ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA SINH HỌC
-----o0o----BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN
NĂM 2015

Tên đề tài:

Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của
endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp trong
nấm men Pichia Pastoris

Cán bộ cố vấn khoa học:

GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc

Chủ nhiệm đề tài:

Ngô Thị Thuỳ Dung

Thừa Thiên Huế, 12 /2015

[Đề tài khoa học]

Page 1


LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ,
giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác. Trong suốt thời gian từ

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Số hiệu hình, bảng
Hình 1.1

Tên hình, bảng
Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong
phức hệ cellulase

Trang
04

Hình 1.2

Trình tự amino acid tương ứng với cấu
trúc bậc 2 của Cel12A từ một số chủng
vi sinh vật [55].

06

Hình 1.3

Cấu trúc không gian từ trên xuống (A)
và từ bên sang (B)
của Cel12A từ H. Grisea [67]

07

Hình 1.4

Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất

Đường chuẩn glucose

30

Hình 3.1

Các khuẩn lạc dùng để chọn lọc

33

Hình 3.2

Ảnh hưởng của nồng độ methanol đến
khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase của P.pastoris tái tổ hợp

34

Hình 3.3

Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến
khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase của P.pastoris tái tổ hợp

35

Hình 3.4

Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến
khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase của P.pastoris tái tổ hợp

36

OD

optical density (mật độ quang)

PCR

polymerase chain reaction (khuếch đại DNA)

RE

restriction endonuclease (enzyme cắt hạn chế)

TAE

đệm Tris - acetate - EDTA

TE

đệm Tris - EDTA

[Đề tài khoa học]

Page 4


YPD

môi trường yeast extract - peptone - dextrose

YPDS


YP

yeast extract - peptone

YPG

môi trường yeast extract - peptone – glycerol

[Đề tài khoa học]

Page 5


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β-1,4glycoside trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tương tự
khác. Cellulose được chia thành ba dạng sau: dạng một là endoglucanase hoặc 1,4-β-Dglucan-4-glucanohydrolase hoặc carboxylmethylcellulase (endo-β-1,4-glucanase, EC
3.2.1.4, viết tắt là EG hoặc CMCase); dạng hai là exoglucanase bao gồm 1,4-β-D-glucan
glucanohydrolase (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) ;
dạng ba là glucosidase hoặc D-glucoside glucohydrolase, (EC 3.2.1.21). Endoglucanase
thủy phân liên kết ở bên trong phân tử cellulose. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở
đầu khử và đầu không khử cellulose. β-glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và
cellobiose thành glucose. Hệ enzyme cellulase được phát hiện ở nhiều sinh vật khác nhau
như ở thực vật, động vật, côn trùng, nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong đó, cellulase ở
nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn là phổ biến nhất. Nhiều loài thuộc các chi Trichoderma,
Aspergillus,

Penicillium,


enzyme này. Tuy nhiên kết quả sơ bộ cho thấy hiệu suất tổng hợp endo β-1,4-glucanase
tái tổ hợp không cao hơn so với hiệu suất sản xuất từ Trichoderma asperellum). Vì vậy
một trong những giải pháp để tăng hiệu suất là cải thiện hiệu suất biểu hiện bằng cách tối
ưu hóa điều kiện biểu hiện. Xuất phát từ ý nghĩa trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp trong
nấm men Pichia Pastoris ”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Cải thiện mức độ biểu hiện của endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp trong nấm men
Pichia Pastoris như tối ưu hóa nhiệt độ cảm ứng và hàm lượng chất cảm ứng.
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Enzyme endo-β-1,4-glucanase tái tổ hợp từ chủng Pichia Pastoris.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
Nội dung: Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của endo β-1,4-glucanase tái tổ
hợp trong nấm men Pichia Pastoris .
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường
đại học Khoa học, Đại học Huế. Thời gian: Từ 1/2015-12/2015

[Đề tài khoa học]

Page 7


4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
4.1. Ý nghĩa khoa học
Cải thiện mức độ biểu hiện ngoại bào của endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp trong
nấm men Pichia Pastoris .
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Enzyme endo β-1,4-glucanase tiết ra môi trường ngoại bào mạnh có khả năng

khoảng 34 kDa và 62 kDa [77], chủng A. oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa [41],
chủng Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa [57], chủng A. terreus M11 khoảng 25 kDa
[30].

