CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
Phospho là nguyên tố thiết yếu cho sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản của
động vật. Tuy nhiên, có khoảng 60-75% phospho trong ngũ cốc và hạt dầu trong thức
ăn của động vật tìm thấy ở dạng phytate (inositol hexaphosphat) hoặc acid phytic
(myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphoric acid). Động vật dạ dày một ngăn như gia
cầm, lợn và cá không thể hấp thụ phospho trong phytate vì chúng không có enzyme
phytase trong đường ruột. Do đó, phospho vô cơ được thêm vào thức ăn để đáp ứng
yêu cầu. Ngoài ra, phospho ở dạng phytate trong thức ăn không được động vật hấp thu
sẽ bị đào thải trong phân và phospho dư thừa trong phân bị rửa trôi theo luồng nước
thải gây ra sự phát triển nhanh chóng của tảo và có thể ảnh hưởng đến lượng oxy trong
nước, làm cho cá chết.
Phytase là một enzyme acid phosphohydrolase, xúc tác thủy phân acid phytic
thành phosphate vô cơ và những dẫn xuất myo-inositol phosphate. Hoạt tính phytase
trong vi sinh vật thường được tìm thấy nhiều nhất ở nấm mốc.
Phytase được quan tâm cho những ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt giảm
phytate trong thức ăn và nguyên liệu. Bổ sung phytase vào nguyên liệu thức ăn chăn
nuôi sẽ làm tăng giá trị sinh học của phosphate, giảm ô nhiễm phospho trong những
vùng chăn nuôi tập trung. Sự thủy phân acid phytic bằng enzyme sẽ không sinh ra
những sản phẩm có độc tố. Như vậy, khai thác enzyme trong công nghiệp sẽ thân thiện
với môi trường và sẽ hỗ trợ trong sự phát triển của những công nghệ mới.
Tuy nhiên, khả năng ứng dụng enzyme này để thương mại hóa không được khả
thi trong nhiều năm, do hoạt tính thấp và giá thành cao khi sản xuất phytase theo
phương pháp lên men truyền thống. Để tạo ra một lượng lớn phytase có hoạt tính cao,
ổn định, không gây độc tố, có khả năng áp dụng trong sản xuất công nghiệp, các nhà
nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu tạo dòng gen phytase từ vi sinh vật vào vector
biểu hiện và biến nạp vào hệ thống biểu hiện chủ.
Trong những hệ thống biểu hiện thì Pichia pastoris được xem là có nhiều ưu thế
trong việc biểu hiện enzyme phytase tái tổ hợp với năng suất cao và có khả năng chịu
nhiệt tốt. Do vậy, chúng tôi tiến hành đề tài với mục đích tối ưu hóa các điều kiện sinh
1


2.1. ACID PHYTIC
2.1.1. Giới thiệu
Acid phytic là một acid hữu cơ có danh pháp quốc tế là myo-inositol
(1,2,3,4,5,6) hexakisphosphoric acid. Muối của acid phytic đuợc gọi là phytate và
được tìm thấy trong thực vật, động vật và đất. Phytate thường tìm thấy trong các loại
hạt, ngũ cốc và đậu chiếm khoảng 0,5-5% khối lượng hạt. Nó thường được tìm thấy
trong hạt dưới dạng muối Ca và Mg không tan (được gọi là phytin). Ở ngũ cốc và hạt
có dầu, phytate là dạng dự trữ phospho và inositol, nó chiếm 80% tổng lượng các
hợp chất có chứa phospho trong hạt.
Với cấu trúc ổn định, ở điều kiện thường acid phytic dễ dàng liên kết với Ca2+,
Mg2+, Fe2+ và Zn 2+. Ngoài ra, acid phytic cũng có khả năng liên kết và hình thành
các phức chất với các acid amin và protein, điều này gây cản trở và làm giảm khả
năng hấp thụ các chất dinh dưỡng của người và động vật. 1, 4

