i
SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự giúp
đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ từ phía gia đình thầy cô và bạn bè. Nhờ đó mà tôi đã hoàn
thành đồ án được như mong muốn, nay cho phép tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc và
chân thành đến:
Trước hết là ThS. Lê Phương Chung, người trực tiếp hướng dẫn đề tài.
Trong suốt thời gian thực hiện, thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh
nghiệm, giúp tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong quá trình làm đồ án và hoàn
thành đồ án đúng định hướng ban đầu.
Sau đó, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Văn Duy, Viện
phó, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tận
tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đồ án này. Đồng thời bày
tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại
học Nha Trang và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo môi trường
thuận lợi, cung cấp đầy đủ thiết bị, dụng cụ cho tôi thực hiện đề tài một cách xuyên
suốt.
Sau cùng, tôi xin cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè, chị
Nguyễn Minh Nhật, và các anh chị cao học.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Chúc tất cả
mọi người sức khỏe thành đạt. ii
SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
2.2.2 Tuyển chọn chủng sinh bacteriocin 34
2.2.3 Xác định đặc điểm của chủng vi khuẩn sinh bacteriocin 38
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1 Phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu tôm Hùm 44
3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng phân lập 45
3.3 Xác định hoạt tính bacteriocin 47
3.4 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 48
3.5 Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn 50
3.5.1 Khả năng chịu muối 50
3.5.2 Thử catalase 51
3.5.3 Tính di động 52
3.5.4 Khả năng sinh hơi 53
3.6 Định danh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử 53
Chƣơng IV : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 54
4.1 Kết luận 54
4.2 Kiến nghị 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
PHỤ LỤC 58
iv
SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại I 5
Bảng 1.2 : Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại II 6
Bảng 1.3: Phân loại bacteriocin theo Jack [16] 9
Bảng 1.4: Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer [20] 12
Bảng 1.5: Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp
bởi vi khuẩn 14
Hình 3.7 : Khả năng di động của chủng N14 52
Hình 3.8 : Khả năng sinh hơi của chủng N14 53 vi
SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
DANH MỤC TỪ, KÍ TỰ VIẾT TẮT
STT
Kí hiệu viết tắt
Nghĩa
1
TSB
Tryptone Soya Broth
2
TSA
Tryptone Soya Agar
3
BC
Bacterial Cellulose
4
LAB
Lactic Acid Bacteria
5
ATP
Adenosine Triphosphate
điều trị bệnh cho người, mà còn dùng điều trị bệnh cho vật nuôi, tăng trọng cho vật
nuôi và cả trong bảo quản thực phẩm (như chlotetracycllin dùng để bảo quản thịt;
tetracycline, oromycine… để bảo quản sản phẩm nhằm ngăn chặn quá trình thối rữa
của thịt cá, tôm). Tuy nhiên do lạm dụng quá mức kháng sinh đã dẫn đến khả năng
kháng thuốc ở vi sinh vật nên việc nghiên cứu chất kháng khuẩn để ứng dụng trong
bảo quản thực phẩm cần phải đi theo một hướng mới, hiệu quả hơn.
Không những thế, trong những năm gần đây, khi người tiêu dùng đã nhận
thức rõ hơn về tác động của phụ gia thực phẩm đối với sức khỏe và chuộng các loại
thực phẩm chế biến không bổ sung chất bảo quản hóa học tổng hợp vì tính an toàn
cho thực phẩm. Và từ yêu cầu cao về chất lượng, tính an toàn của thực phẩm từ phía
người tiêu dùng cũng như những yêu cầu nghiêm ngặt của chính phủ về an toàn
thực phẩm trong sản xuất, chế biến, bảo quản đã thúc đẩy nghiên cứu rộng rãi các
chất có khả năng bảo quản thực phẩm có nguồn góc tự nhiên.
3 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Xuất phát từ những yêu cầu đó, việc tiếp tục tìm ra những chất kháng khuẩn
mới trở nên quan trọng trong lĩnh vực y dược và chăn nuôi, và trong công nghệ thực
phẩm. Một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng bacteriocin, một nhóm các hợp chất có
bản chất là peptide, nguồn gốc từ vi sinh vật và có khả năng kháng khuẩn mà không
gây ra tác động kháng thuốc ở vi sinh vật. Ngoài ra, bacteriocin cũng không gây dị
ứng cho con người, an toàn với sức khỏe. Đó là một sự lựa chọn được xem là có
nhiều ưu điểm và hiệu quả nhất. Vì thế, tôi chọn tiến hành nghiên cứu đề tài
“ Nghiên cứu đặc điểm và phân loại vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin
phân lập đƣợc từ tôm hùm ở Khánh Hòa ”, giúp làm phong phú thêm bộ sưu tập
chủng vi sinh vật sinh chất kháng khuẩn, tạo ra nhiều sự lựa chọn cho việc tuyển
chọn chủng, và hiểu được đặc tính của các chủng này để tăng khả năng sinh
bacteriocin.