1.1. Cấu trúc bậc một
Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc
khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trước hết ở sự đa dạng về khối lượngphân tử, thành
phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide. Chủng A. oryzae
KBN616 có khả năng sinh tổng hợp hai loại endoglucanase là Cel A và Cel B. Phân tử
protein Cel A gồm 239 amino acid, trọng lượng phân tử 31 kDa, được xếp vào họ
cellulase H. Trong khi đó, Cel B được xếp vào họ cellulase C với chiều dài 416 amino
acid và khối lượngphân tử 53 kDa [43]. Phân tử endoglucanase từ A. aculeatus bao gồm
410 amino acid với khối lượngphân tử khoảng 43,7 kDa [59]. Các endoglucanase từ
chủng A. niger Z10 có khối lượngphân tử 83 kDa và 50 kDa [25], từ A. terreus là 25 kDa
[29], từ Trichoderma reesei là 48 kDa và 55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp. D04 có khối
lượng 35 kDa [56].
Sandgren và cs (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc Cel12A thuộc
họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt Humicola grisea. Cel12A của H. grisea
là một chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid (Hình 1.2) [55].

[Đề tài khoa học]

Page 10


Hình 1.2. Trình tự amino acid tương ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số
chủng vi sinh vật [55].

[Đề tài khoa học]


Gốc cysteine 216 nằm trên chuỗi A4 ở phiến A, phiến này làm tăng bề mặt xúc tác của
enzyme. Gốc cysteine này có chuỗi bên trong vùng lõi bên dưới điểm hoạt động, nơi
tương tác với chuỗi bên của 5 gốc W48, V87, W89, F214 và F219 có kích thước từ 3,3
đến 4,8 Å (Hình 1.4C).

Hình 1.4. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. Grisea

1.3. Cơ chế xúc tác
Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các
loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Tuy nhiên, để thủy phân cellulose thành
glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng
enzyme trong phức hệ cellulase sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo
những cách khác nhau. Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4β-glucan của sợi cellulose để tạo nên các phần tử nhỏ hơn (sợi cellobiose). Sau đó các sợi
này sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải phóng ra
glucose [45] (Hình 1.5).

[Đề tài khoa học]

Page 13


Hình 1.5. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của cellulose [45].

Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase cùng các enzyme khác như exo-β-1,4-glucozidase
(cellobiase) sẽ tham gia thủy phân cellulose theo cơ chế ban đầu endo-β-1,4-glucanase
tác động vào vùng vô định hình trên phân tử cellulose và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau
đó, exo-β-1,4-glucosidase sẽ cắt từng đoạn cellobiose. Kết quả tạo ra các cello
oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và glucose. Các cellobiase sẽ thủy phân tiếp tạo
thành glucose (Hình 1.1).
2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE

vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp.
2.1.1 Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là một trong ba dạng enzyme của
hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong phân tử
cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác để giải phóng ra
cellulosedextrin, cellobiose và glucose.
[Đề tài khoa học]

Page 15


Dựa trên đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase được gọi là endoglucanase hoặc
1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4). Endo-β-1,4-glucanase
thuộc vào dạng 1 của phức hệ celulase. Dạng 2 là exoglucanase, gồm 1,4-β-D-glucan-4glucanohydrolase (giống như cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan
cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là β- glucosidase hoặc βglucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong
phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase
thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra
glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase) [45].
2.1.2. Phân loại theo đặc điểm phân tử
Endo-β-1,4-glucanase được phân chia dựa vào đặc điểm phân tử như khối lượng
phân tử, điểm đẳng điện và cấu trúc tinh thể. Dựa theo đặc tính và trình tự amino acid
chứa gốc nitơ tự do, nhóm enzyme thủy phân cellulose được chia làm 3 nhóm là Cel-1,
Cel-2 và Cel-3.
Trong đó Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lượng là 62
kDa và 34 kDa. Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do là
QQVGTTADAH và QELAQYDSAS. Trình tự amino acid của Cel-1 giống với endo-β1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có độ tương đồng 72% với
cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I. Trình tự amino acid của Cel-3 có độ
tương đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase. Khối
lượng phân tử của Cel-1 và Cel-3 giống với CelB và CelA. Cel-2 là β-glucosidase (EC
3.2.1.21) có khối lượng phân tử là 120 kDa và trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do

Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt độ giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở
nhiệt độ thấp dưới 0°C hoạt độ của enzyme giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa
về nhiệt độ thích hợp. Endo-β-1,4-glucanase gồm Cel 1 và Cel 3 từ chủng A. oryzae hoạt
động mạnh nhất ở nhiệt độ lần lượtlà 50 oC và 60oC [27]. Endo-β- 1,4-glucanase gồm Cel
A và Cel B từ chủng A. oryzae KBN616 có hoạt tính mạnh nhất ở nhiệt độ lần lượtlà
55oC và 45oC[41]. Endoglucanse III từ Trichoderma reesei có hoạt tính tối đa đạt 55oC
[56], nhiệt độ tối ưu của β-glucosidase từ chủng Trichoderma reesei QM 9414 và chủng
Trametes hirsuta là 50oC [57].

