Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Thái Nguyên, năm 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

ĐỖ THỊ THU HẰNG
TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE TỪ
VI KHUẨN CHỊU LẠNH PSEUDOALTEROMONAS
HALOPLANKTIS ANT/505 TRONG E. COLI VÀ
NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA CHÚNG Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ DI TRUYỀN HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Lê Văn Trƣờng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng
sự nghiên cứu phòng Di truyền vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học thực
hiện từ tháng 9 năm 2010 tới tháng 8 năm 2011.

Thái Nguyên, ngày 24 tháng 09 năm 2011
Tác giả Đỗ Thị Thu Hằng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

i
MỤC LỤC
Trang
Trang bìa phụ
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vi
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Vi khuẩn ưa lạnh 3
1.2. Nơi sống của vi khuẩn ưa lạnh 4
1.3. Enzyme thích ứng lạnh 4
1.4. Ứng dụng của enzyme thích ứng lạnh vào sản xuất công nghiệp 6

2.3.8. Phương pháp thử hoạt tính enzyme pectinase 26
2.3.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số 29
3.2. Kết quả khuyếch đại gen pelC tách chiết từ chủng vi khuẩn
Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 29
3.3. Kết quả tách dòng gen pelC trong E. Coli 30
3.4. Kết quả đọc trình tự gen pelC 31
3.5. Thiết kế vector biểu hiện gen pelC 33
3.5.1. Chuẩn bị vector pET43b và gen biểu hiện pelC 33
3.5.2. Phản ứng gắn đoạn gen pelC vào pET43b và biến nạp vào
chủng E. coli BL21 34
3.5.3. Kiểm tra hoạt tính pectinase của các thể biến nạp trên môi
trường thạch 34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

iii
3.5.4. Kiểm tra sự có mặt pelC trong các thể biến nạp BL21/pET43pelC 35
3.6. Biểu hiện enzyme tái tổ hợp PelC (rPelC) trong môi trường lỏng 36
3.7. Nghiên cứu một số tính chất của rPelC 37
3.7.1. Hoạt tính pectate lyase của rPelC 37
3.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới hoạt tính của enzyme 38
3.7.3. Ảnh hưởng của ion Ca²
+
và Na
+
đến hoạt tính pectinase của rPelC 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

dNTP
Deoxyribonucleotide
8.
E. coli
Escherichia coli
9.
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
10.
EtBr
Ethydium bromide
11.
IPTG
Isopropylthio--D-galactoside
12.
Kb
Kilobase
13.
kDa
Kilo Dalton
14.
LB
Luria and Bertani
15.
PCR
Polymerase Chain Reaction
16.
SDS
Sodium dodecyl sulfate
17.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

vi
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Ba nhóm enzyme thích ứng lạnh của VSV 5
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin 9
Hình 1.3. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases. 11
Hình 1.4. Thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase. 12
Hình 2.2. Sơ đồ vector tách dòng pJET1.2/blunt 21
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số của chủng Psedoalteromonas
haloplanktis ANT/505 29
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pelC 30
Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc các thể biến nạp E.coli DH5α trên môi
trường chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicilin 31
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid chứa gen pelC 31
Hình 3.5. Trình tự nucleotide và amino acid của gen pelC 32
Hình 3.6. Kết quả điện di plasmid pET43b sau khi cắt bằng các enzym
hạn chế 33
Hình 3.7. Kết quả biến nạp vector biểu hiện pET43/pelC vào tế bào E.
coli BL21(DE3) 34
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra khả năng tạo vòng thủy phân pectin của các

gỗ, bơ sữa, phản ứng với enzyme phải thực hiện ở nhiệt độ thấp chính vì vậy
mà việc sử dụng enzyme lạnh đóng vai trò quan trọng giúp nâng cao chất
lượng sản phẩm. Một trong những enzyme lạnh được các nhà công nghệ quan
tâm là pectinase từ các vi sinh vật sinh trưởng ở nhiệt độ thấp do các ưu điểm
của chúng như: tham gia xúc tác phản ứng ở nhiệt độ thường (20-30
o
C) nên
không cần phải tốn năng lượng ủ ấm; bảo vệ được các chất dễ phân hủy trong
dịch quả như vitamin, hương vị; dễ biến tính bởi nhiệt độ.
Gen mã hóa cho pectinase (pelC) là một trong những gen có nguồn
gốc từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505
đã được TS. Lê Văn Trường và cộng sự (Viện Công nghệ Sinh học) tạo
dòng và giải trình tự trong những nghiên cứu trước đây. Tuy nhiên cho đến
nay enzyme này vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ tính chất cũng như khả
năng xúc tác phân hủy cơ chất pectin. Chính vì vậy, để hiểu rõ tính chất của
enzyme này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng và biểu hiện
gen pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis
ANT/505 trong E. coli và nghiên cứu tính chất của chúng”.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