Hình 2.1. Acid phytic phức hợp tồn tại trong thực vật (Thompson, 1986 và

Kies, 1998)

2.1.2. Nguồn gốc trong tự nhiên
Phytic acid có thể được tìm thấy trong hầu hết các loại hạt, ngũ cốc và đậu.
Những nguồn giàu acid phytic nhất là cám lúa mì và hạt lanh (3%).
Phân bố của phytate trong hạt thay đổi tuỳ loài. Khoảng 90% phytate trong hạt
bắp nằm trong phần nhân của hạt. Trong khi đó, ở lúa gạo và lúa mì, hầu hết phytate
ở lớp vỏ cám bên ngoài. Trong hạt cây lấy dầu và hạt cây họ đậu, phytate thường ở
3


dạng kết hợp với các protein và được chứa trong các túi nhỏ nằm rải rác trong nhân
hạt. Ngược lại thì ở đậu nành, phytate không tập trung phân bố ở một vị trí nhất định.
Bên cạnh đó, hàm lượng phospho có trong đất cũng ảnh hưởng đến hàm lượng


60-61

Hạt cải

1,18

0,70

59

Hạt hướng dương

1,16

0,89

77

Bắp

0,26-0,33

0,24

66-72

Lúa mạch

0,34-0,42



Dạng cấu trúc hexa-orthophosphate đối xứng. 1

4


Hình 2.2. Acid phytic 21
2.1.3.2. Tính chất hoá học
Acid phytic có cấu trúc hoá học khá ổn định. Do mang nhiều nhóm acid
phosphoric nên nó tích điện âm cao và tồn tại trong phổ pH rộng.
Vì tích điện âm nên acid phytic có thể gắn chặt với các cation kim loại như:
Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+, K+,...tạo thành các muối không tan. Một cation kim
loại có thể gắn với một hoặc nhiều nhóm phosphate có trong một phân tử phytate
hoặc gắn với nhóm phosphate thuộc nhiều phân tử khác nhau.
Muối phytate có thể tồn tại dưới dạng không liên kết với kim loại hoặc tạo
phức hợp với kim loại tùy thuộc vào pH và nồng độ ion của dung dịch. Ở pH thấp,
phytate có khả năng hòa tan tốt hơn khi ở pH cao. Lý do là vì ở pH acid, phytate ở
dạng không liên kết với ion kim loại do sự proton hoá của các nhóm acid phosphoric
trong phân tử phytate. Ngược lại ở pH trung tính, các nhóm phosphate của phytate bị
khử proton nên tăng ái lực với các cation kim loại hoá trị hai. Do đó, phytate hình
thành phức hợp với các cation kim loại hoá trị hai, chủ yếu là Mg2+ và Ca2+.
Các nhóm acid phosphoric của phytate còn có khả năng kết hợp với các nhóm
mang điện tích dương của protein, amino acid, tinh bột, lipid....
Tương tác của phytate với các protein phụ thuộc vào pH. Ở giá trị pH dưới
điểm đẳng điện của protein, các nhóm phosphate tích điện âm của phytate sẽ gắn
chặt với các nhóm tích điện dương trên protein tạo phức hợp không tan. Những phức
hợp phytate-protein có thể bị phá vỡ do tác động cạnh tranh của các cation kim loại
hoá trị 2 và 3.
Ở giá trị pH nằm trên điểm đẳng điện của phytate và protein, cả protein và

trao đổi chất, kích thích tạo máu, tăng vận chuyển hemoglobin oxygen và hỗ trợ quá
trình hình thành mô xương. 1
2.1.4.2. Tác động kháng dưỡng
Nhiều nghiên cứu cho thấy phytic acid trong thức ăn gia súc có ảnh hưởng
kháng dưỡng mạnh vì một số lý do sau:


Động vật dạ dày một ngăn thiếu enzyme phân giải phytate vì thế không thể

sử dụng phospho có trong phytate.


