ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--

TRẦN THỊ THÚY NGA

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP
Ở NẤM MEN Pichia pastoris X33

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--

TRẦN THỊ THÚY NGA

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP
Ở NẤM MEN Pichia pastoris X33

Chuyên ngành Di truyền học
Mã số 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐINH NHO THÁI

Hà Nội - 2017

1.1.1. Ung thư và tình hình ung thư trên thế giới ........................................................ 3
1.1.2. Các con đường cơ bản hình thành ung thư ........................................................ 4
1.1.3. Nghiên cứu điều trị ung thư hiện nay ............................................................... 10
1.2. P53 và các nghiên cứu biểu hiện p53 ứng dụng điều trị ung thư............................... 12

1.2.1. Tổng quát về TP53 và protein tương ứng ........................................................ 12
1.2.2. Trình tự nhận biết đặc hiệu của p53 trên các gen mục tiêu ........................... 15
1.2.3. Những nghiên cứu về biểu hiện protien p53 tái tổ hợp .................................. 17
1.3. Hệ thống nấm men Pichia pastoris biểu hiện protein ngo ại lai................................. 19
1.3.1. Đặc điểm của hệ thống biểu hiện P. pastoris .................................................. 19
1.3.2. Vector pPICZα biểu hiện protein ở P. pastoris............................................... 20
1.3.3. Quá trình chuyển gen vào nấm men P. pastoris ............................................. 21
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 23
2.1. Vật liệu và hóa chất ......................................................................................................... 23

2.1.1. Vật liệu ................................................................................................................. 23
2.1.2. Hóa chất................................................................................................................ 23
2.1.3. Các đoạn oligonucleotide................................................................................... 23
2.1.4. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ......................................................................... 24
2.1.5. Các môi trường nuôi cấy .................................................................................... 25
2.1.6. Các dung dịch và đệm ........................................................................................ 25
2.2. Phương pháp nghiên c ứu ................................................................................................ 26
2.2.1. Tách chiết vector biểu hiện từ chủng E. coli DH5α ....................................... 26


2.2.2. Xử lý vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn................................................. 27
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose ........................................................................... 28
2.2.4. Tinh sạch DNA gel agarose ............................................................................... 29
2.2.5. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện ............. 29
2.2.6. Tách chiết DNA tổng số của nấm men ............................................................ 30

Hình 1.4. Tích hợp gen ngoại lai vào vị trí 5’AOX1 ở hệ gen của P. pastoris. ................ 22
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR chọn lọc thể tái tổ hợp….……………………38
Hình 3.2. Kết quả xử lý plasmid tái tổ hợp với enzyme SacI .............................................. 39
Hình 3.3. Kết quả biến nạp DNA tái tổ hợp vào P. pastoris X33 ....................................... 40
Hình 3.4. Kết quả điện di DNA tổng số của nấm men ......................................................... 41
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi EcoRI-Fw/XhoI-Rv ..................... 42
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AOX1-Fw/AOX1-Rv .................. 43
Hình 3.7. Kết quả sinh trưởng của các dòng biểu hiện sau 72 giờ ...................................... 44
Hình 3.8. Kết quả điện di protein tổng số từ các dòng biến nạp ......................................... 45
Hình 3.9. Kết quả sinh trưởng của chủng X33-36 trong các môi trường biểu hiện .......... 46
Hình 3.10. Kết quả điện di protein tổng số từ các môi trường biểu hiện ........................... 47
Hình 3.11. Kết quả sinh trưởng của chủng X33-36 ở các nồng độ methanol .................... 48
Hình 3.12. Kết quả điện di protein từ dịch nuôi cảm ứng với các nồng độ methanol ...... 49
Hình 3.13. Kết quả điện di không biến tính protein p53 tái tổ hợp..................................... 54
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch p53 tái tổ hợp từ dịch ngoại bào ............. 50
Hình 3.15. Đường chuẩn Bradford .......................................................................................... 51