2
Mục tiêu, nội dung nghiên cứu của đề tài
Mục tiêu:
- Biểu hiện được enzyme pectinase PelC tái tổ hợp hoạt động ở nhiệt
độ thấp, phân lập từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas
haloplanktis ANT/505 và nghiên cứu được tính chất của pectinase tái tổ hợp.
Nội dung nghiên cứu:
1. Tách dòng gen pectinase (pelC) từ chủng vi khuẩn chịu lạnh
Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505.

thực vật, nếu chúng trải qua điều kiện sống ở nhiệt độ thấp, ví dụ ở mức nào đó
dưới 5
o
C. Trong số các VSV có thể sinh trưởng ở khoảng 20
o
C hoặc hơn, cần
phải phân biệt sinh vật ưa lạnh với sinh vật chịu lạnh bởi vì sự khác biệt trong
phân bố sinh thái và sự thích nghi sinh hóa của cả hai nhóm [33], [34]. Khái
niệm được Morita đề xuất như sau: sinh vật ưa lạnh là những vi sinh vật có khả
năng sinh trưởng ở nhiệt độ dưới 0
o
C, và nhiệt độ sinh trưởng tối ưu dưới 15
o
C.
Sinh vật ưa lạnh không có khả năng sinh trưởng ở mức 20
o
C trở lên. Trong khi
đó, sinh vật chịu lạnh sinh trưởng tốt hơn ở mức nhiệt độ trên 20-25
o
C và có
thể có giới hạn sinh trưởng trên ở mức 40
o
C [27].
Khái niệm cổ điển đó của Morita được sử dụng thường xuyên trong
nhiều tài liệu. Tuy nhiên, định nghĩa này không được rõ ràng ở ba điểm chính.
Thứ nhất, mức nhiệt độ giới hạn được lựa chọn khá tùy ý và không tương ứng
với sự phân chia rõ ràng của bất kỳ quá trình sinh học hoặc điều kiện môi
trường nào. Thứ hai, định nghĩa của Morita không thể áp dụng được với hầu
hết các sinh vật nhân chuẩn. Cuối cùng, VSV giống như các đơn vị nhiệt động:


nhiệt độ thấp. Hoạt tính riêng biệt của enzyme thích ứng lạnh ở khoảng nhiệt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

5
độ 0-30
o
C cao hơn hoạt tính của các enzyme ưa nhiệt trung bình ở cùng nhiệt
độ. Các enzyme thích ứng lạnh bị biến tính ở mức nhiệt độ cao hơn [17].
Jones và cs đã có báo cáo rằng fructose-1,6-bisphosphate aldolase và gluco-6-
phosphate dehydrogenase của Vibrio marinus sẽ mất 100% hoạt tính sau 30
phút ở 35-36
o
C [21]. Theo Morita, malic dehydregenase bán tinh sạch của
chủng Vibrio marinus MP-1 sẽ mất hoạt tính khi nhiệt độ trên 20
o
C, trong khi
nhiệt độ hoạt động tối ưu là khoảng 15-20
o
C [27]. Hay như lactate
dehydrogenase của VSV ưa lạnh V. marinus, có hoạt tính tối đa ở 10-15
o
C và
mất hoạt tính ở 40
o
C [26].
Ohgiya là người đầu tiên đề xuất phân loại những enzyme thích ứng
lạnh của VSV vào ba nhóm (hình 1.1):
Nhóm I: Nhạy cảm nhiệt. Đặc tính của chúng tương tự với enzyme ưa
nhiệt trung bình.

ngăn chặn sự phát triển của các sinh vật ưa nhiệt trung bình gây hại.
- Bất hoạt enzyme: Điều chỉnh nhiệt độ để bất hoạt các enzyme nhạy
nhiệt một cách dễ dàng.
Một vài ứng dụng điển hình của enzyme thích ứng lạnh được tóm
tắt trong bảng 1.1.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