Vì nhóm acid phosphoric mang điện tích âm nên có thể gắn chặt với các

cation như: Ca2+, Mg2+, Zn 2+, Mn2+, Fe2+, K+,...tạo thành các muối không tan làm ảnh
hưởng đến khả năng hấp thụ và tiêu hóa các chất khoáng này của động vật và làm
giảm đi nguồn cung cấp sinh học các khoáng này.


Nhóm acid phosphoric của phytate cũng có thể gắn kết với các nhóm protein,

amino acid, tinh bột và lipid có trong thức ăn làm giảm khả năng hoà tan của các
chất này và ảnh hưởng lên khả năng tiêu hoá các chất này.


Các nhóm acid phosphoric cũng có thể gắn với các protein trong cơ thể như:

amylase, pepsin, trypsin và acid phosphorylase để làm giảm hoạt tính của các
enzyme này ảnh hưởng lên khả năng sử dụng chất dinh dưỡng. 1, 4, 18
2.1.5. Các biện pháp giảm thiểu những tác động bất lợi của phytic acid



Tạo dòng các gia súc, gia cầm có khả năng tự tổng hợp phytase. Một số nhà

nghiên cứu ở Canada đã tạo giống lợn biến đổi gen Enviro có khả năng tự tổng hợp
enzyme phytase ở tuyến nuớc bọt. Giống lợn Enviro này có mang gen mã hoá cho
phytase được tạo dòng từ chủng E.coli không gây bệnh. Thí nghiệm cho thấy lượng
phytate trong chất thải của lợn giảm đi 75% so với lợn bình thường. Tuy nhiên việc
đưa giống lợn này ra ứng dụng trong sản xuất vẫn còn nhiều khó khăn.


Một phương pháp khác là thêm enzyme phytase tái tổ hợp vào thức ăn. Đây

được xem là phương pháp phổ biến nhất hiện nay. Việc bổ sung phytase vào thức ăn
sẽ giúp giải phóng phospho khỏi phytic acid, loại bỏ những ảnh hưởng kháng dưỡng
của acid phytic, nhờ đó kích thích sự tăng trưởng của vật nuôi và không cần bổ sung
thêm phospho vào thức ăn. Giúp giảm đáng kể chi phí sản xuất và giải quyết những
tác động có hại lên môi trường. Phytase thương mại thường được sản xuất nhờ lên
men các chủng Aspergillus niger, A.ficuum và A.oryzae. Hiện nay nhiều nghiên cứu
đang tập trung vào việc biểu hiện phytase bởi hệ thống biểu hiện Pichia pastoris và
đã thu được những thành công đáng kể. 1, 15

7


2.2. ENZYME PHYTASE
2.2.1. Khái quát
Phytase (myo-inositol (1,2,3,4,5,6) hexakisphosphate phosphohydrolase) là một
enzyme phosphatase đặc hiệu cho phytate, xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết
monophosphoester của acid phytic hoặc muối phytate, giải phóng acid phosphoric,