[Đề tài khoa học]

Page 17


3.2 Ảnh hưởng của pH
Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trường, những biến đổi dù nhỏ trong
nồng độ của các ion H+ và OH- cũng ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng của enzyme.
Tùy thuộc vào bản chất của các enzyme mà pH thích hợp có thể là trung tính, kiềm hoặc
là acid. Endo-β-1,4-glucanase do các loài khác nhau có pH tối ưu khác nhau. Theo những
nghiên cứu trước đây, pH thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng A. niger NRRL363 hoạt động mạnh nhất là 5,5 [8]. Endo-β-1,4-glucanase của Chủng Trametes hirsuta là
5,0 và chủng A. oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lượt là 3,5 và 4,5 [27]. CMCase của A.
niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH 4,5 và 7,5
[22].
3.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại
Các ion kim loại làm biến đổi vận tốc phản ứng của enzyme, chúng có thể kích
thích hoặc ức chế hoạt động của enzyme. Một số ion kim loại có khả năng liên kết phối
trí với các nguyên tử oxy hoặc nguyên tử nitơ của nhóm cacboxyl, amine hoặc peptide
của các enzyme, làm cho trung tâm hoạt động của enzyme có độ bền rất lớn; đồng thời
các ion kim loại này tạo ra một dạng thuận lợi cho enzyme hoặc làm cho enzyme kết gắn
được với cơ chất. Do đó tốc độ thủy phân của enzyme được tăng lên. Các ion kim loại

4. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp
chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình
sinh trưởng và phát triển của mình. Khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng
sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trường như: nhiệt độ
nuôi cấy, pH môi trường, nguồn carbon, nguồn nitrogen.
Nguồn carbon: Các loài vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase có thể sử dụng
nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có loài chỉ thích hợp
với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài thì không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả
năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau. Nguồn carbon có thể đơn giản như các loại
đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như glucan, tinh bột, cellulose.
Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cho thấy, nguồn carbon thích hợp
cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ
[Đề tài khoa học]

Page 19


bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn carbon thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh
tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và
saccharose, chủng CD5-12 là lactose [5]; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc
mùn cưa. Nguồn carbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ưu ấm là vỏ lạc hoặc rơm
[12].
Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên, đặc biệt là các phế
phụ phẩm nông nghiệp. Theo Acharya và cs (2008), nguồn carbon thích hợp nhất cho các
chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase là mùn cưa [18]. Còn theo kết quả nghiên
cứu của Ojumu và cs (2003), chủng A. flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh
tổng hợp cellulase khi sử dụng mùn cưa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó

cs (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp
cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50oC [9]. Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus có khả năng
sinh tổng hợpcellulase tối ưu ở nhiệt độ 58 oC [13]. Trong khi đó, các chủng nấm mốc N1
và N2 có nhiệt độ sinh tổng hợp cellulase tối ưu là 31 và 34 oC [8]. Acharya và cs (2008)
cho rằng, các chủng A. niger tổng hợp cellulase mạnh nhất khi lên men trong điều kiện
28oC, pH 4,0-4,5 [18].
pH môi trường nuôi cấy ban đầu: pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng
đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài,
từng chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng
vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trường ban
đầu là 8,0 [5]; còn chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH môi trường ban
đầu là 6,7 [13]. Đối với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở
môi trường có pH ban đầu là 4,5 và 5,5 [8]; các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase
mạnh nhất trong khoảng pH môi trường ban đầu từ 6,0-7,0 [19].
Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loại
enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như: thời gian
nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lượng giống được tiếp vào ban đầu.

[Đề tài khoa học]

Page 21


5. ỨNG DỤNG
Với khả năng thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1,4-glucanase được ứng
dụng rộng rãi vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau như công nghiệp sản xuất giấy và
bột giấy, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, công
nghiệp chế biến dung môi hữu cơ, hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi
sinh.
5.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và
glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượng
diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia. Trong dịch lên men có chứa
một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia [14].
Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất bằng
phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao. Để tiến hành nâng
cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng. Đó là quá trình sử dụng
phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly
trích dịch quả. Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các
chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích
ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46%.

5.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc và
phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipit, chất dinh dưỡng cung cấp năng lượng chủ
yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate. Trong đó, các polysaccharide gồm
cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4-glucoside. Các chất này làm tăng độ
nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thụ các chất dinh dưỡng. Các chất này có
trong vách tế bào thực vật, ngăn trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dưỡng
như protein, tinh bột và lipit có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất
dinh dưỡng này. Bổ sung β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả năng
hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.

[Đề tài khoa học]

Page 23


Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose
như rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi

được sản xuất dùng cho bột giặt như: endoglucanase và exoglucanase từ Thermomyces
lanuginous [51].

6. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN NẤM MEN
6.1. Hệ thống vật chủ Pichia pastoris
Trong những năm 1970, công ty Philip Petroleum đã phát triển các phương pháp
và môi trường nuôi cấy cho sinh trưởng mật độ cao (