7
Bảng 1.1. Ứng dụng công nghiệp các enzyme ở nhiệt độ thấp
(Ohgiya, 1999)
Ứng dụng
Enzyme
Ƣu điểm
Chất giặt tẩy
Protease, lipase,
cellulose
Sử dụng với nước máy
Công nghiệp thực
phẩm - Thay đổi thành phần
Β-Galactosidase, lipase
Giữ gìn sự tươi ngon
- Cải thiện hương vị
Protease, lipase, v.v

Hoàn toàn bất hoạt nhiệt
Những enzyme dùng trong công nghiệp giặt tẩy là protease, lipase,
α-amylase và cellulase. Lợi ích nó mang lại là giảm tiêu tốn năng lượng và
giảm hư hỏng, hao mòn khi giặt giũ. Hạn chế của enzyme thích ứng lạnh là
chúng không bền khi được thêm vào sản phẩm cuối cùng sau thời gian dài lưu
kho. Tuy nhiên, những enzyme đó thường là enzyme tái tổ hợp và tính ổn
định của enzyme thích ứng lạnh ngày càng tăng bởi vì chúng ta ngày càng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

8
hiểu biết rõ hơn về cấu trúc cơ bản enzyme và kỹ thuật gây đột biến điểm
định hướng, cũng như tạo đột biến ngẫu nhiên có thể thực hiện được [28],
[43]. Trong sản xuất tơ sợi, các sợi bông thường nhô ra khỏi sợi chính, làm
giảm độ mượt mà và thay đổi diện mạo trang phục [17]. Sử dụng các enzyme
cellulase thích ứng lạnh có thể làm tăng độ mượt và mềm của vải bằng cách
loại bỏ các sợi bông thừa và có thể nhanh chóng bất hoạt các enzyme này sau
khi dùng. Để làm giảm hàm lượng lactose trong sữa, người ta có thể sử dụng
enzyme β-galactosidase thích ứng lạnh. Ứng dụng pectinase trong sản xuất
nước ép trái cây giúp nâng cao hiệu quả quá trình tách chiết và giảm độ sệt của
sản phẩm. Pectinase thích ứng lạnh cũng tạo điều kiện cho phép quá trình sản
xuất nước ép diễn ra ở nhiệt độ thấp. Điều đó giúp giữ chất lượng nước ép và
cho phép bất hoạt enzyme bằng cách điều chỉnh nhiệt độ thích hợp sau xử lý.
1.5. Pectin và pectinase
1.5.1. Pectin
Pectin là các đại phân tử polysaccharide phức tạp có nhiều trong tế bào
thực vật bao gồm: pectin (polymethylgalacturonate), axit pectin (polygalacturonate)
và oligogalacturonate. Pectin có khả năng tan trong nước và có ít nhất 75%
các nhóm carboxyl của galactoronate bị este hóa với methanol. Axit pectin là
chất đa phân tử có khả năng hòa tan trong nước và có ít hơn 75%

vào cơ chế tác động và cơ chất chúng tham gia xúc tác phân cắt mà pectinase
được phân chia thành các loại như sau: (bảng 1.2).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

10
Bảng 1.2. Phân loại các pectinolytic enzyme (Whitaker, 1990)
Loại enzyme
số EC
Chất nền
Sản phẩm
Cơ chế xúc tác
Esterase
- Pectin methylesterase
(pectin esterase)
- Pectin acetylesterase*

3.1.1.11 - Pectin

- Pectin

- Pectin acid + Methanol - Thủy phân

Polygalacturonase

- Methyloligogalacturonates

- Thủy phân
- Thủy phân
- Thủy phân
- Thủy phân
- Thủy phân
- Thủy phân
Lyase
- Endopolygalacturonate lyases
- Exopolygalacturonate lyase
- Oligogalacturonate lyase
- Endopolymethylgalacturonate
lyase

4.2.2.2
4.2.2.9
4.2.2.6
4.2.2.10

- Pectin acid
- Pectin acid
- Digalacturonates
không no
- Pectin

- Oligogalacturates không no
- Digalacturonates không no
- Monogalacturonate không no
- Methyloligogalacturonates


Hình 1.3. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases
Pectin acetylesterase thủy phân pectin bằng cách loại bỏ nhóm acetyl
khỏi nhóm hydroxyl C-2 và C-3 của đơn vị galacturonate. Searle-van
Leeuwen, Vincken và cs 1996 lần đầu phát hiện pectin acetylesterase ở
Aspergillus niger [38]. Shevchik và Hugouvieux-Cotte-Pattat (1997) tìm thấy
hai pectin acetylesterase khác ở Erwinia chrysanthemi 3937 [39]. Tuy nhiên,
các nghiên cứu về pectin acetylesterase còn rất hạn chế.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

