TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





TIỂU LUẬN
CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME
Đề tài: Trình bày quá trình biểu hiện protein- enzyme tái tổ hợp ở nấm,
tế bào côn trùng, tế bào động vật có vú, động vật, thực vật
Giáo viên hướng dẫn: TS. Đặng Xuân Nghiêm
Sinh viên thực hiện : Trương Thị Thủy
Lớp : CNSH55A
MSV : 550404
A. Đặt vấn đề
Mặc dù các tế bào vi khuẩn biểu hiện thành công rất nhiều protein từ tế bào
nhân chuẩn, vẫn có những trường hợp protein tái tổ hợp được biểu hiện tốt nhất
ở các tế bào nhân chuẩn. Một số protein nhân chuẩn không bền hay bất hoạt sau
khi được biểu hiện ở vi khuẩn. Điều này đặc biệt đúng với những protein cần
sự biến đổi sau dịch mã (posttranslational modification). Có nhiều loại biến đổi
sau dịch mã ở nhân chuẩn xảy ra sau khi chuỗi polypeptide đã được tạo ra.
Chúng bao gồm:
(a) Biến đổi hóa học tạo thành amino acid mới trong chuỗi polypeptide.
(b) Hình thành cầu nối disulfide giữa hai gốc cysteine đúng (ví dụinsulin).
(c) Đường hóa (glycosylation), là quá trình thêm gốc đường vào các vịtrí nhất
định trên phân tử protein. Rất nhiều protein trên bề mặt tế bào được đường hóa
và sẽ không lắp ráp chính xác lên màng hay hoạt động chức năng được nếu
thiếu thành phần đường.
(d) Gắn thêm nhiều loại nhóm chức khác nhau như các chuỗi acid béo, các
nhóm acetyl, phosphate và sulfate.

(a) Nấm men có thể nuôi dễ dàng cả ở quy mô nhỏ lẫn các nồi lên men sinh học lớn.
(b) Sau nhiều ngàn năm sử dụng để lên men rượu bia và bánh mỳ, nấm men được
công nhận là sinh vật an toàn với con người. Chúng có thể được dùng để biểu hiện các
protein dùng trong y học mà không cần sự chấp thuận thêm của các nhà quản lý.
(c) Nấm men tiết rất ít protein. Do vậy nếu biến đổi gene để nó có thể sản xuất một
protein tái tổhợp tiết ra môi trường thì việc tinh sạch sẽ dễ dàng.
(d) Nấm men có thể được chuyển gene vào dễ dàng nhờ nhiều phương pháp khác
nhau sau khi đã phân hủy thành tế bào bằng enzyme hay các chất hóa học, hay tạo lỗ
nhờ sung điện.
(e) Nấm men có plasmid 2 micron tự nhiên để làm cơ sở cho việc thiết kế các vector
biểu hiện.
(f) Nhiều promoter của nấm men đã được nghiên cứu kỹ và có thể dùng để kiểm soát
việc biểu hiện protein tái tổ hợp.
(g) Mặc dù là sinh vật nhân chuẩn đơn bào nguyên thủy, nấm men vẫn thực hiện
nhiều quá trình biến đổi protein sau dịch mã đặc trưng cho sinh vật nhân chuẩn, như
thêm các gốc đường (quá trình glycosylation). Tuy nhiên nấm men chỉ đường hóa các
protein tiết. Protein tái tổhợp có thểthiết kế để được tiết bởi nấm men
(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the
genetic revolution. Academic Press)
II.2. Các hệ thống vector
Có nhiều vector sử dụng cho nấm men đã được tạo ra và thương mại hóa. Các vector
này đều sử dụng phương pháp chọn lọc khuyết dưỡng
Chúng có thể được chia thành 3 loại chính:
Các vector plasmid (YEp) được sửdụng nhiều nhất.
Các vector dung nhập vào nhiễm sắc thể nấm men (Yip)
Nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC).
1. YEp( yeast episomal plasmids )
Đặc điểm:
- Dựa vào plasmid 2µm

