BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR
VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR
VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ
bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Thầy không chỉ truyền thụ
cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm
túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực
hiện luận án là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau
này.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. BS.
Nguyễn Phi Hùng, Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K.
Thầy đã luôn hướng dẫn, động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong
những lúc tôi gặp khó khăn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Tạ Văn Tờ, TS. Vương Diệu Linh và các
đồng nghiệp thuộc Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen,
Viện Công Nghệ Sinh học đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời
gian qua.
Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho bố mẹ, bạn bè đã luôn tin tưởng,
thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong thời gian qua, giúp
tôi hoàn thành tốt luận án này.
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Ngọc Quang


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1


2.3.1. Tách chiết DNA tổng số và xác định nồng độ DNA...................................... 43
2.3.2. Xử lý bisulfite với DNA tổng số.................................................................... 44
2.3.3. Phương pháp PCR......................................................................................... 44
2.3.4. Phương pháp điện di...................................................................................... 47
2.3.5. Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR.................................................... 47
2.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch......................................................... 48
2.3.7. Phương pháp tạo trình tự DNA methyl bằng enzyme M.sssI.........................49
2.3.8. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học............................................................ 50
2.4. Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................................. 50
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ.................................................................................... 51
3.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu....................................................................... 51
3.2. Đột biến và biểu hiện gen EGFR...................................................................... 52
3.2.1 Đột biến gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân.....................52
3.2.2. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân.............56
3.3. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của
phổi................................................................................................................. 59
3.3.1. Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân................59
3.3.2. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân..............61
3.3.3. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân..............63
3.3.4. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân......................65
3.3.5. Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân...........66
3.4. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa một
số gen liên quan đến ung thư tuyến của phổi.................................................. 68
3.4.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR....................68
3.4.2.

Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa

các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A................................................ 71

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên đầy đủ

A260

Độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm

AAH

Atipical Adenomatous Hyperplasias (Tế bào phân chia quá mức
không điển hình)

ABL

Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 gene

ACS

American Cancer Society (Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ)

AIS

Adenocarcinoma in situ (Ung thư tại chỗ)

ALK

Anaplastic Lymphoma Kinase gene



Checkpoint With Forkhead And Ring Finger Domains

CK5/6

Cytokeratin 5/6 protein

CK7

Cytokeratin 7 protein

COBRA

Combined Bisulfite Restriction Analysis (Phân tích kết hợp
Bisulfite và cắt giới hạn)

cs.

Cộng sự

DAB

3, 3 –diaminobenzidine

DAPK

Death‐associated protein kinase

DNA


Formalin fixed paraffin embedded

FISH

Fluorescence In Situ Hybridization (Lai tại chỗ huỳnh quang)

GTP

Guanosine triphosphate

GDP

Guanosine diphosphate

GSTP1

Glutathione S-transferase Pi 1 gene

H&E

Hematoxylin & Eosin

HDACs

Histone deacetylase

HRM

High Resolution Melting (Độ phân giải cao nhiệt độ nóng chảy)


MIA

Minimally Invasive Adenocarcinoma

MGMT

O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene

MLH1

MutL homolog 1 gene

MsssI

CpG methyltransferase

MS-PCR

Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl)


MYC

Myelocytomatosis genes

NGS

Next Generation Sequencing (Giải trình tự thế hệ mới)

NSCLC


RET

Rearranged during transfection

ROS1

c-ros oncogene 1gene

SAM

S-adenosylmethionine

SCLC

Small cell lung cancer (Ung thư phổi tế bào nhỏ)

SDC4

Syndecan 4 gene

SLC34A2

Solute Carrier Family 34 Member 2 gene

SNP

Single Nucleotide Polymorphism (Sự đa hình nucleotide)

