerase
(Reverse transcription polymerase chain reaction)
22
SDS
Sodium dodecyl sulfate
23
SDS-PAGE
Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium doecyl
sulfate
24
TAE
Tris-acetat EDTA
25
TEMED
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine
26
tRNA
ARN vận chuyển

5Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
2.1
Thành phần gel chạy SDS-PAGE

Hình
Tên hình
Trang
1.1
Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin
3
1.2
Cấu trúc hoá học tiêu biểu của lignin
4
1.3
Sự phân cắt liên kết Cα-Cβ và β-O-4 ở các tiểu phần của
polymer lignin, tạo thành các oligomer
5
1.4
Cơ chế phân cắt mối liên kết C

-C

tạo thành gốc aryl
6
1.5
Cơ chế xúc tác của laccase
7
1.6
Nguyên lý của quá trình tích hợp gen ngoại lai vào locus
his4
14
3.1
Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số và sản phẩm cDNA của
nấm đảm P. chrysosporium 36210

tái tổ hợp trên SDS-PAGE gel
42
3.8.
Hoạt tính rLiP H8 của các dòng P. pastoris tái tổ hợp sau
84 giờ nuôi cấy
43
3.9.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng biểu hiện rLiP H8
của chủng P. pastoris C132
45
3.10
Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp rLiP H8 bởi
chủng P. pastoris C132 trong bình lên men tự động Bioflo
110 dung tích 7,5 lít
51
3.11.
Hoạt tính rLiP H8 từ chủng P. pastoris C132 trước và sau
quá trình tối ưu
52
3.12.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8
sinh tổng hợp bởi P. pastoris C132
53
3.13.
Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8 sinh
tổng hợp bởi P. pastoris C132
54
3.14
Độ bền của rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 khi ủ ở các
nhiệt độ khác nhau theo thời gian

4
1.2.1. Lignin peroxidase
5
1.2.2. Mangan peroxidase
6
1.2.3. Laccase
7

8
1.3.1. Khả năng phân giải lignin của nấm mục trắng (white-rot fungi)
8
1.3.2. Khả năng phân giải lignin của vi khuẩn
9

10
  lignin peroxidase 

11

12
1.6.1. Vector biểu hiện pPIC9
12
1.6.2. Chuyển gen ngoại lai vào hệ gen nấm men
13
1.6.3. Chủng biểu hiện nấm men P. pastoris GS115
14

P. pastoris
16
1.7.1. Ảnh hưởng methanol

2.2.6. Tách dòng và phân tích trình tự gen lipH8
25
2.2.7. Đăng ký trình tự lipH8 trên GenBank
25
2.2.8. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn
25
2.2.9. Phản ứng ghép nối gen
26
2.2.10. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli và P. pastoris
26
2.2.11. Phương pháp tách chiết DNA hệ gen từ tế bào nấm men P.
pastoris
28
2.2.12. Tạo chủng P. pastoris tái tổ hợp
28
2.2.13. Sàng lọc dòng P. pastoris biểu hiện LiP H8 tái tổ hợp hoạt
tính cao
29
2.2.14. Xác định hàm lượng protein
29
2.2.15. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide - SDS
30
2.2.16. Nghiên cứu môi trường và điều kiện lên men biểu hiện rLiP
H8 của chủng P. pastoris C132
30
2.2.17. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính và độ bền của
31
10Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ix


49

50
3.7. 
H8
53
3.7.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính xúc tác của rLiP H8
53
3.7.2. Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ xúc tác của rLiP H8
54
3.7.3. Độ bền của rLiP H8 với nhiệt độ
53
3.7.4. Độ bền của rLiP H8 với pH
55
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
57
TÀI LIỆU THAM KHẢO
58
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
62
PHỤ LỤC
63

11Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1

MỞ ĐẦU
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật, có mặt trong
nguyên liệu, phụ phẩm và chất thải của sản xuất nông, lâm, công nghiệp.
Lignocellulose chứa lignin, hemicellulose và cellulose; trong đó lignin (chiếm