1993 – Ehrlich và cộng sự: tạo dòng gen phyB, mã hóa cho enzyme acid
phosphatase pH 6,0, từ A.niger NRRL 3135.
1993 – Pen và cộng sự: cho biểu hiện gen phyA từ nấm mốc, mã hóa cho
phytase, vào trong tobacco.
1994 – Ullah và cộng sự: tạo dòng gen, từ A.niger NRRL 3135, mã hóa cho
enzyme acid phosphatase pH 6,0.
1993 – Beudeker và Pen: cho biểu hiện gen phyA từ nấm mốc, mã hóa cho
phytase, vào trong Canoda (Brassica napus). 1
2.2.3. Phân loại
2.2.3.1. Dựa trên vị trí nhóm phospho đầu tiên bị enzyme tác động
Theo tổ chức Sinh hóa và Sinh học phân tử quốc tế (IUBMB), tổ chức định
danh sinh hóa (JCBN), enzyme phytase được phân thành hai nhóm chính dựa vào vị
trí nhóm phospho đầu tiên bị enzyme tác động:
 EC 3.1.3.8
Tên thường gọi: 3-phytase
Tên hệ thống: Myo-inositol-hexakisphosphate 3-phosphohydrolase
Các tên khác: Phytase, phytate 3-phosphatase
Enzyme này phân giải nhóm phosphate của myo-inositol-hexakisphosphate ở vị
trí D-3 trước tiên tạo sản phẩm 1D-myo-inositol 1,2,4,5,6-pentakisphosphate và
phosphate tự do.
Phytase có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn thường thuộc nhóm này.
 EC 3.1.3.26
Tên thường gọi: 6-phytase
Tên hệ thống: Myo-inositol-hexakisphosphate 6-phosphohydrolase
Các tên khác: Phytase, phytate 6-phosphatase, 4-phytase
Enzyme này phân giải nhóm phosphate ở vị trí L-6 trước tiên tạo sản phẩm 1Lmyo-inositol 1,2,3,4,5-pentakisphosphate và phosphate tự do, hoặc cũng có thể tác
động vào nối monophosphoester ở vị trí D-4 tạo sản phẩm 1D-myo-inositol 1,2,3,5,6pentakisphosphate. Do vậy enzyme này còn có tên gọi khác là 4-phytase.
6-phytase có nguồn gốc từ thực vật. 1, 5, 17

9

trong 15-30 giây. Một số phytase có khả năng chịu được nhiệt 100 oC trong 20 phút
mà chỉ mất 10% hoạt tính so với ban đầu.
Trong chế biến thức ăn gia súc, phytase cần phải có nhiệt độ tối ưu cao vì quá
trình kết vón thực phẩm được thực hiện ở 80-100 oC trong một vài giây.
Một vài nghiên cứu cho thấy có thể dùng kỹ thuật protein để làm tăng tính ổn
nhiệt của phytase như thay thế proline và tạo cầu disulfite hoặc có thể dùng kỹ thuật
sinh học phân tử để tạo dòng các phytase chịu nhiệt từ các nấm chịu nhiệt như
M.thermophila và T.thermophilus. 1, 5, 6

10


2.2.4.3. pH
pH tối ưu của các loại phytase dao động từ 2,2-8
Hầu hết các phytase vi sinh vật thể hiện pH tối ưu giữa 4,5 và 5,5, đặc biệt đối
với phytase từ nấm mốc. Tuy nhiên phytase từ nấm mốc A.fumigatus có phổ pH khá
rộng, từ 4,0-7,3.
Phytase vi khuẩn có pH tối ưu tại 6,5-7,5, đặc biệt đối với giống Bacillus.
Hầu hết các phytase từ nấm men có pH tối ưu trong khoảng 4-5. Tuy nhiên, giá
trị pH tối ưu của các phytase nấm men còn tùy thuộc vào nhiệt độ.
Các phytase nguồn gốc thực vật có pH tối ưu trong khoảng 4,0-7,5, đa số trong
khoảng 4,0-5,6.
Để ứng dụng được trong công nghiệp thức ăn gia súc, phytase phải có hoạt tính
cao ở pH trong hệ thống tiêu hoá. Các nhà khoa học đã tạo được đột biến điểm định
hướng bằng cách thay thế Gly-277 và Tyr-282 của phytase chủng hoang dại
A.fumigatus bằng các gốc tương đương của phytase A.niger (Lys và His) tạo được
một phytase có sức chịu pH tốt hơn, tối ưu tại 2,8-3,4. 1, 5, 6
2.2.4.4. Cơ chất
Phytase có cơ chất đặc trưng rộng: acid phytic, phytate và các chất có cấu trúc
tương tự như ADP, ATP, p-nitrophenyl phosphate, phenylphosphate, fructose-1,6bisphosphate, glucose-6-phosphate, α và β-glycerolphosphate, 3-phosphoglycerate.

