ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
 HOÀNG THỊ KHÁNH HỒNG BIỂU HIỆN VÀ TIẾT ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP
Ở BACILLUS SUBTILIS Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. LÊ THỊ THÚY ÁI
THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH – 2012

Luận văn Thạc sĩ Sinh học
MỤC LỤC

2.1.3. Hóa chất 30
2.1.4. Môi trường 33
2.1.5. Vật liệu sinh học 34
2.2. PHƯƠNG PHÁP 37
2.2.1. Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto 37
2.2.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng phân hủy fibrin người 38
2.2.3. Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis 38
2.2.4. Thu nhận gen aprE bằng phản ứng PCR 39
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại gen aprE 40
2.2.6. Thu nhận plasmid bằng phương pháp SDS kiềm 40
2.2.7. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein
Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+) 41
2.2.8. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein
Nattokinase trong hệ thống vector pAX01 43
2.2.9. Tạo dòng tế bào E. coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein
Nattokinase trong hệ thống vector pBG01 46
2.2.10. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5và hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế
bào khả nạp E. coli DH5 48
2.2.11. Tinh chế sản phẩm cắt qua cột 49
2.2.12. Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis và biến nạp vector tái tổ hợp vào
tế bào khả nạp B. subtilis 49

Luận văn Thạc sĩ Sinh học
2.2.13. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pAX01 chứa
gen aprE 50
2.2.14. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa
gen aprE 52

3.4.1. Sát nhập casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pxyl vào bộ gen các
chủng Bacillus subtilis 75
3.4.2. Dòng hóa casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pgrac vào bộ gen các
chủng Bacillus subtilis DB104 78
3.5. KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP NATTOKINASE
80
3.5.1. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE dưới sự kiểm soát của Pxyl 80
3.5.2. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE trong hệ thống pBG01 83
3.6. KIỂM TRA HOẠT TÍNH ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 85
3.6.1. Kiểm tra hoạt tính sơ bộ 85
3.6.2. Xác định hoạt độ phân hủy fibrin 86
CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN 88
4.2. ĐỀ NGHỊ 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO 89
PHỤ LỤC 93
Luận văn Thạc sĩ Sinh học - i -

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
Amp
APC
bp
dH
2
O
dNTP
DNA

Kilobaze
kilo Dalton
Luria – Bertani
Linsmaier - Skoog
Multicloning site
Neomycin
Optical Density
Plasminogen Activator Inhibitor 1

pBluescript II KS (+)
Polymerase chain reaction
RiboNuclease
Shine - Dalgarno
Kháng sinh ampicillin
Protein hoạt hóa C
Cặp baze
Nước cất
Các loại axít nucleotid
Axít deoxyribonucleic Kháng sinh erythromycin
Vi sinh vật an toàn Trọng lượng kDa
Môi trường LB
Môi trường LS
Vị trí tạo dòng
Kháng sinh neomycin

S
ulphate

SDS-PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis
Streptokinase
Spectinomycin
Tris-EDTA
tissue Plasminogen Activator
Tris-Acetic acid- EDTA
urokinase Plasminogen Activator

5-bromo-4 chloro-3 indolyl-beta-D-
glactoside
Dung dịch SDS
Điện di SDS-PAGE

Thuốc chống đông máu
Kháng sinh spectinomycin
Dung dịch TE
Chất hoạt hóa plasminogen mô
Dung dịch đệm chạy điện di TAE
Chất hoạt hóa plasminogen
urokinase

Luận văn Thạc sĩ Sinh học - iii -



- iv -

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Cơ chê hình thành huyết khối 5
Hình 1.2. Sự hoạt hóa và tác động lẫn nhau của các yếu tố đông máu 7
Hình 1.3. Cơ chế phân hủy fibrin in-vivo 9
Hình 1.4. Sản phẩm Natto 13
Hình 1.5. Cơ chế phân giải fibrin in-vivo bởi Nattokinase 14
Hình 1.6. Sơ đồ vector sát nhập chứa promoter xylA được sử dụng trong luận văn 23
Hình 1.7. Sự sát nhập pAX01 vào DNA Bacillus subtilis nhờ trao đổi đồng dạng tại
locus lacA . 24
Hình 1.8. Sơ đồ vector biểu hiện pBG01 được sử dụng trong luận văn 26
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBluescript II KS (+) 35
Hình 2.2. Thang chuẩn DNA 1kb và protein 37
Hình 2.3. Chương trình PCR thu nhận gen aprE 40
Hình 3.1. Sản phẩm Natto dùng phân lập được thử nghiệm hoạt tính sơ bộ 57
Hình 3.2. Các dạng khuẩn lạc Bacillus phân lập được từ sản phẩm Natto . 58
Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm nhanh hoạt tính phân hủy fibrin người ở các chủng
phân lập sau 6 giờ ủ 59
Hình 3.4. DNA bộ gen chủng Bacillus sp. phân lập từ sản phẩm Natto và sản phẩm
khuếch đại gen aprE trên gel agarose 1% . 60
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5