Đề tài nhằm các mục đích chính sau đây:
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay protein được tổng
hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại vi khuẩn
khác có quan hệ gần gũi với chúng. Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào
thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra không gây ra phản ứng dị
ứng trong con người và vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym
proteinase, lipase.
1.1.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin
Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram
dương với những đặc điểm :
- Bacteriocin của vi khuẩn gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kích thước,
nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch.
Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương.
- Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở
vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn gram âm ở chỗ là: việc tạo
5 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp
bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm .
Những nghiên cứu trước đây về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn
Gram âm, điển hình là E. coli sinh tổng hợp colicin. Tuy nhiên những nghiên cứu
về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương cũng đã được tiến
hành và đã có nhiều báo cáo cung cấp những thông tin về vấn đề này. Ba chủng vi
khuẩn Gram dương được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là
Bacillus sp.;Listeria sp. và Staphylococcus sp.
Ngày nay thì các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu
nhiều hơn, do tính ưu việt của bacteriocin này dùng trong bảo quản thực phẩm là an
toàn với người sử dụng, không độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân hủy bởi
proteinase trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật trong ruột người.
6 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Bảng 1.2 : Một số chủng vi khuẩn sinh bacteriocin loại II
Bacteiocin
Vi khuẩn
Bavaricin A
Bavaricin MN
Carnobacteriocin B2
Carnobacteriocin BM1
Curvacin A
Divercin V41
Enterocin A
Enterocin P
Leucocin A/B –Talla
Mesentericin Y105
Acidocin J1132
Lactacin F
Lacticin 3147
Lactobin A
Lactococcin G
Divergicin A
Lactococcin A –
Plantaricin 1.25β
Lactobacillus sake MI401
Lactobacillus sake MN
Carnobacterium pisciocola LV17B
Carnobacterium pisciocola LV17B
SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
1.1.3.1 Lớp I
Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa),
bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một bacteriocin của nhóm này là nisin.
Các lantibiotic chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương đồng cấu trúc.
Phân lớp Ia
Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương,
chúng hoạt động bằng cách kết hợp với các lipid mang điện tích âm hình thành các
lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhạy cảm [24]. Nisin cũng thuộc
nhóm này. Đây là một peptide được hình thành bởi 34 aminoacid, các loại acidamin
phổ biến có trong nisin là lanthionine (Lan), methyllanthionine (MeLan),
didehydroalanine (DHA) và acid didehydroaminobutyric (Dhb). Nisin có 2 biến thể
của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z. . Hình 1.1: Cấu trúc của nisin ( Nguồn: Ruiz-Larrea và cộng sự, 2005)
Loại bacteriocin này được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic,
được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng khuẩn Gram
(+) rộng, E. coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng
ngoài của chúng bị phá hỏng. Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả
đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của
Bacillus spp. và Clostridium spp. [24]. Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực
phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm
chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium .Nisin cũng được
ghi nhận có hiệu quả chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram (+) gây ra [10].
Ancovenin
Cinnamycin
Duramycin
Epidermin
Gallidermin
Lanthiopeptin
Mersacidin
Nisin
Pep5
Subtilin
1,9
2,0
2,0
2,0
2,2
2,2
2,0
1,8
3,4
3,5
3,3
19
19
19
19
22
22
19
3,9
3,8
4,3
4,4
5,6
5,1
4,5
4,9
4,9
44
37
37
41
43
57
53
43
48
56
Pediociccus acidilactici H/PAC 1.0
Leuconostoc gelidium UAL 187
Leuconostocmesenteroides Y 105
Lactobacillus sake LB 706
Lactobacillus sake LTH 674
Lactobacillus acidophilus 11088
Carnobacterium piscicola LV 17 A
Carnobacterium piscicola LV 17 B
Carnobacterium piscicola LV 17 B
4,1
54 48
47
39
35
Lactococcus lactis subsp. cremoris 9 B4
L. lactis subsp. cremoris LMG 2130
L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis
WM4
L. lactis subsp. cremoris 9 B4
L. lactis subsp. cremoris 9 B4
L. lactis subsp. lactis LMG 2081
L. lactis subsp. lactis LMG 2081
10 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
1.1.3.2 Lớp II
Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng
phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine. Các bacteriocin
nhóm II có thể chia thành 3 phân lớp, bao gồm IIa, IIb và IIc.
