Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Đặt vấn đề
Các chất kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật thờng đợc phân lập từ vi
khuẩn (Bacteria), vi nấm (Microfungi) và xạ khuẩn (Actinomycetes). Kháng
sinh từ xạ khuẩn chiếm 80% tổng số chất kháng nhận đợc từ vi sinh vật [14] Xạ
khuẩn có 2 chi cho kháng sinh nhiều nhất là Streptomyces và Micromonospora.
Chi Streptomyces đã đợc các nhà sinh vật nghiên cứu trong nhiều năm, rất
nhiều chất kháng sinh từ chi này đợc ứng dụng trong điều trị, song cơ hội tìm đ-
ợc những chất kháng sinh mới có giá trị từ Streptomyces ngày càng ít. Vì vậy
trong những năm gần đây một chi khác của xạ khuẩn đợc thế giới quan tâm
nhiều là Micromonospora. Ngời ta đã nhận đợc từ chi này một số chất kháng
sinh tốt, phổ rộng nh: Gentamycin, Neomycin-B, Rifamycin.....
ở Việt Nam chi Micromonospora mới đợc nghiên cứu từ những năm 90
nhng kết quả còn rất hạn chế. Với mong muốn đợc tiếp tục tìm hiểu về đặc tính
phân loại và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Micromonospora ở Việt
Nam, hy vọng có thể nhận đợc những chủng cho chất kháng sinh có ý nghĩa .
Chúng tôi chọn đề tài:
Phân lập Micromonospora có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ
bùn hồ Bẩy Mẫu - Hà Nội .
Với các nhiệm vụ sau:
- Phân lập Micromonospora từ bùn hồ và thử phổ kháng khuẩn của các
chủng phân lập.
- Nghiên cứu phân loại một số chủng có hoạt tính kháng sinh tốt.
- Sơ bộ xác định một số thành phần dinh dỡng thích hợp cho sự phát triển
và sinh tổng hợp kháng sinh của các chủng đã chọn.
Từ kết quả nghiên cứu ban đầu của khoá luận chúng tôi hy vọng nó sẽ là
cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo.
1
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Phần 1. Tổng quan
1.1 Đại cơng về chi Micromonospora [ 7, 8, 12, 13,14]

đen, chúng có thể khô hoặc trở thành ớt và nhầy.
1.1.3 Tính chất hoá học của thành tế bào:
Cơ sở để phân biệt chi Micromonospora với các chi khác của xạ khuẩn là
không có khuẩn ti khí sinh và sự hình thành bào tử, ngoài ra còn dựa trên tính
chất thành tế bào kiểu II của nó. Thành tế bào kiểu II đặc trng bởi thành phần
hóa học có: m-diaminopimelic acid ,glycin và glutamic acid, thành phần đờng
là xylose và arabinose. Glucose, galactose, manose và rhamnose thì khác nhau
của các loài.
1.1.4 Tính chất sinh lý, sinh hoá của Micromonospora.
Micromonospora đóng vai trò vô cơ hoá các nguyên liệu hữu cơ và trong sự
mùn hoá, ngoài ra Micromonospora có thể phân huỷ cellulose, kitin, lignin,
xylan, tinh bột, casein, khử nitrat, protein.
Nhiệt độ phát triển từ 20
0
C -> 40
0
C, nhng không phát triển ở trên 50
0
C.
Hầu hết các loài hiếu khí, mẫn cảm với pH < 6,0.
- Bào tử của Micromonospora ngợc lại với bào tử Streptomyces, chịu đợc nhiệt
độ và dung môi hữu cơ. Chúng có thể tồn tại trong nớc 60
0
C trong 90 phút, nh-
ng chết ở 90
0
C trong 15 phút. Bào tử chịu đợc pH từ 6 ữ 8, thờng bị mẫn cảm ở
pH acid mạnh. Bào tử có thể sống sót trong các dung môi hữu cơ nồng độ
không quá 80%, bào tử có sự kháng cao với dioxal, aceton.
1.1.5 Khả năng gây bệnh của Micromonospora:

& cộng tác 1970).
Rifamicin từ M. ellipsaspora 71372.
- Một số kháng sinh nhóm polipeptid:
4
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Chalcidin do M. chalcea H
85
(Gauze & cộng tác 1970).
1.2 Những nghiên cứu về phân loại trên quần thể Micromonospora.
[5,7,9,12,14] :
- Wagman S.A (1961) đã nhận định trong các loài đặc chủng của
Micromonospora các tính chất về hình thái là những tiêu chuẩn, ban đầu cho
việc xác định loài. Các đặc tính sinh lý, sinh hoá nh phân huỷ cellulose, khử
nitrat cũng quan trọng. Mầu và hình dạng của khuẩn lạc không đợc coi là
những đặc tính cơ bản, vì mầu của nó không cố định mà thay đổi từ vàng sang
da cam, hồng, đỏ, nâu và đen. Các loài Micromonospora là hiếu khí hoặc kỵ
khí. Chúng có thể sử dụng các nguồn nitrogen và carbon vô cơ, hữu cơ khác
nhau. Wagman S.A đã chia chi Micromonospora thành 9 loài bao gồm:
M. chalcea M. parva M. coerulea
M. gallica M. fusca M.propionica
M. globosa M. elongata M. bicolo
- Sveshmikova và cộng tác năm (1970) đã nghiên cứu những loài
Micromonospora từ đất bùn ở ngoại ô Moscow. Họ đã đa ra 5 loài mới nhng chỉ
dựa trên rất ít đặc tính nh sử dụng 6 nguồn carbon, sự tạo sắc tố trong môi trờng
và kiểu bào tử.
Nhng theo họ tiêu chuẩn này cũng không luôn luôn ổn định.
- Singal và Solovieva (1974) cũng đã nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn
carbon của Micromonospora.Tuy nhiên không có những kết luận về phân loại từ
những số liệu này.
- Luedemann (1970, 1971), sau những nghiên cứu chi tiết trên nhiều phân lập