có mang pB-aprE bằng phản ứng
PCR 62
Hình 3.6. Kết quả sàng lọc 12 dòng tế bào E. coli DH5


Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprE-
F/pMTL-R. 73
Hình 3.18. Plasmid tái tổ hợp pBG01-aprE cắt với HindIII 74
Hình 3.19. Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis 1012 khả nạp trên 2 đĩa môi trường
có bổ sung kháng sinh . 76
Hình 3.20. Kết quả kiểm tra chủng B. subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR
khuẩn lạc với mồi pAX01-F/aprE-R 77
Luận văn Thạc sĩ Sinh học - vi -

Hình 3.21. Kết quả kiểm tra chủng B. subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR với
bản mẫu là bộ gen, mồi pAX01-F/aprE-R. 78
Hình 3.22. Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis DB104 khả nạp trên đĩa môi trường
có bổ sung kháng sinh chloramphenicol. 79
Hình 3.23. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprE-
F/pMTL-R 79
Hình 3.24. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR với bản mẫu là các plasmid tái
tổ hợp, cặp mồi aprE-F/pMTL-R 80
Hình 3.25. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 5 ml dịch môi trường sau nuôi
cấy 81
Hình 3.26. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml dịch môi trường nuôi cấy
chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi Pxyl 82
Hình 3.27. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml môi trường nuôi cấy
chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi P
Sgrac
84
Hình 3.28. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp nội bào ở Bacillus subtilis DB104 ở trường
hợp kiểm soát bởi P Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 1 -

Ngày nay, tỉ lệ bệnh nghẽn mạch (như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não)
đang tăng cao ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam,
Philippin do xu hướng “âu hóa” trong các chế độ ăn uống. Nếu huyết tụ ở não sẽ làm cản
trở việc cung cấp oxy cho các mô não gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu
não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ. Nếu huyết khối ở tim gây ra các bệnh lý như: co thắt
động mạch vành, nhồi máu cơ tim… Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có
khoảng 17 triệu người chết vì bệnh tim mạch và dự báo rằng bệnh do nghẽn mạch (hay
huyết khối xơ vữa) sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào các năm tới đây. Huyết khối
xơ vữa đã thật sự trở thành mối đe dọa đối với sức khỏe con người.
Tại Nhật Bản, sản phẩm lên men truyền thống Natto đã rất được phổ biến và thu hút
nhiều sự chú ý. Nó được xem là một loại thức ăn giúp giảm thiểu sự nghẽn mạch máu vì
Natto chứa enzym phân hủy huyết khối “Nattokinase”, một nhân tố mang đến sự trường thọ
cho người Nhật. Nattokinase (còn gọi là Subtilisin natto) là một serine protease được chiết
tách từ sản phẩm lên men đậu tương với vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Enzym này có khả
năng làm tan đặc hiệu fibrin là một protein dạng sợi cấu trúc nên huyết khối. Hơn nữa,
Nattokinase còn hỗ trợ tăng cường sản sinh ra Plasmin (enzym do cơ thể sản sinh làm tan
huyết khối bám chặt nội mạc). Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan huyết tụ
thông thường khác như Urokinase, Streptokinase, và tissue Plasminogen Activator (t-PA).
Tuy nhiên, Urokinase và Streptokinase có tính đặc hiệu thấp với fibrin, chỉ hiệu quả khi
dùng đường tiêm tĩnh mạch và thường không hiệu quả khi động mạch của bệnh nhân đột
quỵ và đau tim đã chai cứng ở nhiều vị trí. t-PA thể hiện hoạt tính phân hủy fibrin mạnh

