Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

Biểu hiện và tiết Enzym Nattokinase tái tổ
hợp ở Bacillus subtilis
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG THỊ KHÁNH HỒNG

BIỂU HIỆN VÀ TIẾT ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP
Ở BACILLUS SUBTILIS

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. LÊ THỊ THÚY ÁI

THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH – 2012
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT i


Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

DANH MỤC CÁC BẢNG iii
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
MỞ ĐẦU 1

2.2.3. Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis 38


Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

2.2.4. Thu nhận gen aprE bằng phản ứng PCR 39
2.2.5. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại gen aprE 40
2.2.6. Thu nhận plasmid bằng phương pháp SDS kiềm 40
tái tổ hợp mang gen mã hóa cho proteinα2.2.7. Tạo dòng tế bào E. coli DH5
Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+) 41
tái tổ hợp mang gen mã hóa cho proteinα2.2.8. Tạo dòng tế bào E. coli DH5
Nattokinase trong hệ thống vector pAX01 43
tái tổ hợp mang gen mã hóa cho proteinα2.2.9. Tạo dòng tế bào E. coli DH5
Nattokinase trong hệ thống vector pBG01 46
và hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế α2.2.10. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5
48 αbào khả nạp E. coli DH5
2.2.11. Tinh chế sản phẩm cắt qua cột 49
2.2.12. Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis và biến nạp vector tái tổ hợp vào
tế bào khả nạp B. subtilis 49
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.2.13. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pAX01 chứa
gen aprE 50
2.2.14. Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa
gen aprE 52
2.2.15. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 53
2.2.16. Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 54
2.2.17. Phân tích protein biểu hiện bằng SDS-PAGE 54
2.2.18. Phương pháp xác định hoạt tính Nattokinase 55
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

chủng Bacillus subtilis DB104 78
3.5. KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP NATTOKINASE
80
3.5.1. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE dưới sự kiểm soát của Pxyl 80
3.5.2. Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE trong hệ thống pBG01 83
3.6. KIỂM TRA HOẠT TÍNH ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 85
3.6.1. Kiểm tra hoạt tính sơ bộ 85
3.6.2. Xác định hoạt độ phân hủy fibrin 86
CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN 88
4.2. ĐỀ NGHỊ 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO 89
PHỤ LỤC 93


Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

-iDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
Amp
APC
bp
dH
2
O
dNTP
DNA
EDTA
EGTA

Kilobaze
kilo Dalton
Luria – Bertani
Linsmaier - Skoog
Multicloning site
Neomycin
Optical Density
Plasminogen Activator Inhibitor 1
pBluescript II KS (+)
Polymerase chain reaction
RiboNuclease
Shine - Dalgarno
Kháng sinh ampicillin
Protein hoạt hóa C
Cặp baze
Nước cất
Các loại axít nucleotid
Axít deoxyribonucleic

Kháng sinh erythromycin
Vi sinh vật an toàn

Trọng lượng kDa
Môi trường LB
Môi trường LS


Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

Vị trí tạo dòng


Electrophoresis
Streptokinase
Spectinomycin
Tris-EDTA
tissue Plasminogen Activator
Tris-Acetic acid- EDTA
urokinase Plasminogen Activator
5-bromo-4 chloro-3 indolyl-beta-Dglactoside
Dung dịch SDS
Điện di SDS-PAGE
Thuốc chống đông máu
Kháng sinh spectinomycin
Dung dịch TE
Chất hoạt hóa plasminogen mô
Dung dịch đệm chạy điện di TAE
Chất hoạt hóa plasminogen
urokinase
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

- iii DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các yếu tố đông máu 6
Bảng 2.1. Thành phần môi trường HS 33
Bảng 2.2. Thành phần môi trường LS 34
Bảng 2.3. Các trình tự mồi được sử dụng trong luận văn 36
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR 39
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt plasmid pB bằng EcoRV 42
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối pB và aprE 43