H2, H6, H7, H8 và H10 đã được tách từ dịch nuôi cấy của P. Chrysosporium
(Leisola et al., 1987; Ollikka et al., 1993). Các isozyme này được cho rằng có
thể tạo ra từ quá trình sửa đổi các protein sau quá trình dịch mã (post-
translational modification). Các gen mã hóa enzyme H2, H6, H8 và H10 đã
được xác định và giải trình tự trong khi một số gen mã hóa các isozyme LiP
khác chưa được xác định. Trong các isozyme trên thì LiP H2 và LiP H8 có
hoạt tính phân hủy lignin cao hơn cả. Khi biểu hiện enzyme LiP H8 tái tổ hợp
trong Escherichia coli, enzyme chỉ có hoạt tính khi được tái cấu trúc từ dạng
thể vùi LiP đã biến tính (denatured inclusion bodies) (Doyle, Smith, 1996).
Biểu hiện LiP H8 trong các vật chủ khác như A. niger (Aifa et al., 1999); P.
chrysosporium (Gelpke et al., 1999) và P. methanolica (Wang et al., 2004),
đã được thực hiện thành công trên thế giới. Hoạt tính rLiP H8 từ A. niger tái
tổ hợp sử dụng vector pGV1503, hoạt tính enzyme đạt 1,125 nkat/mg. Trong
khi đó, Wang và cộng sự biểu hiện rLiP H8 trong P. methanolica có hoạt tính
lần lượt là 932 U/L khi sử dụng vector pMETA và 1933 U/L đối với
pMETαA (Wang et al., 2004). Vì vậy, biểu hiện LiP H8 trong các vi sinh vật
khác nhau nhằm thu LiP hoạt tính cao đang được nhiều nhóm nghiên cứu trên
thế giới quan tâm (Doyle, Smith, 1996; Martinez, 2002; Wang et al., 2004).
Ở Việt Nam, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào biểu hiện các
isozyme LiP từ P. chrysosporium và ứng dụng trong công nghệ sản xuất bột
giấy (Nguyễn Thị Thanh Kiều, Phạm Thành Hổ, 2002). Do vậy, mục tiêu của
của luận văn này là:”Tách dòng và biểu hiện lignin peroxidase isozyme H8
của Phanerochaete chrysosporium trong nấm men Pichia pastoris“ nhằm
thu enzyme tái tổ hợp có hoạt tính cao.
Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ
sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

13Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3


Do sự phức tạp trong cấu trúc lignin với các tiểu phần khác nhau bắt
cặp với nhau một cách ngẫu nhiên, nên cho đến nay người ta vẫn chưa mô tả
được chính xác và đầy đủ cấu trúc hoá học của lignin.
1.2. Hệ enzyme phân hủy lignin
Trong thực tế, lignin được phân giải bằng quá trình oxy hóa phức tạp,
nhưng nhờ tác động của một số enzyme cơ bản (lignin peroxidase (LiP),
mangan peroxidase (MnP)

và laccase) do nấm mục trắng và vi sinh vật sinh
tổng hợp. Ngoài ra, một thành phần quan trọng của hệ thống enzyme phân
huỷ lignin là các enzyme oxidase, bao gồm: glyoxal oxidase, glucose oxidase,
aryl alcohol oxidase… Các enzyme này không trực tiếp tham gia vào cơ chế
phân cắt mạch lignin nhưng chúng tiến hành phản ứng oxy hoá chuyển
C
2
H
2
O
2
(có sự tham gia của O
2
) thành H
2
O
2
cần thiết cho hoạt động của các
peroxidase ngoại bào.

15Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
5


16Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6 Hình 1.4. Cơ chế phân cắt mối liên kết C

-C

tạo thành gốc aryl
Lignin peroxidase phản ứng với cơ chất qua hai giai đoạn oxy hóa kế
tiếp chuyển dịch một điện tử, hình thành cation-gốc tự do trung gian. Do thế
oxy hóa khử cao (1.5V), lignin peroxidase cũng có thể oxy hóa đơn vị mắt
xích của lignin là phenyl propan ở dạng không phenolic (Schoemaker,
Piontek, 1996).
Một số nghiên cứu đã chỉ ra vai trò quan trọng của lignin peroxidase
trong quá trình phân giải lignin và các thực vật chứa lignin. Enzyme này có
thể phân giải lignin trong dung dịch loãng, oxy hóa và phân giải hàng loạt
dimer và oligomer tương ứng với các cấu trúc của lignin trong điều kiện
phòng thí nghiệm, xúc tác cho quá trình tạo ra các phân tử oxy hoạt tính.
1.2.2. Mangan peroxidase
Mangan peroxidase được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P.
chrysosporium, được Kuwahara và cộng sự công bố năm 1984. Mangan
peroxidase là một glycoprotein có trọng lượng phân tử khoảng 40÷48 kDa và
có điểm đẳng điện pI 2,9÷7,0. Ngoài P. chrysosporium, MnP còn được tìm
thấy trong nấm mục trắng khác T. versicolor, P. radiata, Ceriporiopsis
cubvermis, Agarious bisporus, Nematoloma frowadic. Enzyme này hoạt động
như một phenoloxydase trên cơ chất phenolic bằng cách sử dụng Mn
3+
/Mn

đổi các chất quinon. Sự thay đổi này dẫn tới việc phân tách bộ khung cacbon-
cacbon hoặc cacbon-oxy bên trong các tiểu đơn vị phenylpropan của lignin.
18Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
8

Kết quả là hai chuỗi bên và các vòng thơm bị phân hủy. Đây là những bước
phản ứng quan trọng cho quá trình chuyển hóa, phân hủy các hợp chất lignin.
Trong quá trình xúc tác, laccase kết hợp với một số enzyme như glucose
oxydase, lignin peroxidase….thực hiện phân cắt các mối liên kết cacbon-
cacbon, cacbon-oxy trong cấu trúc lignin và hợp chất lignin thành các vòng
thơm có cấu trúc đơn giản hơn.
1.3. Vi sinh vật phân hủy lignin
Trong tự nhiên, gỗ là cơ chất khó bị phân huỷ do thành phần hoá học và
kết cấu đặc trưng của nó. Các polyme cấu trúc chính của gỗ bao gồm
cellulose (chiếm 40÷50 % trọng lượng khô của gỗ), hemicellulose (25÷40%),
lignin (20÷30%) và một lượng nhỏ protein (<5%). Như vậy trong gỗ có chứa
rất ít nitơ, mà nitơ lại cần để tạo ra các enzyme phân huỷ các hợp phần này.
Ngoài ra, lignin nằm trong vách tế bào cũng cản trở sự phân hủy gỗ do nó hạn
chế khả năng thấm nước của cellulose và hemicellulose, do vậy cũng cản trở
sự phân hủy của các polysacaride này; đồng thời nó hình thành một rào chắn
các enzyme vi sinh vật tấn công 2 thành phần còn lại. Bên cạnh đó, trong gỗ
luôn có các chất độc như ta-nanh, terpen, stilbenen, flavonoit và troponol
khiến cho côn trùng và vi sinh vật khó tiêu hóa được gỗ. Mặc dầu vậy, vẫn có
một số loài nấm và vi sinh vật tấn công được vào thành tế bào gỗ và phân hủy
mô gỗ.
1.3.1. Khả năng phân giải lignin của nấm mục trắng (white-rot fungi)
Tác nhân làm mục gỗ nhiều nhất trong tự nhiên là các loại nấm thuộc
nhóm nấm đảm (Basidiomycetes) - tác nhân cần thiết trong quá trình tuần
hoàn sinh khối và làm giàu đất cho hệ sinh thái rừng. Theo cách thức tấn công
vách tế bào mà chúng được chia thành ba loại: nấm mục trắng, mục nâu và