giới hạn
(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ
hợp”- Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ
thuật xuất bản năm 2007)
hp://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/YAC.php
Ứng dụng
Protein hỗn hợp cho người bây giờ đã được sản xuất nhờ nấm men Saccharomyces
cerevisiae. Chúng bao gồm insulin, yếu tố đông máu XIIIa, vài yếu tố sinh trưởng và
protein virus (từ HIV, viêm gan B, C, v.v.) được sử dụng như là các vacine hay trong
chuẩn đoán. Mặc dù nhiều protein tái tổhợp đã được biểu hiện thành công ở nấm
men, năng suất của chúng thường thấp.
(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the
genetic revolution. Academic Press)
Các khó khăn bao gồm:
(a) Sự thất thoát plasmid biểu hiện trong quá trình sinh trưởng trong các nồi lên men
lớn.
(b) Các protein được cho là sẽ được tiết thường bị giữ lại ở khoảng giữa màng và
thành tế bào chứ không thoát ra ngoài môi trường.
(c) Quá trình đường hóa protein thường quá đà và sản phẩm protein tái tổ hợp thường
có quá nhiều gốc đường để có thể hoạt động đúng
Vì sự biểu hiện trong S.cerevisiae có một số nhược điểm là :
- sự biểu hiện thấp năng suất không đáng kể
- sự gắn gốc đường không chính xác làm biến đổi chức năng và làm cho protein
tái tổ hợp có tình kháng nguyên
- protein tái tổ hợp thường bị giữ lại tại nhu chất do đó làm tăng thời gian và chi
phí để tinh sạch
- trong quá trình sinh trưởng S.cerevisiae sản sinh ra etanol là chất độc đối với tế
bào → giảm lượng protein tiết ra
vì vậy người ta tìm kiếm các hệ thống nấm men khác để khắc phục những nhược

Khi được nuốt bởi các côn trùng khác, polyhedrin bị dung giải nhờ quá trình tiêu hóa
và polyhedron tách ra. Quá trình này giúp giải phóng các hạt virus có thể xâm nhiễm
các tế bào côn trùng mới. Gene mã hóa polyhedrin có một promoter khỏe, và giai
đoạn muộn của quá trình dịch mã, protein polyhedrin được tạo ra với lượng rất lớn.
Do polyhedrin không thật sự cần thiết cho việc xâm nhiễm của virus vào tế bào côn
trùng nuôi cấy, polyhedrin promoter có thể được sử dụng để biểu hiện các protein tái
tổ hợp. Trình tự mã hóa cho polyhedrin được loại bỏ và thay bằng cDNA mã hóa cho
protein tái tổ hợp quan tâm. Có rất nhiều loại baculovirus khác nhau, và loại thường
được sử dụng nhiều nhất là MNPV (multi nuclear polyhedrosis virus). Virus này xâm
nhiễm rất nhiều tế bào côn
trùng và sinh sôi tốt ở nhiều dòng tế bào côn trùng nuôi cấy. Một dòng tế bào phổ
thông được sử dụng để nhân virus này lên là từ loài sâu fall armyworm (sâu keo-
Spodoptera frugiperda). Sản lượng của polyhedrin-và cũng là sản lượng của protein tái
tổhợp sử dụng polyhedrin promoter thường đặc biệt cao trong các dòng tế bào này.
(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology- applying
the genetic revolution. Academic Press)
II.2. Hệ thống vectoter biểu hiện baculovirut
DNA Vector
DNA 5’ Pp MCS Pt DNA 3’
AcMNPV AcMNPV
a. Cấu trúc một đơn vị biểu hiện của một vector chuyển nạp baculovirus(AcMNPV ),
MCS vị trí đa nhân dòng, Pp promoter gen polyheđrin,Pt trình tự kết thúc phiên mã
gen polyheđrin 5’,3’ DNA AcMNPV là trình tự khởi đầu và kết thúc phiên mã
Sự thay thế gen polyheđrin AcMNPV bằng một đơn vị biểu hiện từ một vector chuyển
nạp. Trao đổi chéo kép(x) giữa các đoạn DNA tương đồng của vector chuyển nạp và
hệ AcMNPV dẫn đến sự cài nhập của đơn vị biểu hiện vào bộ gen AcMNPV. GOI là
đoạn gen quan tâm
Các tế bào côn trùng sau khi được cấy AcMNPV tái tổ hợp sẽ tạo ra các vết tan trong
quá trình chọn lọc do do các tế bào được có AcMNPV tái tổ hợp thì gen polyheđrin bị