Hình 2.2. Thang chuẩn DNA 1kb và protein 37
Hình 2.3. Chương trình PCR thu nhận gen aprE 40
Hình 3.1. Sản phẩm Natto dùng phân lập được thử nghiệm hoạt tính sơ bộ 57
Hình 3.2. Các dạng khuẩn lạc Bacillus phân lập được từ sản phẩm Natto . 58
Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm nhanh hoạt tính phân hủy fibrin người ở các chủng
phân lập sau 6 giờ ủ 59
Hình 3.4. DNA bộ gen chủng Bacillus sp. phân lập từ sản phẩm Natto và sản phẩm
khuếch đại gen aprE trên gel agarose 1% . 60
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dòng tế bào E. coli DH5
α
có mang pB-aprE bằng phản ứng
PCR 62
Hình 3.6. Kết quả sàng lọc 12 dòng tế bào E. coli DH5
α
có mang pB-aprE tương
ứng bằng phản ứng PCR, bản mẫu là các plasmid . 63
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

-vHình 3.7. Kết quả đại diện chọn dòng tế bào E. coli DH5
α
có mang pB- aprE bằng
enzym cắt hạn chế BamHI 64
Hình 3.8. Trình tự peptide trưởng thành gồm 275 amino acid ở Nattokinase 65
Hình 3.9. So sánh một phần trình tự nucleotide gen aprE của chủng phân lập với trình
tự
chuẩn 66
Hình 3.10. Trình tự codon mã hóa gen aprE khuyết cytosine tại vị trí 437 66
Hình 3.11a. Trình tự gen aprE của chủng B2 cho thấy có sự khác biệt 9 nucleotide so
với

trường
có bổ sung kháng sinh chloramphenicol. 79
Hình 3.23. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi aprEF/pMTL-R 79
Hình 3.24. Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR với bản mẫu là các plasmid
tái
tổ hợp, cặp mồi aprE-F/pMTL-R 80
Hình 3.25. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 5 ml dịch môi trường sau


Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

nuôi
cấy 81
Hình 3.26. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml dịch môi trường nuôi
cấy
chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi Pxyl 82
Hình 3.27. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml môi trường nuôi cấy
chủng B. subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi P
Sgrac
84
Hình 3.28. Phân tích Nattokinase tái tổ hợp nội bào ở Bacillus subtilis DB104 ở
trường
hợp kiểm soát bởi P
Sgrac
85
Hình 3.29. Kết quả thử khả năng phân giải fibrin của dịch ngoại bào ở chủng B.
subtilis
DB104 mang pBG01-aprE được cảm ứng IPTG sau 2 giờ ủ 86

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

trường thọ
cho người Nhật. Nattokinase (còn gọi là Subtilisin natto) là một serine protease được
chiết
tách từ sản phẩm lên men đậu tương với vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Enzym này
có khả
năng làm tan đặc hiệu fibrin là một protein dạng sợi cấu trúc nên huyết khối. Hơn
nữa,
Nattokinase còn hỗ trợ tăng cường sản sinh ra Plasmin (enzym do cơ thể sản sinh làm
tan
huyết khối bám chặt nội mạc). Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan
huyết tụ
thông thường khác như Urokinase, Streptokinase, và tissue Plasminogen Activator (tPA).
Tuy nhiên, Urokinase và Streptokinase có tính đặc hiệu thấp với fibrin, chỉ hiệu quả
khi
dùng đường tiêm tĩnh mạch và thường không hiệu quả khi động mạch của bệnh nhân
đột
quỵ và đau tim đã chai cứng ở nhiều vị trí. t-PA thể hiện hoạt tính phân hủy fibrin
mạnh
nhưng t-PA có giá thành khá cao và thời gian bán phân hủy ngắn trong cơ thể.
Nattokinase
có hoạt tính phân hủy huyết tụ cao gấp 4 lần Plasmin, thực nghiệm cho thấy
Nattokinase
phân cắt plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) dẫn tới việc loại bỏ hiệu quả
cấu
trúc huyết khối trong cơ thể. Nattokinase đã được chứng minh có hiệu quả trong điều
trị lâm
sàng và không gây phản ứng phụ.
Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Nattokinase tốt từ các chủng Bacillus natto và xây dựng hệ thống tái tổ hợp là tiếp cận
mở ra
triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm
nguyên
liệu cho dược phẩm, thực phẩm chức năng.
Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi thực hiện các nội dung như sau:
Phân lập chủng Bacillus subtilis natto từ 4 mẫu sản phẩm Natto có nguồn gốc từ
Nhật•
Bản
Thu nhận gen mã hóa Nattokinase từ các chủng phân lập bằng phương pháp PCR•
Dòng hóa gen mã hóa Nattokinase cùng trình tự tiết tự nhiên vào các hệ thống
vector•
khác nhau ở Escherichia coli


Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

Biến nạp vector tái tổ hợp trên vào chủng Bacillus subtilis DB104.•
Điện di phân tích sự biểu hiện ngoại bào của Nattokinase tái tổ hợp.•

Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Chương 2
VẬT LIỆU
PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

- 29 2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Dụng cụ

- Tủ mát 4
o
C (Nhật ), Tủ lạnh -20
o
C (Nhật )
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

- 30 2.1.3. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong luận văn bao gồm:
a) Hóa chất dùng cho tách chiết DNA vi khuẩn
- Lysis buffer: 0,1M NaCl, 0,05M EDTA, pH 8,0
- Dung dịch SDS 10%,
- Lysozym 20mg/ml, Proteinase K 20mg/ml
- Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0
- Chloroform, Sodium acetat 3M
- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20
o
C), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20
o


Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

C)
- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0
b) Hóa chất dùng cho tách chiết plasmid từ vi khuẩn
- Dung dich I: glucose 50mM, Tris-HCl 25mM pH 8,0, EDTA 10mM pH 8,0
- Dung dịch II (pha trước khi dùng): SDS 10%, NaOH 5N
- Dung dịch III: glacical acetic acid 0,2M, CH
3


500 mM trong 1 lít).
- Dung dịch nạp mẫu DNA 6X (orange G 0,2%, xylene cyanol 0,05%,
bromophenol blue 0,09%, glycerol 60% và EDTA 60mM).
e) Hóa chất dùng cho điện di SDS-PAGE
- Dung dịch tạo gel polyacrylamide 12,5%: gel polyacrylamide 100x100x0,75mm
nồng độ 12,5% polyacrylamide có thành phần như sau:
+ Gel phân tích 12% (4 gel): nước cất 4,46ml, Tris-HCl 1,5M (pH 8,8) 3,95ml,
lµl SDS 10%, 79µ30% Acrylamide/Bisacrylamide 0,8% 7,1ml, 157,5
l TEMEDµammonium persulfate 10%, 7,9
+ Gel gom 4% (4 gel): nước cất 3,5ml, Tris-HCl 0,5M (pH 6,8) 1,625ml, 30%
l ammoniumµl SDS 10%, 15µAcrylamide/Bisacrylamide 0,8% 2,264 ml, 75
l TEMEDµpersulfate 10%, 5
- Dung dịch điện di 5X: Tris-HCl 15,1g, glycine 94g, SDS 5g, nước cất đủ 1000ml,
pH 8,3
- Dung dịch nạp mẫu 5X: Tris-HCl 0,3M, SDS 10,28%, glycerol 36%, DTT 0,6M,
bromophenol blue 0,012%, pH 6,8
- Dung dịch nhuộm gel: coomassie brilliant blue 0,625g, ethanol tuyệt đối 112,5ml,
glacical acetic acid 25ml, nước cất đủ 250ml
- Dung dịch giải nhuộm: glacical acetic acid 100ml, ethanol tuyệt đối 100ml, nước
cất đủ 1000ml
f) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt hạn chế
- Enzym: BamHI, SacII, HindIII, EcoRV, EcoRI, XbaI
- Buffer Blue 10X, Green 10X, Red 10X
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