 Thu nhận gen mã hóa Nattokinase từ các chủng phân lập bằng phương pháp PCR
 Dòng hóa gen mã hóa Nattokinase cùng trình tự tiết tự nhiên vào các hệ thống vector
khác nhau ở Escherichia coli
 Biến nạp vector tái tổ hợp trên vào chủng Bacillus subtilis DB104.
 Điện di phân tích sự biểu hiện ngoại bào của Nattokinase tái tổ hợp. Luận văn Thạc sĩ Sinh học Chương 2

VẬT LIỆU
PHƯƠNG PHÁP Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 29 -
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Dụng cụ
Một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm Vi sinh như sau: que cấy, que trải, đèn
cồn, eppendorf, bộ pipetman (0,5-10l, 10-100l, 20-100l, 100-1000l), đầu típ các loại,

2.1.3. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong luận văn bao gồm:
a) Hóa chất dùng cho tách chiết DNA vi khuẩn
- Lysis buffer: 0,1M NaCl, 0,05M EDTA, pH 8,0
- Dung dịch SDS 10%,
- Lysozym 20mg/ml, Proteinase K 20mg/ml
- Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0
- Chloroform, Sodium acetat 3M
- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20
o
C), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0
b) Hóa chất dùng cho tách chiết plasmid từ vi khuẩn
- Dung dich I: glucose 50mM, Tris-HCl 25mM pH 8,0, EDTA 10mM pH 8,0
- Dung dịch II (pha trước khi dùng): SDS 10%, NaOH 5N
- Dung dịch III: glacical acetic acid 0,2M, CH
3
COOK 0,2M pH 4,8
- RNase 10mg/ml
- Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0
- Chloroform, Sodium acetat 3M
- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20
o
C), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20
o
C)
- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0
c) Hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Dung dịch điện di 5X: Tris-HCl 15,1g, glycine 94g, SDS 5g, nước cất đủ 1000ml,
pH 8,3
- Dung dịch nạp mẫu 5X: Tris-HCl 0,3M, SDS 10,28%, glycerol 36%, DTT 0,6M,
bromophenol blue 0,012%, pH 6,8
- Dung dịch nhuộm gel: coomassie brilliant blue 0,625g, ethanol tuyệt đối 112,5ml,
glacical acetic acid 25ml, nước cất đủ 250ml
- Dung dịch giải nhuộm: glacical acetic acid 100ml, ethanol tuyệt đối 100ml, nước
cất đủ 1000ml
f) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt hạn chế
- Enzym: BamHI, SacII, HindIII, EcoRV, EcoRI, XbaI
- Buffer Blue 10X, Green 10X, Red 10X
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 32 -
g) Hóa chất dùng cho tinh chế phản ứng PCR và phản ứng cắt
- Chloroform, Sodium acetat 3M
- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20
o
C), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20
o
C)
h) Hóa chất dùng cho phản ứng nối
- Enzym T4 DNA ligase
- Buffer ligation 10X
- ATPase, PEG
i) Hóa chất dùng trong cảm ứng biểu hiện gen
- Xylose 25%, IPTG 100mM
- Dung dịch TE, Tris 1M
- Enzym lysozym

- Thành phần môi trường lỏng như sau: 1,0% trypton, 0,5% cao nấm men, 0,5%
NaCl
- Môi trường LB thạch: bổ sung 2% agar trong LB lỏng
- Môi trường LB-Amp: bổ sung kháng sinh ampicillin trong môi trường LB để có
nồng độ cuối là 100g/ml
- Môi trường LB-Spec: bổ sung kháng sinh spectinomycin trong môi trường LB để
có nồng độ cuối là 100g/ml
- Môi trường LB-Ery: bổ sung kháng sinh erythromycin trong môi trường LB để có
nồng độ cuối là 100g/ml, 1g/ml
- Môi trường LB-Neo: bổ sung kháng sinh neomycin trong môi trường LB để có
nồng độ cuối là 15g/ml
- Môi trường LB-Cm: bổ sung kháng sinh chloramphenicol trong môi trường LB để
có nồng độ cuối là 10g/ml
b) Môi trường thử hoạt tính tan fibrin
Thành phần môi trường: agarose 2% w/v, fibrinogen 0,6% w/v, đệm phosphate 50
mM, thrombin (10 NIH unit/ml).
c) Môi trường HS (môi trường làm tế bào khả nạp Bacillus subtilis)