SSCP

World Heath Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

WNT

Wingless genes

YAP

Yes-associated protein


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1

Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên
thế giới

5

Hình 1.2

Số ca mắc ung thư mới tại Việt Nam năm 2018

5

Hình 1.3

Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi

7


Hình 1.9

Các vị trí methyl hóa trên gen EGFR

22

Hình 1.10

Cấu trúc gen BRCA1ở người

22

Hình 1.11

Chức năng ức chế khối u của BRCA1

23

Hình 1.12

Cấu trúc gen MLH1

24

Hình 1.13

Các phức hợp sửa chữa DNA của MLH1

24


Hình 1.19

Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen

35

Hình 1.20

Lịch sử phát hiện các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA

36

Hình 2.1

Phương pháp xử lý bisulfite

44

Hình 2.2

Phương pháp RT-PCR Scorpion Arms

48

Hình 2.3

Phương pháp hóa mô miễn dịch

49

65

Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen RASSF1A

Hình 4.1

63

Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl
hóa MLH1

Hình 3.7

61

67

Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và sự biểu hiện
EGFR

81


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1

Kit và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

40


Bảng 3.3

Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân

54

Bảng 3.4

Tương quan giữa đột biến EGFR và tình trạng hút thuốc ở bệnh
nhân nam giới

55

Bảng 3.5

Mức độ biểu hiện protein EGFR

57

Bảng 3.6

Tương quan giữa mức độ biểu hiện protein EGFR với đặc điểm
bệnh nhân

58

Bảng 3.7

Tương quan giữa methyl hóa EGFR với đặc điểm bệnh nhân

EGFR

69

Bảng 3.13

Tỷ lệ đột biến, biểu hiện protein ở bệnh nhân methyl hóa EGFR

70

Bảng 3.14

Tương quan giữa đột biến và methyl hóa với biểu hiện EGFR

70


Bảng 3.15

Bảng 3.16

Bảng 3.17

Tương quan giữa đột biến EGFR với sự methyl hóa các gen
BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A

72

Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với sự methyl hóa các
gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A

sự biểu hiện của gen EGFR cũng góp phần quan trọng trong việc đưa ra những tiên
lượng tiến triển của bệnh cũng như định hướng liều lượng thuốc cho bệnh nhân.
Mặt khác, biểu hiện gen EGFR lại được điều khiển bởi mức độ methyl hóa vùng
promoter của gen này. Cùng với EGFR, methyl hóa các gen ức chế khối u cũng
được xem là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành và phát triển của ung thư. Methyl
hóa các gen ức chế khối u như: BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A…. đã được phát
hiện trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thư phổi.
Thêm vào đó, tình trạng methyl hóa một số gen ức chế khối u dẫn đến tiên lượng
xấu cho bệnh nhân và được xem là marker điển hình trong ung thư phổi. Đồng thời,

1


sự kết hợp thuốc điều trị nhắm đích TKIs với chất loại bỏ nhóm methyl đã mang lại
hiệu quả ban đầu cao hơn so với việc chỉ sử dụng TKIs trên những dòng tế bào ung
thư phổi điển hình.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gen EGFR trên bệnh nhân
ung thư phổi. Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu tổng thể về những biến đổi
phân tử của gen EGFR và sự ảnh hưởng của hiện tượng methyl hóa các gen ức chế
khối u BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A lên những biến đổi này. Ở Việt Nam hiện
nay, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột biến gen EGFR để đưa ra
phác đồ điều trị bằng TKIs. Vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột
biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên
quan trên bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến ở phổi” với mục tiêu:
1. Phân tích tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR trên bệnh nhân
ung thư biểu mô tuyển ở phổi.
2. Đánh giá được tình trạng methyl hóa một số gen bao gồm: EGFR, BRCA1,
MGMT, MLH1, RASSF1A và sự tương quan về methyl hóa giữa các gen này với đột
biến và biểu hiện protein EGFR.
Nội dung nghiên cứu

và BRCA1 với sự biểu hiện protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến
ở phổi.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Ung thƣ phổi
1.1.1. Thực trạng ung thư phổi
Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới. Theo thống kê của
Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2018 có đến 1,8 triệu người chết do ung thư phổi
trong tổng số 9,6 triệu người chết do ung thư (Hình 1.1) [35]. Đây vẫn ung thư phổ
biến nhất ở nam giới trên toàn cầu (chiếm 14,5% tổng số). Tỷ lệ mắc cao nhất là ở
Trung Âu và Đông Âu (53,3/100 000 người) và Đông Á (50,4/100 000 người). Tỷ lệ
mắc thấp nhất là ở Trung Phi và Tây Phi (2,0 và 1,7/100 000 người). Ở phụ nữ, ung
thư phổi đứng thứ ba sau ung thư vú và ung thư đại trực tràng (chiếm 8,4% tổng số).
Tỷ lệ mắc ung thư phổi ở phụ nữ thấp hơn ở nam giới và có sự khác nhau
ở các vùng địa lý khác nhau, chủ yếu phản ánh lịch sử tiếp xúc khác nhau với thuốc
lá. Do đó, tỷ lệ mắc cao nhất là ở Bắc Mỹ (33,8/100 000 người) và Bắc Âu
(23,7/100 000 người), tỷ lệ mắc tương đối cao ở khu vực Đông Á (19,2/100 000
người) và thấp nhất ở Tây Phi và Trung Phi (1,1 và 0,8/100 000 người) [35]. Hiệp
hội ung thư của Hoa Kỳ (American Cancer Society) ước tính trong năm 2017, đã có
thêm 225 500 trường hợp mới mắc ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca ung thư
được phát hiện. Chỉ có 19% trường hợp bị phát hiện ung thư phổi có thể sống thêm
quá 5 năm. Cũng theo thống kê của Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ, năm 2015 có đến
155 800 người chết do căn bệnh này, chiếm 25% số trường hợp tử vong do ung thư
[102]. Số trường hợp tử vong do ung thư phổi lớn hơn tổng số trường hợp tử vong
do ba loại ung thư phổ biến khác ở Hoa Kỳ bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, ung thư
vú và ung thư đại tràng cộng lại [102].
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới 2018, ở Việt Nam, mỗi năm có