Trình tự này được bảo tồn trong phytase của nấm mốc và vi khuẩn E.coli. Phân
tử của phytase nấm mốc và E.coli còn có một vùng bảo tồn gần đầu C, motif HD (H:
histidin, D: acid aspartic). Phytase có cả hai vùng này thường có khối lượng phân tử
lớn.
Phytase tấn công vào nhóm phosphate đầu tiên và phân giải liên kết
monophosphoester, giải phóng phospho vô cơ và myo-inositol-pentakisphosphate.
Sau đó, năm nhóm phosphate còn lại tiếp tục được giải phóng khỏi phytate nhờ
phytase hoặc những enzyme phosphatase không đặc hiệu khác vốn hiện diện với số
lượng lớn trong đường tiêu hóa. 1,5

12


Hình 2.3. Cơ chế xúc tác của phytase 19

+

3-phytase
+ H2O

Myo-inositol-

1D-myo-inositol 1,2,4,5,6-

hexakisphosphate

phosphate

pentakisphosphate


biến đổi cấu trúc một cách không thuận nghịch, khi ủ ở 55-90oC thì mất 70-80% hoạt
tính. 1, 5, 6
2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase
2.2.5.1. Ion kim loại
Các kim loại được xem là các tác nhân có ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt độ
phytase. Vai trò của ion kim loại đối với hoạt độ của enzyme phải xem xét trên từng
đối tượng cụ thể. Một ion kim loại có thể là các tác nhân làm giảm hoạt độ đối với
enzyme phytase này nhưng có thể là yếu tố tăng hoạt độ đối với enzyme phytase
khác. Các ion kim loại Zn 2+, Cu 2+ và Al3+ được chứng minh là có khả năng ức chế
hoạt động phytase của Enterobacter sp. Trong khi đó Zn 2+ và Fe2+ được xem là có
tác dụng làm tăng hoạt độ enzyme phytase ở chuột. 1, 5
2.2.5.2. Nồng độ cơ chất
Nồng độ cơ chất cao, sự tích tụ nhóm phosphate có thể ảnh hưởng vào trung
tâm xúc tác của enzyme. Điều này làm ức chế sự chuyển đổi phức hợp enzyme-cơ
chất thành enzyme và sản phẩm.
Nồng độ cơ chất khoảng 300 mol ức chế các enzyme của Paramecium.
Phytase của Rhizopus cũng bị ức chế bởi nồng độ cơ chất cao. Phytase nấm mốc bị
ức chế khi nồng độ cơ chất vượt quá 1 mM. 1, 6

14


2.2.5.3. Cạnh tranh bởi các chất có cấu tạo tương tự cơ chất
Một số chất có cấu tạo tương tự cơ chất có thể trở thành tác nhân ức chế. Ví dụ
myo-inositol hexasulfate có khả năng ức chế enzyme phytase của Aspergillus ficuum
do có cấu trúc tương tự phytate. 1, 5
2.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase
2.2.6.1. Các yếu tố vật lý
Các tham số vật lý có ảnh hưởng mạnh nhất đến sự tăng trưởng và sự tổng hợp
các sản phẩm biến dưỡng của các vi sinh vật là pH, nhiệt độ, sự khuấy trộn, lượng