Micromonospora chalcea ATCC 12452.
Micromonospora halophytica ssp halophytica ATCC 27596.
Micromonospora narashino ATCC 27331.6
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Phần 2. Thực nghiệm và kết quả
2.1 Nguyên liệu và phơng pháp thực nghiệm
2.1.1 Nguyên liệu:
- Nguyên liệu để phân lập chủng, các mẫu bùn của hồ Bảy Mẫu- Hà Nội.
- Các môi trờng nuôi cấy:
Các môi trờng của Luedemann (1971) và Szabozsuzsa (1982) đã đợc sử dụng
trong nghiên cứu.
- Chủng Micromonospora dùng trong nghiên cứu:
Chủng Micromonospora dùng trong nghiên cứu đợc phân lập từ các mẫu
bùn hồ Bẩy Mẫu. Trên cơ sở phổ kháng khuẩn chúng tôi đã chọn 5 chủng để
nghiên cứu phân loại đợc ký hiệu là M
14
, M
16
, M
26
, M
30
, M
47
.
- Chủng vi sinh vật chỉ thị:
Gồm 9 vi khuẩn và 1 vi nấm.

10
-3
, 10
-4
cấy vào các môi trờng phân lập sau:
- Môi trờng men tinh bột: (MT1)
Tinh bột tan 20,0g.
Cao men 10,0g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml
pH: 7 0,2.
- Môi trờng Gauze I: (MT 2).
Tinh bột tan 20,0g.
K
2
HPO
4
. 7 H
2
0 0,5g.
NaCl 0,5g.
MgSO
4
. 7 H
2
0

0,5g
KNO
3

Các vi sinh vật sau 18 đến 24 giờ nuôi cấy trên các môi trờng thích hợp
đợc làm thành nhũ dịch (có khoảng 10
7
10
8
tế bào trong 1ml) trong NaCl
0,9%.
- Môi trờng:
Môi trờng cao thịt cao men (thử ức chế vi khuẩn): MT3
Pepton 10,0g.
Cao thịt 1,5g.
Cao men 3,0g.
Glucose 1,0g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml
pH: 7,0 0,2.
Môi trờng Sabouraud (thử ức chế vi nấm): MT 4
Pepton 10,0g.
Glucose 40,0g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml.
pH: 7,0 0,2.
- Các khối thạch của Micromonospora đợc đặt lên bề mặt của các đĩa môi
trờng đã có vi sinh vật chỉ thị với tỷ lệ 1% (v/v). Đo đờng kính vòng ức chế sau
9
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
18 24 giờ nuôi cấy ở 35
0
C đến 37
0

2
HPO
4
. 7 H
2
O 1,0g.
MgSO
4
. 7 H
2
O 0,5g.
KCl 0,5g.
FeSO
4
.7 H
2
O 0,1g.
Saccharose 30,0g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml
pH: 7,0 0,2.
- Môi trờng thạch sữa (MT 7):
Cao men 5,0g.
Glucose 1,0g.
CaCO
3 1,0g.
10

- Khoai tây đợc gọt vỏ cắt thành từng miếng có kích thớc khoảng
1 x 1 x 6cm. Sau đó đợc cắt vát theo chiều dọc, cho vào ống nghiệm hấp tiệt
trùng, đo pH của miếng khoai tây đã vô trùng.
Một phần các miếng khoai tây khác đợc xử lý với CaCO
3
trớc khi hấp tiệt
trùng sao cho miếng khoai tây có pH từ 6,6 7,0.
- Các chủng đợc cấy song song lên 2 loại miếng khoai tây. Quan sát sự phát
triển của chúng sau 7 10 ngày nuôi cấy.
2.1.2.7 Thử khả năng khử nitrat:
Sự khử nitrat thành nitrit đợc thực hiện trên môi trờng sau:
11
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Môi trờng 9 (MT 9):
pepton 5,0g.
Cao thịt 3,0g.
KNO
3
1,0g.
Nớc cất 1000,0ml
pH: 7 0,2.
Đóng ống: 5ml/1 ống.
Sau thời gian nuôi cấy 7 đến 10 ngày sự khử Nitrat đợc phát hiện bằng cách
thêm vào ống môi trờng đã nuôi cấy 1,0ml thuốc thử acid sulfanilic ( 8g acid
sulfanilic trong 1 lít acid acetic 5N) và 1ml thuốc thử dimethyl- -
naphthylamin (6 ml dimethyl- - naphthylamin trong 1 lít acid acetic 5N). Nếu
có màu đỏ là phản ứng dơng tính. Nếu không có màu đỏ thêm một ít bột kẽm
vào ống thử, nếu nitrat còn sẽ đợc khử thành nitrit, nếu có màu đỏ xuất hiện,
phản ứng âm tính. Nếu không có màu sau khi thêm bột kẽm chứng tỏ nitrat đã
đợc sử dụng hoàn toàn hoặc đã đợc khử thành NH