(NSCLC – Non-Small Cell Lung Cancer) và ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC –
Small Cell Lung Cancer) (Hình 1.3) [72].
1.1.2.1. Ung thư phổi không tế bào nhỏ
Ung thư phổi không tế bào nhỏ được chia thành các nhóm nhỏ hơn, trong đó
ba phân nhóm chính là ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung
thư biểu mô tế bào lớn [57].
Ung thư biểu mô tuyến (AD - Adenocarcinoma) chiếm khoảng 40% trường
hợp mắc ung thư phổi và thường bắt nguồn từ mô phổi ngoại vi [57]. Ung thư biểu
mô tuyến xảy ra phổ biến ở nữ giới và những người không hút thuốc [135]. Đây
cũng là loại ung thư phổi có thời gian sống kéo dài hơn những nhóm khác [112].
Ung thư biểu mô tế bào vảy (SCC – Squamous Cell Cancer) chiếm khoảng
25 – 30% số trường hợp ung thư phổi. Chúng thường bắt đầu xuất hiện ở tế bào vẩy,
là những tế bào phẳng nằm bên trong đường hô hấp của phổi. Ung thư biểu mô tế
bào vẩy có xu hướng được tìm thấy ở phần trung tâm của phổi, gần một đường hô
hấp chính (phế quản), thường gặp ở nam giới và có liên quan mật thiết với tiền sử
hút thuốc lá nhiều hơn so với hầu hết các loại ung thư phổi khác [65].
Ung thư biểu mô tế bào lớn (LCC – Large Cell Cancer) chiếm khoảng 10 –
15% số trường hợp mắc ung thư phổi. Sở dĩ tên gọi như vậy vì tế bào ung thư có
kích thước rất lớn, với sự dư thừa tế bào chất, nhân tế bào lớn và hạch nhân dễ thấy
[84]. Ung thư biểu mô tế bào lớn có thể xuất hiện ở bất kỳ phần nào của phổi. Nó có
xu hướng phát triển và lan truyền nhanh chóng, điều này có thể làm cho việc điều trị
trở nên khó khăn hơn. Một phân nhóm của ung thư biểu mô tế bào lớn, được gọi là
ung thư biểu mô tế bào thần kinh lớn, là một loại ung thư phát triển nhanh, rất giống
với ung thư phổi tế bào nhỏ [84].
6


Ngoài ra ung thư phổi không tế bào nhỏ còn có thêm một số phân típ khác
hiếm gặp như là carcinoid và thần kinh nội tiết [84].


sau 5 năm là 82%, sau 10 năm là 74%. Trong khi tỷ lệ này ở nhóm bệnh nhân T2N0
giảm xuống lần lượt là 68% và 60% [84].
Giai đoạn II được chia ra làm IIA và IIB. IIA mô tả ung thư xâm lấn dưới
dạng khối u có kích thước nhỏ hơn 5 cm, di căn hạch cạnh phế quản cùng bên
và/hoặc hạch cạnh rốn phổi, bao gồm cả xâm lấn trực tiếp vào hạch, chưa có di căn
xa. IIB mô tả ung thư xâm lấn dưới dạng khối u có kích thước có thể lớn hơn 5cm
và nhỏ hơn 7 cm, có di căn hạch cạnh phế quản cùng bên và/hoặc hạch cạnh rốn
phổi; hoặc khối u có kích thước lớn hơn 7 cm, hoặc có xâm lấn trực tiếp vào thành
ngực, cơ hoành, thần kinh hoành, màng phổi trung thất, hoặc lá thành màng tim [3].
Thời gian sống sau 5 năm của bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn II là 42%. Đặc
điểm của mô bênh học của khối u cũng có ảnh hưởng đến thời gian sống thêm.
Bệnh nhân thuộc nhóm T1 ung thư biểu mô tế bào vẩy có 75% sống sau 5 năm,
nhưng con số này chỉ là 25% ở bệnh nhân T2 ung thư biểu mô tuyến [84].
Giai đoạn III tương ứng với ung thư có di căn hạch lympho, các hạch này tập
trung thành cụm hoặc gắn lên các cấu trúc khác. Giai đoạn III được chia ra làm IIIA
và IIIB. Giai đoạn III mô tả ung thư xâm lấn chưa có di căn xa, khối u nguyên phát
có kích thước có thể lên đến 7 cm, hoặc xâm lấn vào lá tạng màng phổi, có liên
quan đến phế quản, hoặc xâm lấn vào thành ngực, cơ hoành, lá thành màng tim;
hoặc khối u có kích thước bất kỳ đã xâm nhiễm vào trung thất, lan vào tim, mạch
máu lớn, khí quản, thực quản, thân đốt sống, hoặc đã có tràn dịch màng phổi ác tính.
Giai đoạn IIIA và IIIB khác nhau ở tình trạng di căn hạch của khối u, trong đó