gen đích được chặn hai đầu bằng trình tự cài nhập và gen kháng ampiciline nằm
ngoài vị trí gắn
- và plasmid phụ trở gồm có các gen chuyển vị, và gen kháng tetraciline
các tế bào virus được biến nạp kép, đoạn DNA được chuyển vị vào vị trí gắn của
bacmit. Sự gắn kết của đoạn DNA plasmid cho với với đơn vị biểu hiện và gen kháng
gentamicine vào vị trí gắn của bacmit sẽ phá vỡ khung đọc của gen lacZ. Vì vậy,vi
khuẩn chứa bacmit tái tổ hợp tạo ra khuẩn lạc trắng trong môi trường có IPTG và
X-Gal, ngoài ra các khuẩn lạc trắng kháng với kanamicine và nhảy cảm với
ampiciline và tetraciline chỉ mang bacmit tái tổ hợp mà không mang plasmid cho hay
trở giúp.Sau tất cả các thao tác này, sự gắn kết của gen nhân dòng có thể được khẳng
định bằng PCR. Cuối cùng bacmit tái tổ hợp có thể được chuyển nhiễm vào các tế bào
côn trùng ở đây các gen nhân dòng được phiên mã và protein tái tổ hợp được tạo ra
(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”-
Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản
năm 2007)
QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA (glycosylation)
Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn được đường hóa sau dịch mã. Quá trình đường
hóa là cần thiết cho chức năng của một sốprotein. Một thuận lợi khi biểu hiện protein
tái tổ hợp của sinh vật nhân chuẩn ở tế bào côn trùng là chúng có một hệ thống/con
đường đường hóa. Con đường đường hóa sau dịch mã tại các amino acid arginine ở
động vật có vú và côn trùng là giống nhau khi thêm gốc manose. Tuy nhiên các con
đường chuyển hóa khác lại khác nhau. Tuy vậy, được đường hóa một phần còn hơn
không. Hiện nay đã có các dòng tế bào côn trùng khác đã được cải biến gene để biểu
hiện toàn bộcon đường đường hóa ở động vật có vú
Ứng dụng : sản xuất β-iterferol, rhodopsin ở bò, protein vỏ virus HIV-1, interleukin,
lipaza tủy người, kháng nguyên virus hợp bào hô hấp, phức hệ protein vận chuyển,
chấ hoạt hóa plasmid mô, các protein virus bại liệt…
(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the
genetic revolution. Academic Press)

Các yếu tố điều hòa dịch mã
Đa số các vector biểu hiện trong tế bào động vật có vú mang một gen duy nhất mã hóa
cho một polipeptit có chức năng. Tuy nhiên, dang hoạt động của một số proein quan
trọng trong thương mại chứa hai chuỗi protein khác nhau
Vd: hoocmon kích tuyến giáp ở người là một protein có hai chuỗi và cả hemoglobin
và các kháng thể đều có 4 tiểu phần
Có thể nhân dòng gen hay DNA bổ sung cho mỗi tiểu phần của một protein nhiều tiểu
phần tổng hợp và tích sạch mỗi tiểu phần một cách độc lập, và sau đó trộn với nhau
trong một ống nghiệm. nhưng tỉ lệ lắp ráp chính xác trong trường hợp này rất thấp.
ngược lại quá trình lắp protein dime và tetrae invivo lại rất tốt. vì vậy rất nhiều
phương pháp khác nhau được phát triển để sản xuất hai protein tái tổ hợp khác nhau
trong cùng một tế bào. Điều này được giải quyết theo ba cách:
1. Hai vector riêng biệt được sử dụng, mỗi vector mang gene mã hóa một tiểu phần