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự của các đoạn oligonucleotide .................................................................. 24
Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy ............................................................ 25
Bảng 2.3. Thành phần các loại dung dịch và đệm................................................................. 26
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn .......................................................... 28
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng PCR.............................................................................. 31
Bảng 2.6. Thành phần gel polyacrylamide 12% .................................................................... 33
Bảng 2.7. Thành phần gel polyacrylamide cho thí nghiệm EMSA..................................... 35
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng EMSA ................................................................................. 35
Bảng 2.9. Thành phần của phản ứng Bradford ...................................................................... 37
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ DNA tổng số tách được ....................................................... 41


Ethidium bromide

IARC

International Agency for Research on Cancer

Kb

Kilo base

LB

Luria Bertani

MM

Minimal medium

MutS

Methanol utilization slow

Mut+

Methanol utilization plus

NLS

Nuclear Localization Signals


Tris base-Axit Boric-EDTA

WHO

World Health Organization

YP

Yeast extract-Peptone medium

YPM

Yeast extract-Peptone-Methanol medium

YPDM

Yeast extract-Peptone-Dextrose-Methanol medium


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

MỞ ĐẦU

Trải qua vài thập kỉ tới nay, ung thư đã trở thành một dạng bệnh lý phổ biến và là
một trong những nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong cao ở người. Theo ước tính
thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thì mỗi năm trên thế giới có khoảng 9-10
triệu người mới mắc bệnh ung thư với tỉ lệ tử vong lên đến hơn 50%.
Cũng theo WHO, Việt Nam đang xếp ở vị trí 78/172 quốc gia và vùng lãnh thổ
được khảo sát về ung thư với tỉ lệ tử vong lên đến 110/100.000 người. Qua mỗi năm, số

Đề tài nghiên cứu này được thực hiện với các nội dung sau:
 Tạo chủng Pichia pastoris X33 chứa cấu trúc TAT-p53-His đã dung hợp vào hệ
gen của chúng.
 Nghiên cứu các điều kiện biểu hiện tốt nhất protein p53 tái tổ hợp ở chủng nấm
men Pichia pastoris X33.
 Tinh sạch và định lượng protein p53 tái tổ hợp từ dịch nuôi nấm men Pichia
pastoris X33.
 Kiểm tra hoạt tính của protein p53 tái tổ hợp bằng phương pháp EMSA.

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

2


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về ung thư hiện đại

1.1.1. Ung thư và tình hình ung thư trên thế giới
Thuật ngữ “ung thư” ngày nay được sử dụng để chỉ một nhóm bệnh phát sinh do
sự biến đổi của các gen đặc thù, có thể tạo ra một tập hợp các tế bào phân chia một cách
không kiểm soát (khối u) phát triển từ một mô hay từ một tế bào bình thường. Khối u ác
tính khi phát triển xâm lấn sẽ tiếp cận với mạch máu, từ đó có thể di chuyển và phát triển
tại các mô ở xa, gây rối loạn chức năng của các mô khác và dẫn đến tử vong [19, 41].
Những con số thống kê cụ thể chứng minh “Ung thư là một trong những nguyên
nhân chính gây ra tử vong ở người” vào những năm gần đây đã được Cơ quan nghiên
cứu Ung thư Quốc tế (IARC) báo cáo vào năm 2013. Cụ thể, đã có khoảng 14 triệu
trường hợp mới mắc ung thư và 8,2 triệu trường hợp tử vong do ung thư vào năm 2012,

giải pháp cần thiết để thúc đẩy chính sách về ung thư [18, 43].
Việt Nam đang phải đối mặt với nhiều khó khăn về chữa trị bệnh với số lượng
người mắc ung thư ngày một tăng. Theo thống kê của Đại học Y Hà Nội, năm 2005, số
ca tử vong do ung thư là 45.413 người; năm 2006, con số này là 48.306 người, trong đó
phổ biến nhất là ung thư gan, sau đó đến ung thư phổi và ung thư dạ dày [34]. Tuy nhiên,
các phương thức điều trị ung thư hiện nay còn tốn kém, hầu hết dựa vào phương pháp
truyền thống là hóa trị, xạ trị và phẫu thuật. Các phương pháp này gây đau đớn kéo dài
cho người bệnh, và chỉ kéo dài tuổi thọ được trong thời gian ngắn hoặc khả năng tái phát
cao do không thể tiêu diệt triệt để tế bào ung thư. Điều này đòi hỏi cần phải có giải pháp
điều trị mới, tăng hiệu quả chữa trị bệnh và giảm thiểu kinh phí.