vẫn chưa thực sự rõ ràng. Một số tác giả đã phân lập được vi khuẩn thuộc chi
Agrobacterium, Burkholderia, Arthrobacter và Sphingomonas thường xuyên có
mặt trong môi trường nuôi cấy P. chrysosporium. Quan hệ giữa vi khuẩn và loài
nấm này được giả thiết là cộng sinh, vì chúng có khả năng phân giải các hợp
chất thơm là sản phẩm từ quá trình phân hủy lignin của nấm.
Một số nghiên cứu mới đây đã cho thấy khả năng phân giải lignin của các
vi khuẩn thuộc chi Clostridium đã chứng minh được rằng lignin cũng có thể bị
phân huỷ trong điều kiện yếm khí (Crawford, 1978).
20Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10

1.4. Ứng dụng của lignin peroxidase
Nước ta là một nước nông nghiệp nhiệt đới nên nguồn phụ phẩm và phế
thải có nguồn gốc thực vật rất dồi dào. Lignocellulose lại chiếm một tỉ lệ rất
lớn. Hiện nay, nhìn chung việc xử lý lignocellulose ở nước ta, đặc biệt là lignin,
còn rất thô sơ. Các biện pháp chủ yếu là thải trực tiếp vào môi trường để phân
hủy tự nhiên, chôn lấp (rác thải sinh hoạt) hoặc đốt (rơm rạ).
Nước thải từ các cơ sở chế biến bột giấy có lượng khá lớn dẫn xuất của
lignin là các hợp chất vòng thơm độc hại, muối vô cơ và hydro sulfur (H
2
S)
có mùi hôi do sử dụng sulfit natri để tách lignin. Lignin trong nước thải có thể
phản ứng với clo tạo thành các hợp chất phenol clo hóa độc hại nhưng khó bị
phân hủy. Theo số liệu thống kê, khoảng 90% chất màu từ cơ sở dệt nhuộm
không bị phân hủy sau quá trình xử lý nước thải bằng biện pháp lý-hóa học.
Đôi khi, sản phẩm phân giải các chất màu này lại còn độc hại hơn. Ví dụ,
trong quá trình xử lý yếm khí nước thải, enzyme azo-reductase thường cắt
chất màu azo thành amin. Nhiều chất thuộc nhóm amin là tác nhân gây đột
biến hoặc ung thư. Để giải quyết vấn đề này, sử dụng enzyme vi sinh vật là
giải pháp an toàn nhất, bởi enzyme làm giảm độc tính của các hợp chất phenol

tại Việt Nam
Isozyme lignin peroxidase được mã hóa bởi một tổ hợp các gen và đã
được biểu hiện như là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của quá trình nuôi cấy.
Ngoài ra, một vài hệ biểu hiện đồng hình (homologous expression) và hệ biểu
hiện dị hình (heterologous expression) cho LiP đã được nghiên cứu.
Một vài loại isozyme LiP mã hóa bởi các gen lip khác nhau đã được
nghiên cứu trong xạ khuẩn và nấm mục trắng P. chrysosporium. Leisola và
cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích dựa vào điểm đẳng điện và tìm
thấy có 15 loại isozyme LiP khác nhau trong dịch nuôi cấy chủng P.
chrysosporium BKM-1767 thu nhận ở các thời gian và điều kiện nuôi cấy
khác nhau (Leisola et al., 1987). Các isozyme LiP có đặc tính vật lý, độ bền
và tính oxy hóa đặc hiệu khác nhau đối với các chất màu tổng hợp hoặc các
cơ chất có cấu trúc tương tự lignin. Trong dịch nuôi cấy P. Chrysosporium,
sáu loại isozyme LiP bao gồm các loại H1, H2, H6, H7, H8 và H10 đã được
22Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12