Bên cạnh các nguồn C và N, một vài vi sinh vật cần các nguyên tố vi lượng và
các vitamin để tăng trưởng và sản xuất enzyme. Đối với sản xuất phytase bởi nấm
men, môi trường nuôi cấy cần các vitamin và nguyên tố vi lượng. Tuy nhiên một số
nấm như A.niger, A.ficuum không cần nguyên tố vi lượng trong lên men sản xuất
phytase. 2
2.2.7. Nguồn thu enzyme phytase
2.2.7.1. Phytase từ thực vật
Phytase có nhiều trong các loại ngũ cốc như lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo và từ
các loại đậu như đậu nành, đậu xanh, đậu trắng…. Phytase cũng được tìm thấy trong
mù tạt, khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina và phấn hoa huệ tây. Trong hạt đang nảy
mầm hoặc trong hạt phấn, phytase có vai trò phân giải phytin.
Nhiệt độ tối ưu của phytase nguồn gốc thực vật vào khoảng 45-60oC. Phytase
thực vật có thể mất hoàn toàn hoạt tính khi gia nhiệt ở nhiệt độ cao. Vì thế tính bền
nhiệt của phytase thực vật không cao. 5, 15
2.2.7.2. Phytase từ động vật
Phytase đã được phát hiện từ thận và máu dê. Phytase cũng được phát hiện
trong máu các động vật có xương sống bậc thấp hơn như chim, bò sát, cá, rùa biển.
Vì phytate hoạt động như một nhân tố kháng dưỡng trong cơ thể động vật nên các
nhà khoa học đã quan tâm và khảo sát sự hiện diện của phytase trong đường tiêu hoá
của nhiều loài động vật. Phytase được tìm thấy trong đường ruột của chuột, heo, cừu,
bò. Tuy nhiên, phytase trong hệ ruột động vật không đóng vai trò quan trọng trong
việc tiêu hoá phytate.
Phytase từ ruột người có hoạt tính thấp hơn 30 lần so với phytase từ ruột chuột
và cũng không có ý nghĩa trong việc tiêu hoá phytate. Phytate được tiêu hoá trong hệ
ruột của người nhờ lượng phytase có trong thực phẩm.
Động vật nhai lại tiêu hoá được phytate nhờ hoạt động của phytase được sản
xuất bởi hệ vi sinh vật trong dạ cỏ. Lượng photphate vô cơ giải phóng ra nhờ hoạt

16


phytase thực vật giảm đáng kể ở pH vượt khỏi khoảng từ 4,0-7,5, trong khi phần lớn
các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật chịu được ở pH trên 8,0 và dưới 3,0. 5, 15
2.2.8. Tổng quan về chuyển gen mã hóa phytase
Mặc dù tác dụng phân giải phytate của phytase đã được phát hiện cách đây
khoảng 30 năm (Nelson và cs., 1971), nhưng khả năng ứng dụng thương mại hóa
phytase không được khả thi trong nhiều năm, do hiệu quả hoạt tính thấp và giá thành
cao khi áp dụng sản xuất phytase theo phương pháp lên men cổ truyền. Với sự phát
triển của kĩ thuật DNA tái tổ hợp, thông qua hệ thống biểu hiện protein ngoại lai của
các chủng vi sinh vật khác nhau đã tạo ra một lượng lớn enzyme phytase có hoạt tính
cao, do đó giảm giá thành sản xuất, mang lại rất nhiều lợi ích và tính năng vượt trội
so với việc thu nhận từ các nguồn vi sinh vật ban đầu. Đồng thời, việc áp dụng công
nghệ mới này có thể dễ dàng kiểm soát mức độ sinh enzyme phytase, không sinh độc
tố tạo thực phẩm an toàn cho động vật. Nhiều vi sinh vật khác nhau được nghiên cứu

17


sử dụng làm chủng chủ biểu hiện gen phytase bao gồm cả vi khuẩn, nấm mốc, nấm
men, tế bào động vật. 2
2.2.8.1. Biểu hiện gen mã hóa phytase trong vi khuẩn
Gen mã hóa phytase được biểu hiện trong nhiều chủng vi khuẩn như: Bacillus
subtilis, B.alkalophilus, B.amyloliquefaciens, B.coagulans, B.circulans, B.Lautus,
B.Thuringiensis, E.coli, Lactobacillus plantarum,...
a) Trong vi khuẩn E. coli
Gen phyC biểu hiện trong chủng E.coli XL-Blue MRS (vector biểu hiện pBsm)
sinh phytase nội bào do hình thành thể bao ngoài. Đồng thời trình tự peptid tín hiệu
phyC tự nhiên không có chức năng tiết phytase trực tiếp vào môi trường nuôi E.coli
XL-Blue MRS. Để giải quyết vấn đề này, một chiến lược được tạo dòng khác đã
được lựa chọn. Một đoạn gen mã hóa phytase không có trình tự tiết tự nhiên được
tạo dòng sau trình tự tín hiệu phân giải pectate từ Erwinia carotoyora dưới sự điều

phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc. 2
2.2.8.3. Biểu hiện gen mã hóa phytase trong nấm men
Gen mã hóa enzyme phytase của A.fumigatus được biểu hiện hiệu quả trong
Pichia pastoris. Đoạn DNA 1,4 kb có chứa vùng gen mã hóa gen phytase được gắn
chèn vào vector biểu hiện pPICZαA và biểu hiện trong Pichia pastoris như một
phytase ngoại bào hoạt động . Enzyme này có nhiệt độ, pH tối ưu, trọng lượng phân
tử và khả năng gắn nhóm đường tương tự như phytase từ chủng A.fumigatus. Điều
đó kết luận rằng Pichia pastoris là một chủng chủ có tiềm năng biểu hiện phytase
A.fumigatus ở mức độ cao (Rodrigues và cs., 2000). Chủng tái tổ hợp Hansenula
polymorpha sinh phytase hiệu quả vì so với quá trình sử dụng glycerol, sử dụng
glucose sẽ dẫn đến giảm 80% giá thành. Thêm vào đó, nồng độ đặc biệt cao của
enzyme có hoạt tính (> 13,5 g/l) thu được từ môi trường, với lượng enzyme phytase
thu nhận trên 97% so với lượng tổng protein thu nhận (Mayer và cs., 1999). 2
2.2.8.4. Biểu hiện gen mã hóa phytase trong thực vật
Phytase cũng được phát triển sản xuất trong công nghệ sinh học thực vật, sử
dụng kĩ thuật chuyển gen ở thực vật để ứng dụng trong lĩnh vực y dược và sản xuất
enzyme trong công nghiệp. Tạo thực vật chuyển gen với việc tăng cường mức độ
biểu hiện của 3-phytase bằng cách sử dụng vector biểu hiện chứa gen mã hóa
phytase từ nấm được biến nạp vào thực vật chủ. Tốt nhất là thu nhận gen mã hóa
phytase từ A.niger, A.awamorii, và A.nidulans, A.ficuum (Brocades, 1991). Gen
phyA từ A.ficuum mã hóa phytase có chiều dài 441 amino acid được biểu hiện trong
lá của cây thuốc lá Nicotiana tabacum (Ullah và cs., 1999).

19


Các ứng dụng khác của công nghệ sinh học trong thực vật để giảm sự cần thiết
của phytase bởi lượng phytate thấp có trong cây ngũ cốc hay thức ăn. Giống bắp với
hàm lượng thấp acid phytic cũng đã được sản xuất. Đậu nành chuyển gen mã hóa
phytase từ nấm mốc và do đó sẽ loại bỏ hay giảm sự cần thiết bổ sung thức ăn với