1.1.2. Các con đường cơ bản hình thành ung thư
1.1.2.1. Cơ sở di truyền học phân tử hình thành ung thư
Gen ung thư là dạng alen đặc biệt của các gen bình thường xuất hiện do đột biến,
làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư. Các gen ung thư phát
sinh từ tế bào mầm sinh dục sẽ có mặt trong hầu hết các tế bào của cơ thể và truyền lại

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

4


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

cho thế hệ sau, ngược lại, nếu từ tế bào soma sẽ không được truyền cho thế hệ sau. Gen
ung thư được xuất phát từ hai nhóm gen là gen tiền ung thư và gen ức chế khối u [19].
Gen tiền ung thư có chức năng điều khiển quá trình sinh trưởng và biệt hóa trong
tế bào. Các đột biến chuyển gen tiền ung thư thành gen ung thư (oncogene) gây nên rối
loạn chuyển hóa ở tế bào và tạo ra ung thư. Protein được mã hóa bởi gen ung thư thường
có mức biểu hiện chức năng tăng lên so với protein được mã hóa bởi gen tiền ung thư.

chỉ có một điểm đứt gãy duy nhất, còn trên NST số 22 có một cụm các điểm đứt gãy đặc
thù [19, 22, 41]. Các gen ung thư là các gen trội về khả năng phát sinh khối u bởi chỉ một
đột biến duy nhất có thể chuyển một gen tiền ung thư thành gen ung thư. Đột biến hoạt
hóa các gen này luôn tạo ra ưu thế tăng sinh tế bào mặc dù vẫn tồn tại bản sao của các
alen bình thường. Do kiểu hình mà các gen ung thư quy định không bị át chế bởi sự có
mặt của bản sao kiểu dại còn lại, nên có thể coi các gen ung thư là các gen trội [28, 47].
Các gen ức chế khối u bình thường điều khiển các quá trình cơ bản nhằm duy trì sự
cân bằng nội mô bao gồm: duy trì tính toàn vẹn của vật chất di truyền, các bước của chu
kỳ tế bào, sự biệt hóa tế bào, mối tương tác giữa các tế bào và quá trình apoptosis. Các đột
biến làm bất hoạt gen ức chế khối u, biến gen đó trở thành một gen ung thư, gây ra mất
cân bằng nội mô, từ đó dẫn đến sự phát sinh các khối u [19]. Sự bất hoạt một gen ức chế
khối u trải qua hai bước tách biệt nhau: đột biến thứ nhất làm bất hoạt một alen xảy ra ở tế
bào dòng sinh dục hoặc ở tế bào soma; đột biến thứ hai làm bất hoạt hoàn toàn gen ức chế
khối u luôn xảy ra ở tế bào soma và gây nên mất alen bình thường còn lại, từ đó phát triển
thành khối u. Hiện tượng mất tính dị hợp tử (Loss of Heterozygosity, LOH) phản ánh sự
mất đi của bản sao alen kiểu dại duy nhất còn lại của một gen ức chế khối u và có thể xuất
hiện theo các cơ chế khác nhau: mất toàn bộ NST; tái tổ hợp trong nguyên phân hoặc các
đột biến cục bộ. Kết quả là mất các gen ức chế khối u diễn ra nhanh hơn ở các tế bào ung
thư so với ở các tế bào tiền khối u [19, 28]. Theo cơ chế di truyền, các gen ức chế khối u
(dạng đột biến) thường là lặn trong khi các gen gây khối u là trội. Một gen trội như gen
gây khối u thường biểu hiện ngay kiểu hình trong khi hiệu quả kiểu hình của các gen ức
chế khối u đột biến thường bị hạn chế bởi hoạt động của alen bình thường và chỉ được
biểu hiện khi alen bình thường còn lại bị mất đi. Nhìn chung, nếu như các gen ức chế
khối u là lặn thì đột biến của một gen ức chế khối u lại là tính trạng trội. Như vậy, dù