12
Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) và exopolygalacturonase (EC
3.2.1.67) thủy phân liên kết glycosid bên trong polygalacturonate (hình 1.4).
Sản phẩm phản ứng là một loạt polygalacturonate cỡ trung bình (đối với
endopolygalacturonate) hoặc galacturonate (với exopolygalacturonate). Hoạt
tính của hai enzyme này có thể được đo bằng cách xác định mức độ hình
thành nhóm khử với 3,5-dinitrosalycylate [7].

endopolygalacturonase
2
Polygalacturonates+nH O oligogalacturonates galacturonate 

   
exopolygalacturonase
2
n n 1
Polygalacturonate + nH O polygalactoronate galacturonate

 

Exopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.9) được phát hiện chỉ ở một vài
loài vi khuẩn Clostridium multifermentans [24], [25]; Erwinia aroideae [31],
[32]; Erwinia disolvens [8]. Cơ chất ưa thích không phải polymethylgalacturonate
mà là polygalacturonate. Sản phẩm tạo thành thường là Δ4:5 digalacturonate
không no. Độ pH tối ưu của các enzyme này trong khoảng 8,0 – 9,5. Hoạt tính
của exopolygalacturonate lyase có thể được xác định giống với cách tiến hành
đối với endopolygalacturonate lyase. Phản ứng xúc tác bởi enzyme
exopolygalacturonate lyase như trong hình 1.5.

Exopolygalacturonate lyase
Polygalacturonate 4 : 5 galacturonates kh«ng noHình 1.5. Sự phân giải polygalacturonate bởi exopolygalacturonate lyase
Endomethylgalacturonate lyase (EC 4.2.2.10) phân giải pectin ở
dạng bất kỳ thành sản phẩm cuối cùng tetramethylgalacturonate. Phản ứng
xúc tác bởi Endomethylgalacturonate lyase như sau:
Endomethylpolygalacturonate lyase
Polymethylgalacturonate Methyloligogalacturonate kh«ng no

Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định bằng phương pháp
đường khử [42], [7], hoặc đo quang phổ phát hiện các liên kết nối đôi ở bước
sóng 232nm [25].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

14
1.6. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp
1.6.1. Ứng dụng pectinase trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây
Trái cây có thể được dùng để sản xuất nước ép thường hoặc nước ép cô


15
thành thực vật lai. Đây có thể là một công cụ hữu hiệu để làm tăng sự đa dạng
gen và tổ hợp các đặc điểm không có trong tự nhiên. Chính vì vậy mà việc sử
dụng enzyme pectinase thích ứng lạnh tác động loại bỏ thành tế bào thực vật
để tạo ra tế bào trần (protoplast) có ứng dụng quan trọng trong công nghệ sinh
học thực vật [30].
1.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng pectinase vào
việc xử lí vỏ cà phê để sản xuất thức ăn cho gia súc, ứng dụng lên men tạo
phân bón, sản xuất hương thơm tự nhiên.
Ứng dụng pectinase vào việc xử lí phế thải vì pectin là thành phần quan
trọng trong rác thải hữu cơ. Trên cơ sở lựa chọn 100.000 gen khác nhau của nấm
(Fungus) Aspergillus japonicus người ta đã tách được các enzyme phân giải pectin
pectinolytic enzyme) như Pectinase, Pectinesterase (Pectinmethylesterase 3.1.1.11).
Pectinase kiềm tổng hợp từ vi khuẩn Bacillus subtillis đã thay thế các
chất hóa học trong quá trình tẩy trắng giấy và bột giấy, giảm thiểu tác động
tiêu cực đến môi trường và cải thiện chất lượng giấy [4].
Ứng dụng pectinase và cellulase xử lý rễ của cây con Lotus
corniculatus phóng thích các tế bào trần của đầu rễ lông hút để thu nhận tế
bào trần, dùng trong sinh học phân tử. Xử lý rễ của cây con Lotus
corniculatus với cellulase và pectinase phóng thích các tế bào trần của đầu rễ
lông hút khi ủ trong môi trường có enzym khoảng 1 phút. 10% của tế bào trần
phân chia để tạo ra một tập đoàn tế bào mà sau đó tạo được chồi non. Cây tái
tạo có kiểu hình và tế bào bình thường.
1.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về enzyme pectinase ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau như các nghiên cứu ứng dụng các enzym
pectinase vào công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.