Lớp IIa
Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại diện
đặc trưng cho nhóm này là Leucocin A, pediocin PA-1. Các sakacin A, sakacin P
cũng là đại diện đặc trưng cho nhóm này. Các bacteriocin nhóm này hoạt động bằng
Lactococcin G là một bacteriocin có hoạt động phụ thuộc vào hoạt động bổ
sung của 2 peptide, là lactococcins Gα và Gβ. Lactococcin Gα gồm có 39 acid amin,
còn Lactococcin Gβ gồm có 35 acid amin. Bactericoin này được sử dụng như một
chất bảo quản thực phẩm, có khả năng kháng tế bào vi khuẩn Lactococcus lactis.
Hoạt động diệt khuẩn chỉ xảy ra khi có sự hiện diện của cả 2 peptid, mặc dù 2
peptide này có khả năng diệt khuẩn độc lập.
Lớp IIc
Lớp IIc là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không đồng
nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau. Nhóm IIc bao gồm tất
cả các bacteriocin lớp II không rơi vào nhóm IIa, IIb. Trong phân lớp này tìm thấy
có 2 dạng [20]:
- Chất kháng khuẩn có 1 hoặc 2 gốc cystein (như thiolbiotics có một và
cystibiotics có 2 gốc cystein).
- Kháng khuẩn không có cystein (lactoccin A và acidocin B)
12 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Bảng 1.4: Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer [20]
Bacteriocin
Vi sinh vật sản xuất
Khối lượng
phân tử(Da)
Amino
acid
Gốc
cystein
Cerein 7/8
Enterocin B
56
53
53
54
47
46
59
2
2
2
0
1
2
0
1.1.3.3 Lớp III
Lớp này bao gồm những peptide lớn, có trọng lượng phân tử lớn hơn 30 kDa,
không bền nhiệt. Nhóm này có thể bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi
khuẩn có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Các bacteriocin lớp
III cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của giống Lactobacillus [24].
Đại diện cho nhóm này là halveticin J [17] được sản xuất bởi vi khuẩn L. halveticus
481 và helveticin V, acidifilicin A và lactacin A, lactacin B được sản xuất bởi L.
acidophilus.
13
khoảng pH nhất định. Chủng ST28MS và ST26MS ngoài có độ bền nhiệt cao,
chúng lại có thể hoạt động ổn định trong 2 giờ tại những giá trị pH từ 2-12. Những
đặc tính này đều dựa vào bản chất thành phần cấu trúc của bacteriocin đó. Độ bền
nhiệt độ và pH rất quan trọng trong quá trình bảo quản nguyên liệu thực phẩm. Tùy
14 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
vào trạng thái, nhiệt độ thực phẩm mà chúng ta có thể lựa chọn loại bacteriocin bổ
sung và sao cho phù hợp với mục đích sản xuất.
Độ bền enzyme
Mỗi loại bacteriocin có thành phần cấu trúc các aminoacid khác nhau nên sẽ
chịu sự phân cắt đặc hiệu của các enzyme khác nhau, thích hợp với nó. Khi bị phân
cắt bởi các enzyme này sẽ khiến bacteriocin mất đi hoạt tính kháng khuẩn. Đồng
thời đây cũng là dấu hiệu giúp ta nhận biết được đó có phải là bacteriocin không.
Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi
vi khuẩn Gram dương được trình bày ở bảng sau.
Bảng 1.5: Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp
bởi vi khuẩn
Bacteriocin
Độ bền nhiệt
Độ bền pH
Enzyme thủy phân
Megacin A-216
60
0
C, 30 phút
2 – 7
Chymotrypsin, Pepsin, Trypsin
0
C, 10 phút
1,1 – 9,5
Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,
Pepsin
Bioticin P
60
0
C, 30 phút
6,5 – 7,5
Trypsin, Rnase, Alkaline
phosphotase, Phospholipases C, D
Butyricin 7423
100
0
C, 10 phút
2 – 12
Trypsin
Perfringocin 11105
100
0
C, 30 phút
2 – 12
Trypsin
15 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
1.1.4.3 Tính miễn dịch
Bacteriocin có khối lượng phân tử lớn, thành phần cấu tạo là protein và nhiều
SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương có hoạt tính ức chế các loài vi khuẩn Gram
dương đôi khi nó cũng ức chế một số loài vi khuẩn Gram âm.
1.1.5.2 Cơ chế hoạt động
Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh
làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng
phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào.