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

6




7


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

xúc với tia cực tím trong ung thư da, khói thuốc lá trong ung thư phổi, chất aflatoxin
trong ung thư gan, hoặc axit aristolochic trong các bệnh ung thư ống mật thượng. TP53
đột biến có thể là dấu hiệu hữu ích trong các nghiên cứu dịch tễ học phân tử để điều tra
nguyên nhân khối u. Việc phát hiện ra các đột biến TP53 ở hội chứng Li-Fraumeni là
một cột mốc phát triển của lĩnh vực ung thư học: lần đầu tiên nguy cơ mắc ung thư có
thể dự đoán trên cơ sở phân tích di truyền [19]. Trong nhiều trường hợp, TP53 không bị
bất hoạt bởi đột biến mà bị bất hoạt bởi sự hoạt hóa của một gen gây khối u đối vận với
nó xuất hiện ở cấp độ sau dịch mã và được điều hòa bởi mối tương tác protein/protein
như: MDM2, protein gây khối u E6 [24, 28].
1.1.2.2. Con đường phát sinh ung thư
Con đường phát sinh ung thư phần lớn được cho là bắt nguồn từ một tế bào ban đầu
duy nhất. Khi một đột biến soma xuất hiện ở một tế bào đơn lẻ, đột biến đó sẽ được nhân
rộng nếu tế bào đột biến bắt đầu phân chia và hình thành nên các thế hệ gồm nhiều tế bào
con đều chứa alen đột biến. Các gen ung thư tạo ra ưu thế chọn lọc cho phép tế bào mang
gen phát triển lấn át các tế bào xung quanh và phá vỡ sự cân bằng nội mô. Nếu một gen
tạo ra một kiểu hình làm tăng tốc độ sản sinh của tế bào mới hoặc ngăn cản sự chết đi của
tế bào trưởng thành, thì các tế bào mang gen đó sẽ có số lượng vượt trội so với các tế bào
khác trong cùng khu vực cư trú của mô, dẫn đến hình thành khối u. Mặc dù các tế bào ung
thư trao đổi chất kém hiệu quả về mặt năng lượng và gây độc với môi trường, nhưng lại
phụ thuộc vào nguồn cung oxy ít hơn bởi chúng tăng cường hoạt động của con đường
đường phân, nhờ vậy có thể thích nghi được với điều kiện ổ sinh thái tế bào vốn không
phù hợp cho các tế bào bình thường. Khối u phát triển thành ung thư thực tế là sản phẩm
hiếm gặp của quá trình tiến hóa theo dòng của các tế bào gồm 2 bước cơ bản: sự phát sinh
đột biến soma và sự lan rộng của các dòng tế bào tới các ổ sinh thái tế bào. Các đột biến

B1… Các nhân tố môi trường có thể chuyển trực tiếp các gen bình thường thành các gen
ung thư thông qua phát sinh đột biến trên trình tự DNA hoặc thúc đẩy sự tăng sinh của
các tế bào đã tích lũy đột biến. Phần lớn các tác nhân gây ung thư có thể tạo ra một môi
trường cục bộ nhờ đáp ứng viêm để các đột biến có xu hướng dễ xảy ra, đồng thời là môi
trường thuận lợi cho các tế bào mang các gen ung thư phát triển mạnh [27, 28].