Wodzinski và Ullah (1996) đã đưa ra con số thống kê rằng nếu dùng phytase để
bổ sung vào thức ăn gia súc của tất cả vật nuôi ở Mỹ thì lượng phospho được giải
phóng ra sẽ tương ứng với 168 triệu USD và sẽ giảm được 8,23x104 tấn phospho thải
ra môi trường mỗi năm. Cục Quản Lý Thuốc và Thực Phẩm (FDA-The Food and
Drug Administration) đã công nhận chế phẩm phytase đạt tiêu chuẩn GRAS
(Generally Regarded As Safe). 1, 7, 9, 15
2.2.9.2. Trong công nghiệp thực phẩm
Ngũ cốc, hạt có dầu và các loại đậu là các loại nguyên liệu phổ biến trong chế
biến thực phẩm. Điều này dẫn đến một lượng lớn phytate được tiêu thụ vào trong cơ
thể con người. Phytate trong hệ ruột không được tiêu hoá sẽ tác động xấu đến sự hấp
thụ kẽm, canxi, magiê và sắt. Hơn nữa, nó còn ức chế hoạt động của các enzyme tiêu
hoá. Do đó, việc bổ sung phytase vào nguyên liệu trước khi chế biến có một ý nghĩa
lớn.
Phytase đã được bổ sung vào quá trình chế biến bột mì để làm giảm lượng acid
phytic trong các loại bánh dùng bột mì. Phytase thích hợp cho quá trình này cần có
pH tối ưu ở 4,5-5, nhiệt độ tối ưu 30 oC. 1, 7, 9, 15
2.2.9.3. Trong tổng hợp myo-inositol phosphate
Trong ngũ cốc và rau đậu, những thực phẩm bổ sung cơ bản, acid phytic ngăn
chặn sự hấp thu sắt, gây ra sự thiếu hụt sắt phổ biến ở trẻ em của những nước đang
phát triển, phụ nữ tuổi dậy thì hay những người ăn chay. Trong nghiên cứu, Svàberg
(1999) cho thấy inositol hexakisphosphate (IP6) cũng như pentakisphosphate (IP5)
có tác động làm kìm hãm sự hấp thu sắt. Thêm 10 mg phospho như IP5 làm giảm sự
hấp thu sắt đến 39%. IP3 và IP4 cũng góp phần tác động tiêu cực khi chúng được
cho cùng với IP5 và IP6. Như vậy, để cải thiện sự hấp thu sắt từ ngũ cốc và rau đậu,
nên phân hủy phosphate inositol để tạo ra dạng phosphoryl hóa ít hơn IP3.
Mặt khác, các ester myo- inositol có ít phospho (mono, bis, tris, và
tetrakisphosphates) đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển trên màng
các tín hiệu và huy động canxi dự trữ bên trong tế bào ở mô động vật và thực vật
(Michell, 1975, Berridge và Irvine, 1984, Samanta, 1993, Dasgupta, 1996,


22


Giới

: Nấm

Ngành

: Ascomycota

Ngành phụ: Saccharomycotina
Lớp

: Saccharomycetes

Bộ

: Saccharomycetales

Họ

: Saccharomycetaceae

Chi

: Pichia

Loài



Saccharomyces
cerevisiae

Pichia pastoris

Hình 2.6. So sánh khả năng tạo sinh khối giữa Pichia pastoris và
Saccharomyces cerevisiae. 14


Hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris cũng được xem là nhanh, dễ thực

hiện, có mức độ biểu hiện cao và không quá tốn kém như các hệ thống biểu hiện
bằng nuôi cấy tế bào côn trùng và động vật có vú.


Pichia pastoris bình thường tổng hợp ít loại protein của bản thân nó. Do đó,

nếu đưa gen lạ tổng hợp protein mới thì sản phẩm dễ dàng tinh sạch. Pichia pastoris
đã được chứng minh là sinh vật an toàn, hầu như không tạo ra độc tố.


Ngoài ra hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris còn có promoter mạnh như

là AOX1. Gen được điều khiển bởi các promoter này khi được kết hợp vào bộ gen
của Pichia pastoris sẽ tạo lên một chủng có khả năng biểu hiện protein ở mức cao
với hàm lượng lên đến vài g/l. Trong đó promoter AOX1 được đặc biệt quan tâm vì
khả năng cảm ứng bằng methanol.


2,3

Mut+

Tiết ra môi trường

Albumin của người

4,0

Mut+, Muts

Tiết ra môi trường

0,006

Mut+

Tiết ra môi trường

Carboxypeptidase B

0,8

Mut+, Muts

Tiết ra môi trường

α-Amylase


sau đó được chuyển hóa trong tế bào chất, tái tạo xylulose-5-phosphate. Trong số
này, 1/3 số phân tử glyceraldehyde-3-phosphate sinh ra được chuyển hóa và tạo sinh
khối tế bào.
Pichia pastoris có 2 gen mã hóa cho alcohol oxidase là AOX1 và AOX2, trong
đó gen AOX1 chịu trách nhiệm cho phần lớn hoạt tính alcohol oxidase trong tế bào.
25