phân tách và nhận biết. Các gen mã hóa isozyme H2, H6, H8 và H10 đã được
xác định và giải trình tự, trong khi một số gen mã hoá các isozyme LiP khác
chưa được tìm thấy. Cho đến nay, một số gen mã hóa cho một vài loại
isozyme LiP khác nhau đã được phân lập, giải trình tự gen và biểu hiện ở các
sinh vật chủ khác nhau. Trong đó, biểu hiện enzyme tái tổ hợp LiP H8 trong
E. coli, enzyme tái tổ hợp chỉ có hoạt tính khi được tái cấu trúc từ các thể vùi
LiP biến tính (denatured inclusion bodies). Biểu hiện LiP H8 trong các vật
chủ khác như A. niger (Aifa et al., 1999); P. chrysosporium (Gelpke et al.,
1999) và P. methanolica (Wang et al., 2004), đã được thực hiện thành công
trên thế giới. Hoạt tính rLiP H8 từ A. niger tái tổ hợp sử dụng vector
pGV1503, đạt 1,125 nkat/mg. Trong khi đó, Wang và cộng sự biểu hiện rLiP
H8 trong P. methanolica có hoạt tính lần lượt là 932 U/L khi sử dụng vector
pMETA và 1933 U/L đối với vector pMETαA (Wang et al., 2004).

Joseph et al., 1999).
1.6.2. Chuyển gen ngoại lai vào hệ gen nấm men
Đối với hệ biểu hiện P. pastoris, vector thường được tích hợp vào hệ
gen của tế bào nấm men để tăng tính ổn định của chủng biểu hiện tới mức lớn
nhất. Tất cả các vector biểu hiện của P. pastoris đều chứa ít nhất một đoạn
DNA của promoter có chứa điểm cắt giới hạn đặc biệt có tác dụng hướng
vector đã mở vòng tích hợp vào hệ gen thông qua kiểu trao đổi đơn (single
crossover) (Cereghino, Cregg 2000; Cregg et al., 2000). Vector chứa gen
HIS4 của P. pastoris có thể được tích hợp vào locus his4 trong hệ gen (Hình
1.6). Trên thực tế, một phần đáng kể chủng sau biến nạp không chứa vector
biểu hiện. Hiện tượng này có nhiều khả năng do sự chuyển đổi gen giữa gen
HIS4 của vector và locus his4 trong hệ gen, khiến chỉ có gen HIS4 của vector
được gắn vào hệ gen (Cereghino, Cregg 2000; Cregg et al., 2000). Do đó, cần
phải dùng các kỹ thuật phân tích DNA như PCR, Southern blot để khẳng định
sự có mặt của gen ngoại lai trong hệ gen của chủng đột biến.
24Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
14 Hình 1.6. Nguyên lý của quá trình tích hợp gen ngoại lai vào locus his4
1.6.3. Chủng biểu hiện nấm men P. pastoris GS115
Trong số các hệ biểu hiện gen thường được sử dụng là E. coli, Bacillus
sp., nấm men và tế bào động vật thì nấm men được xem là hệ biểu hiện hiệu
quả nhất đặc biệt là trong biểu hiện các protein có nguồn gốc từ eukaryote.
Nấm men có tốc độ sinh trưởng nhanh và lợi thế về thao tác di truyền thuận
tiện như E. coli đồng thời lại có môi trường nhân chuẩn, thực hiện được rất
nhiều cải biến protein sau dịch mã như cắt bỏ các trình tự tín hiệu, bao gói,
cuộn xoắn, tạo cầu disulfide, glycosyl hóa khiến protein ngoại lai có tính tan
tốt, giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo hoạt tính sinh học-vấn đề thường
bị hạn chế khi biểu hiện trong E. coli. Lợi thế của nấm men so với hệ biểu