Tuy nhiên, thường xảy ra hiện tưởng mất một trong hai vector đối với tế bào chuyển
nhiệm kép. Ngoài ra, số lượng bản sao của hai vector không luôn được duy trì bằng
nhau, vì vậy gây ảnh hưởng đến sản lượng của sản phẩm cuối cùng
Để giải quyết vấn đề này các vector duy nhất mang hai gen nhân dòng đã được phát
triển
2. Một vector được sử dụng mang cả hai gene tách biệt mã hóa cho hai tiểu phần,
mỗi gene chịu sự điều khiển của một promoter riêng.
3. Một vector được sử dụng mang cả hai gene tách biệt mã hóa cho hai tiểu phần, cả
hai gen chịu sự điều khiển của một promoter ( vector bixistron) Có thể thực hiện
được điều này là do hai gen nhân dòng được tách biệt với nhau bằng trình tự
IRES (trình tự DNA chứa một vị trí gắn trong ribosom ), cho phép dịch mã đồng
thời các protein khac nhau từ một phân tử RNAtt. Sự phiên mã của cấu trúc “gen
α- IRES- gen β” được điều hòa bởi một promoter và một tín hiệu polyađenyl hóa.
Lưu ý rằng phân tử mRNA đó được dịch mã 2 lần bởi hai ribosome khác nhau
bám vào hai vị trí khác nhau (đầu 5’ bình thường và vịtrí IRES). Quá trình này
khác với dịch mã mRNA polycistronic ở vi khuẩn, nơi mà một ribosome duy nhất

vào con cái nhận ưu điểm tránh được tính cài ngẫu nhiên của gen chuyển
V. Hệ thống biểu hiện tái tổ hợp ở thực vật
V.1 Tế bào thực vật
Nuôi cấy tế bào thực vật đã được sử dụng để sản xuất các sản phẩm tự nhiên cách
đây hơn 20 năm và gần đây hơn chúng được dùng để sản xuất các protein tái tổ hợp.
Các tế bào thực vật rất thích hợp cho các nguyên liệu tái tổ hợp do chúng có thể sinh
trưởng trên môi trường tương đối đơn giản không cần bổ sung protein Nếu protein
ngoại lai được sản xuất trong nuôi cấy tế bào sẽ được tiết ra trong môi trường, nhiều
hơn phần được tích lũy trong tế bào, thì việc thu hồi và tinh sạch sản phẩm có thể
được tiến hành mà không có nhiều protein nhiễm bẩn. Các protein có nguồn gốc thực
vật an toàn cho người hơn các protein có nguồn gốc từ tế bào động vật bởi vì các chất
nhiễm bẩn và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người. Phương pháp
thường sử dụng là : Nuôi cây callus và nuôi cấy dịch huyền phù tế bào chứa các tế bào
và các khối tế bào, sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng .Nuôi cấy dịch huyền
phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế bào thực vật so với nuôi cấy
callus, do nuôi cấy dịch huyền phù có thể duy trì và được thao tác tương tự với các hệ
thống lên men vi sinh vật được ngập chìm trong môi trường lỏng
Một số protein tái tổ hợp được sản xuất bằng nuôi cấy tế bào thực vật
Proteinđượcbiểuhiện Loàithựcvật
Nhân tố sinh trưởng biểu mô người Nicotianatabacum
Hormone sinh trưởng ở người

N.tabacum
Albumin huyết thanh người
N.tabacum,Solanumtuberosum

Nhân tố sinh trưởng ở cá hồi N.tabacum
α-interferon người Oryzasativa
Hirudin(chống đông máu) N.tabacum
Erythropoietin người N.tabacum

Tùy vào mục đích sử dụng mà chúng ta có thể lựa chọn hệ thống vector biểu hiện ở
nấm men hoặc côn trùng hoặc động vật có vú để sản xuất protein có đầy đủ biến đổi
hậu dịch mã. Nhưng hệ thống biểu hiện trong tế bào côn trung đang là sự lựa chọn
hàng đầu vì những ưu điểm của nó