Một loại bacteriocin là Lacticin 3147 có tác dụng diệt khuẩn trên những tế
bào nhạy cảm bởi sự tuong tác đầu tiên với thành tế bào. Đó là nguyên nhân mà trên
màng tế bào tạo ra những kênh cho K
+
và phosphate vô cơ đi ra khỏi tế bào. Trong
sự nổ lực để tái tích lũy lại những ion này, các ATP sẽ bị thủy phân. Khi ATP được
yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng trong tế bào, như gradient
pH tại màng tế bào , thì đã không còn nữa, những chức năng sẽ bị phá vỡ và tế bào
dần mất năng lượng và chết [13],[1].
Hình 1.3: Cơ chế hoạt động của bacteriocin(Nguồn Fidel Toldrá, 2009)
1.1.6 Sinh tổng hợp bacteriocin
Vì bacteriocin có bản chất là polypeptide nên sinh tổng hợp theo cơ chế của
sinh tổng hợp protein nhờ ribosome.
17 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
Trong tế bào vi khuẩn có mang các gene mã hóa cho các protein tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp bacteriocin. Qua quá trình phiên mã, dịch mã sẽ tạo ra
các protein đi vào giai đoạn tạo ra bacteriocin hoàn chỉnh, giải phóng nó ra khỏi tế
bào vi khuẩn. Tuy nhiên vì hoạt tính ức chế/tiêu diệt vi khuẩn của bacteriocin nên
nó cũng có thể tác động ngược trở lại lên vi khuẩn sản xuất ra nó, do đó vi khuẩn
sản xuất đòi hỏi phải có protein miễn dịch, giúp nó miễn dịch khỏi tác động của
với ribosome, tRNA đi vào quá trình dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, protein miễn
dịch
Sau khi quá trình phiên mã, dịch mã tạo ra pre-bacteriocin, dưới tác động
của các enzyme trong tế bào chất, pre-bacteriocin khi được giải phóng ra khỏi màng
tế bào được cắt bỏ leader peptide để tạo thành bacteriocin hoàn chỉnh có khả năng
kháng khuẩn và được vận chuyển ra khỏi màng thông qua hệ thống vận chuyển
ABC. Vai trò của leader peptide trong pre-bacteriocin là để bảo vệ vi khuẩn chính
nó khỏi tác động tiêu diệt của bacteriocin trong khi tạo ra nó.
Hình 1.4: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I (Nguồn P.Michael Davidson, 2005)
Mỗi nhóm bacteriocin sẽ có một cơ chế sinh tổng hợp khác nhau. Ở nhóm 1,
được tóm tắt như sau (hình 1.4 ):
1. Hình thành tiền bacteriocin
2. Tiền bacteriocin được biến đổi bởi LanB và LanC, được dịch mã thông
qua kênh vận chuyển ABC-transporter LanT, và được xử lý bởi LanP, kết
quả tạo ra được bacteriocin trưởng thành.
3. HPK nhận diện sự hiện diện của bacteriocin và tự động phosphoryl hóa.
19 SVTH: Nguyễn Thị Thảo Trang
4. Nhóm phosphoryl được truyền đến nhân tố đáp ứng điều hòa RR
5. RR phiên mã gen điều hòa.
6. Sản phẩm chất kháng khuẩn.
Hình 1.5: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II(Nguồn P.Michael Davidson, 2005)
Khác với nhóm I, ở nhóm II ban đầu sẽ hình thành bacteriocin và IF (một
peptide có cấu trúc giống bacteriocin nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn) do đó
HPK phải nhận diện IF để truyền tín hiệu đến RR để kích hoạt tiếp quá trình phiên
mã, tạo được bacteriocin hoàn chỉnh. (hình 1.5 )
1.2. Tôm hùm
thường phân bố ở độ sâu từ 20m trở lên, ở giai đoạn ấu trùng và con non chúng
thường phân bố ở các bãi rạn, đá san hô ở độ sâu từ 2 - 10m nước.
Tôm hùm thường sống ở các bãi rạng đá, rạng san hô nơi có nhiều hang hốc,
khe rãnh ven biển. Chúng có tập tính sống quần tụ chủ yếu là ở tầng đáy với chất
đáy sạch, không bùn. Ban ngày trú ẩn trong các hang đá ít hoạt động, ban đêm hoạt
động tích cực tìm mồi.
Tôm hùm sống thích hợp ở các vùng biển có độ mặn từ 30 -36 ‰, nhiệt độ
từ 25 – 32
o
C.
1.2.2 Tập tính
Tôm hùm là loại động vật ăn tạp, trong tự nhiên chúng ăn chủ yếu là các loại
động vật như: Cá, tôm, cua ghẹ, cầu gai, giáp xác nhỏ, nhuyễn thể, ngoài ra còn ăn
Copyright: Tài liệu đại học ©