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

9


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

1.1.3. Nghiên cứu điều trị ung thư hiện nay
1.1.3.1. Điều trị ung thư bằng các phương pháp truyền thống
Điều trị ung thư tiến hóa và phát triển song song với kiến thức của loài người về
y học. Các phương pháp truyền thống áp dụng chữa trị ung thư từ trước đến nay được sử
dụng phổ biến là: phẫu thuật, hóa trị và xạ trị. Mục đích chính của phẫu thuật là cắt bỏ
các mô ung thư và có thể cùng với một số mô lành xung quanh để đảm bảo rằng tất cả
các tế bào ung thư được loại bỏ ra khỏi cơ thể một cách triệt để, chủ yếu áp dụng đối với
các khối u đặc. Phương pháp xạ trị thì sử dụng những hạt năng lượng cao hoặc các tia
X-quang, tia Gamma, chùm tia điện tử hoặc proton để phá hủy vật chất di truyền trong
các tế bào ung thư dẫn tới làm mất khả năng phát triển và lây lan của chúng. Suốt nhiều
thập kỷ qua, xạ trị được chứng minh giúp điều trị triệt để nhiều loại ung thư, song nó
cũng có hạn chế là gây tổn thương cả những mô bình thường xung quanh. Phương pháp
hóa trị liên quan đến việc sử dụng các thuốc chống ung thư, và giống như xạ trị, sẽ hủy
diệt các tế bào ung thư bằng cách làm tổn hại DNA của chúng. Hóa trị là một dạng điều
trị toàn thân tác động đến toàn bộ các tế bào đang phát triển nhanh, do đó gây ra các tác
dụng phụ như bị rụng tóc và tiêu chảy [27, 58].
Đôi khi các biện pháp phẫu thuật, xạ trị và hóa trị có thể được kết hợp để điều trị

thường. Liệu pháp điều trị đích sẽ tác động lên DNA, RNA hoặc protein sai hỏng để làm
giảm bớt hay loại bỏ những tác động tiêu cực gây nên cho tế bào, từ đó dẫn đến ức chế
hay loại bỏ các tế bào ung thư. Tuy nhiên, ung thư phát triển với nhiều dòng tế bào khác
nhau nên thông thường đối với mỗi loại ung thư sẽ có tương ứng một phương pháp điều
trị đích phù hợp. Ngoài ra, một phương pháp khác là liệu pháp gen nhằm thay thế gen
bệnh bằng một bản sao của gen khỏe mạnh làm cho các tế bào ung thư được kiểm soát
quá trình phân chia như các tế bào bình thường. Đây là một lựa chọn điều trị đầy hứa
hẹn nhưng vẫn tiềm tàng nguy hiểm và cần được nghiên cứu nhiều hơn [35, 47].

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

11


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

1.2. P53 và các nghiên cứu biểu hiện p53 ứng dụng điều trị ung thư
1.2.1. Tổng quát về TP53 và protein tương ứng
1.2.1.1. Cấu trúc gen TP53 và protein tương ứng
Gen mã hóa cho protein p53 là một gen ức chế khối u - TP53. Ở người, gen TP53
nằm ở cánh ngắn của NST số 17 (17p13.1), kích thước khoảng 20 kb. Gen bao gồm 11
exon trong đó exon đầu tiên là exon không mã hóa, theo sau là một intron lớn đầu tiên dài
khoảng 10 kb, vùng mã hóa nằm ở giữa exon thứ 2 cho đến giữa exon thứ 11 (Hình 1.1).

Hình 1.1. Cấu trúc gen TP53 và protein tương ứng
Chú thích: E1-E11: các vùng exon của gen TP53 và độ dài tương ứng; NLS: tín hiệu định vị nhân;
NES: tín hiệu rời nhân, N-terminal, C-terminal: đầu N và đầu C của protein p53.

Gen TP53 mã hóa cho sản phẩm tương ứng là protein p53 có nhiều chức năng sinh
học quan trọng trong cơ thể người. Tên gọi “p53” được bắt nguồn từ thí nghiệm điện di

bên Leu344 từ tất cả các monomer tiếp xúc trực tiếp với nhau. Phần đầu của vùng kích
hoạt trên bốn monomer có thể liên kết được với bốn phân tử MDM2. Bình thường trong
tế bào, cấu trúc tetramer của protein p53 bao gồm bốn monomer liên kết với phân tử
DNA đích và bốn phân tử MDM2 [11, 36, 39].

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

13


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử protein p53 [5]
Chú thích: (A) 2 dimer là 2 mặt phẳng hình chữ nhật đối mặt tạo thành tetramer p53 với 3 trạng thái
tương tác với DNA (màu cam): (i) chỉ 1 dimer (màu xanh hoặc màu đỏ) tương tác với DNA; (ii) các
cạnh ngắn hơn của 2 dimer tương tác dọc theo đường xoắn DNA; (iii) DNA nằm trên các cạnh của
2 dimer. (B và C) các góc chiếu của tetramer p53 tương ứng với mô hình (ii). Core: vùng lõi gắn đặc
hiệu với DNA. NT, CT: đầu N và đầu C không tương tác với DNA; Ctc: đầu C tương tác với DNA.