Thành phần Thể tích sử dụng
MgSO
4
1M
10

l
10X-S-base, Mg
2+
10ml
Glucose 20% 2,5ml
L-tryptophan 0,1% 5ml

HPO4 14,0g, KH
2
PO4 6,0g,
Natrium citrate 1,0g
Cho nước vào đủ 100ml, đem hấp khử trùng ở 121
o
C, 15 phút. Sau đó bổ sung thêm
0,1ml MgSO
4
1M đã hấp khử trùng riêng.
d) Môi trường LS (môi trường dùng biến nạp tế bào Bacillus subtilis)

Thành phần Thể tích sử dụng
10X-S-base, Mg
2+
10ml
Glucose 20% 2,5ml
L-tryptophan 0,1% 0,5ml
Casein 2% 0,5ml
Cao nấm men 10% 1ml
MgCl
2
1M 0,25ml
CaCl
2
1M (cho sau cùng) 0,25ml
Nước cất vô trùng hai lần (ddH
2
O) 85ml
Tổng thể tích 100ml

- Plasmid pAX01 được sử dụng làm vector dòng hóa và vector biểu hiện gen mục
tiêu. Plasmid này có kích thước 7781bp chứa promoter xylA được cảm ứng bằng xylose.
Trên plasmid có đoạn trình tự lacA mang gen mã hóa cho enzym -galactosidase tương ứng
với vùng lacA trên bộ gen của Bacillus subtilis, mang gen kháng kháng sinh Amp
R
(chọn lọc
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBluescript II KS (+)
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 36 -
cho tế bào E. coli và erythromycin Ery
R
(chọn lọc cho B. subtilis). Sơ đồ đặc điểm của
plasmid pAX01 được trình bày ở Hình 1.6.
Plasmid pBG01 là vector biểu hiện protein dựa trên vector plasmid có khả năng tự
sao chép. Đặc điểm plasmid này được trình bày ở Hình 1.8.
c) Mồi
Các mồi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại gen, tạo dòng và giải trình tự
được thiết kế bởi Phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên –
Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh có trình tự như sau:

Tên mồi


Kiểm tra sự hiện diện
của gen aprE trên
pBluescript
T7
GTAATACGACTCACTATAGGGC

d) Thang chuẩn DNA và protein
- Thang 1 kb (Fermentas, Đức), Ladder, # SM0311/2/3
Bảng 2.3. Các cặp mồi được sử dụng trong luận văn
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học - 37 -
- Thang phân tử lượng protein (Low weigh molecular, LWM) (Amersham
Bioscience)

e) Các bộ kít
Bộ kít (EZ – 10 Spin Columm DNA gel Extration Kit của Bio Basis INC) dùng để
tinh chế DNA được thu nhận từ gel agarose, quy trình tinh sạch được thực hiện qua các
bước: làm tan gel, hấp thu DNA trên cột, rửa và dung ly để thu nhận DNA.
Trường hợp cần tinh chế sản phẩm PCR, hỗn hợp PCR sau phản ứng được bơm vào

lỗ, ủ trong 3 -18 giờ ở 37
o
C. Nhận diện sơ bộ hoạt tính theo diện tích vòng phân hủy fibrin
[40].
2.2.3. Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis
Các bước tiến hành như sau:
- Nuôi cấy qua đêm chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong 20ml môi trường LB, lắc
ở tốc độ 180 vòng/phút, 37
o
C.
- Cho dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống falcon loại 50ml (hoặc loại 15ml), ly tâm ở
5.000 vòng/phút trong thời gian 7 phút, nhiệt độ phòng.
- Thu và rửa tế bào bằng 10ml lysis buffer (0,1M NaCl, 0,05M EDTA, pH 8,0) và ly
tâm như ở trên. Sau đó, huyền phù lại bằng 2ml lysis buffer.
- Thêm 25l (hoặc 100l) lysozym nồng độ 20mg/ml, ủ trong thời gian 30 phút,
nhiệt độ 37
o
C.
- Thêm 200l SDS 10% và 10l proteinase K 20mg/ml, tiếp tục ủ ở 37
o
C trong 15
phút.

Trích đoạn Sàng lọc dòng tế bào E coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE Giải trình tự gen aprE, nhận định và tuyển chọn gen mã hóa thích hợp Hệ thống biểu hiện pAX01 Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE dưới sự kiểm soát của Pxyl Xác định hoạt độ phân hủy fibrin

---