- 32 g) Hóa chất dùng cho tinh chế phản ứng PCR và phản ứng cắt
- Chloroform, Sodium acetat 3M
- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20
o

2
0.1M và Glycerol 15% vô trùng (giữ ở 4
o
C)
l) Hóa chất cho xác định hoạt tính Nattokinase
- Tris-HCl 1M (pH 7,8)
- Fibrin heo 0.12%
- TCA 0,1M
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

- 33 2.1.4. Môi trường


Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

a) Môi trường LB (Luria – Bertani)
- Thành phần môi trường lỏng như sau: 1,0% trypton, 0,5% cao nấm men, 0,5%
NaCl
- Môi trường LB thạch: bổ sung 2% agar trong LB lỏng
- Môi trường LB-Amp: bổ sung kháng sinh ampicillin trong môi trường LB để có
g/mlµnồng độ cuối là 100
- Môi trường LB-Spec: bổ sung kháng sinh spectinomycin trong môi trường LB để
g/mlµcó nồng độ cuối là 100
- Môi trường LB-Ery: bổ sung kháng sinh erythromycin trong môi trường LB để có
g/mlµg/ml, 1µnồng độ cuối là 100
- Môi trường LB-Neo: bổ sung kháng sinh neomycin trong môi trường LB để có
g/mlµnồng độ cuối là 15
- Môi trường LB-Cm: bổ sung kháng sinh chloramphenicol trong môi trường LB để
g/mlµcó nồng độ cuối là 10
b) Môi trường thử hoạt tính tan fibrin

- 34 Cao nấm men 10% 5ml
Arginin 8% + Histidin 0,4% 10ml
Nước cất vô trùng hai lần (ddH
2
O) 66,5ml
Tổng thể tích 100ml
Hấp khử trùng từng thành phần ở 121
o
C, 15 phút, riêng L-tryptophan và hỗn hợp
Arginin + Histidin lọc khử trùng, không hấp.
Thành phần 10X-S-base, Mg•
2+
: (NH4)
2
SO4 2,0g, K
2
HPO4 14,0g, KH
2
PO4 6,0g,
Natrium citrate 1,0g
Cho nước vào đủ 100ml, đem hấp khử trùng ở 121
o
C, 15 phút. Sau đó bổ sung thêm
0,1ml MgSO
4
1M đã hấp khử trùng riêng.


Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ


+ Bacillus subtilis DB104 [his, nprR2, nprE18, aprED3](Bacillus Gentics
Stock Centre at Ohio) được dùng làm tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp
bằng các vector pAX01 và pBG01.


Ketnooi.com diễn đàn chia sẻ kiến thức, công nghệ

b) Plasmid
- Plasmid pBluescript II KS (+) được sử dụng làm vector dòng hóa, mang gen
kháng kháng sinh Amp
R
-β, gen lacZ mã hóa cho 146 acid amin đầu N của enzym
galactosidase, vùng MCS được chèn vào giữa gen lacZ, cho phép dòng hóa gen mục
tiêu vào
vector pBluescript II KS (+) (Hình 2.1).

- Plasmid pAX01 được sử dụng làm vector dòng hóa và vector biểu hiện gen mục
tiêu. Plasmid này có kích thước 7781bp chứa promoter xylA được cảm ứng bằng
xylose.
-galactosidase tương ứngβTrên plasmid có đoạn trình tự lacA mang gen mã hóa cho
enzym
với vùng lacA trên bộ gen của Bacillus subtilis, mang gen kháng kháng sinh Amp
R
(chọn lọc
Hình 2.1. Sơ đồ vector pBluescript II KS (+)
Vật liệu và phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

- 36 cho tế bào E. coli và erythromycin Ery
R