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

14


TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ

1.2.1.3. Chức năng sinh học của p53
Protein p53 do TP53 mã hóa đã được chứng minh có khả năng ức chế tín hiệu
tăng sinh tế bào, nâng cao hiệu quả của các chất ức chế tăng trưởng, làm cho tế bào bước
vào quá trình tự chết, ngăn chặn sự sao chép liên tục thông qua lão hóa, thúc đẩy ổn định

đầu. Các cấu trúc tinh thể của phức hợp p53DBD/DNA cho thấy rằng hai nucleotide WW
ở một nửa cấu trúc không được liên kết trực tiếp trong phức hợp với p53DBD. Tuy nhiên,
vị trí này được bảo toàn cao trong các trình tự nhận biết của p53 (p53REs) tự nhiên, với sự
ưu tiên liên kết chặt hơn đối với A-T và A-A, và hiệu quả liên kết hạn chế ở T-A. Hơn nữa,
sự thay đổi trong hai vị trí WW gây ra những thay đổi đáng kể trong hoạt động gắn kết, với
các chuỗi chứa A-T thì hoạt tính liên kết cao hơn đáng kể [9, 45, 53, 54]. Năm 2010, nhóm
nghiên cứu của Itai Beno và cộng sự đã chỉ ra rằng motif CWWG được tìm thấy ở trung tâm
của mỗi trình tự gắn đặc hiệu của p53, là một nhân tố chủ chốt trong các tương tác p53/DNA.
Các thí nghiệm EMSA trên gel điện di polyacrylamide cho phép quan sát trực tiếp các phức
hợp oligomer khác nhau được hình thành giữa p53DBD và các vị trí mục tiêu của nó. Nhóm
nghiên cứu đã chứng minh rằng p53DBD liên kết với các trình tự p53REs đặc biệt có chứa
motif CATG với sự hợp tác tương đối thấp ở cả hai dạng cấu trúc dimer và tetramer của
p53. Trong khi đó, p53DBD liên kết với các p53REs có trình tự chứa motif CAAG và CTAG
thì tính bám rất cao. Sự tương tác giữa p53DBD/DNA đã được chứng minh là phụ thuộc
vào trình tự nhận biết và hoạt động thông qua việc kết hợp các p53 tetramer. Chìa khóa cho
sự thay đổi khác nhau trong tương tác p53DBD/DNA là sự xoắn linh hoạt của mô hình
CWWG trung tâm trong các vị trí liên kết với p53 [30].
Tính gắn đặc hiệu của p53 đối với các trình tự liên kết cũng được nhiều nghiên
cứu chứng minh từ rất sớm trong điều kiện in vitro. Chẳng hạn, gen mdm2 là một trong
những mục tiêu kích hoạt phiên mã nhờ p53 [6, 7, 17, 46]. Để xác định mối liên kết giữa
p53 và mdm2, nhóm nghiên cứu của Arie Zauberman và cộng sự (1995) đã khảo sát cấu
trúc và chức năng của vùng tương ứng trên gen mdm2 (hmdm2) ở người. Kết quả cho
thấy, hmdm2 chứa 1 promoter intron (promoter nằm trong intron) phụ thuộc vào p53.
Promoter này được kích hoạt trong cơ thể với sự hiện diện của p53 tự nhiên, dẫn đến
việc sản xuất các mRNA. Promoter hmdm2 intron chứa hai vị trí nhận biết của p53 liên
tiếp. Khi xóa bỏ yếu tố nhận biết thì nhận thấy không có sự liên kết giữa p53 và promoter
intron. Do đó, hoạt động promoter tối ưu yêu cầu p53 gắn đồng thời với cả hai yếu tố;
NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

16

có mặt của siRNA sẽ làm bất hoạt protein E6 và làm cho p53 hoạt động trở lại [15]. Một

NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33

17