8


IIIB có di căn hạch trung thất đối bên, hạch rốn phổi đối bên, di căn hạch cơ bậc
thang cùng bên hoặc đối bên, hoặc hạch thượng đòn. Ngược lại, IIIA được mô tả
hoặc không có di căn hạch, hoặc hạch cạnh phế quản cùng bên và/hoặc hạch cạnh
rốn phổi, hoặc di căn hạch trung thất cùng bên và/hoặc hạch dưới carina [3]. Thời
gian sống trung bình của bệnh nhân nhóm IIIA là 12 tháng và chỉ có 9 – 15% trường

thương tiền ung thư được gọi là tế bào ung thư tân sản (Neuoplasia) sau đó phát
triển thành các tế bào ung thư phân chia quá mức không điển hình (Atipical
Adenomatous Hyperplasias - AAH), AAH được coi là hình ảnh mô học đầu tiên
trong quá trình hình thành khối u ác tính (Hình 1.4) [41]. AAH mang những biến
đổi di tuyền và di truyền ngoại gen tương tự với những biến đổi được tìm thấy trong
ung thư tuyến của phổi kể cả đột biến KRAS, EGFR, TP53, mất đoạn dị hợp tử tại
cánh dài nhiễm sắc thể số 9 và cánh ngắn nhiễm sắc thể số 16, và biến đổi đi truyền
ngoại gen WNT [59]. Từ các AAH sẽ tiếp tục hình thành ung thư biểu mô tuyến tại
chỗ (AIS – Adenocarcinoma in situ) hay còn được gọi là ung thư biểu mô tiểu phế
nang (BAC – Bronchioloalveolar Carcinoma); lần đầu tiên tiến tới giai đoạn tiền
ung thư trước khi được gọi là ung thư biểu mô tiểu phế nang (BAC). Đây được coi
là giai đoạn không xâm lấn của những tế bào ung thư tuyến tân sản nhưng chúng thể
hiện sự tăng kích thước và hình thái tế bào không điển hình. Giai đoạn tiếp theo của
ung thư là sự hình thành xâm lấn tối thiểu (MIA – Minimally Invasive
Adenocarcinoma), được định nghĩa là một ung thư biểu mô tuyến nhỏ (kích thước
nhỏ hơn 3 cm) với thành phần chủ yếu là tổn thương lepidic và xâm lấn nhỏ hơn
5mm tại một vị trí. Sau đó khối u chuyển sang quá trình xâm lấn (Invasive
Carcinoma) mặc dù các yếu tố không xâm lấn có thể tồn tại ở các cạnh của các khối
u [59].
Di căn là giai đoạn cuối cùng trong quá trình phát triển của khối u. Ung thư
biểu mô phổi có thể di căn theo hệ bạch huyết cũng như mạch máu. Sự di căn theo
con đường mạch máu thường thấy ở các khối u ở giai đoạn thấp, thường dẫn đến
tăng tỷ lệ tái phát cũng như rút ngắn thời gian sống sót của bệnh nhân. Trong khi di
căn qua đường bạch huyết thường mất nhiều thời gian hơn cho sự hình thành khối u
di căn, di căn qua đường bạch huyết sẽ hình thành những khối u di căn xa [39]. Ung
thư biểu mô phổi có một số địa điểm ưu tiên cho di căn như: Não, xương và tuyến
thượng thận. Các cơ quan khác có di căn thường ở giai đoạn cuối của bệnh. Đối với
các loại ung thư phổi khác nhau có sự ưu tiên hình thành khối u di căn không giống
nhau, chẳng hạn như di căn gan trong ung thư biểu mô phổi tế bào nhỏ và di căn
não trong ung thư tuyến mô [39].