1

LỜI MỞ ðẦU
Listeria monocytogenes những năm gần ñây nổi lên như một tác nhân gây bệnh
từ thực phẩm quan trọng. ðây là một loại trực khuẩn Gram dương ngắn, nhỏ,
không sinh bào tử, thường có kiểu chuyển ñộng xoay tròn quanh trục thân thành
từng ñợt rất ñặc trưng trong tiêu bản giọt treo. Chúng có thể phát triển trên môi
trường nuôi cấy ñơn giản ở vùng pH giữa 5 và 9. Trên môi trường thạch rắn,
khuẩn lạc của chúng trông như những giọt sương trong suốt, hơi nhuốm màu lam
nhạt khi nhìn qua anh sang phản chiếu dưới góc 45
0
.
Về mặt sinh hóa Listeria monocytogenes dễ bị nhầm với những vi sinh vật như
Lactobacillus, Brochothrix, Erysipelothrix và Kurthia. Một số thử nghiệm sinh
hóa ñã ñược áp dụng ñể phân biệt Listeria monocytogenes với các loài Listeria
khác như Listeria innocua, Listeria welshimeri và Listerisamurrayi. Xác ñịnh
kiểu huyết thanh cũng là một cách ñịnh danh quan trọng ñối với vi sinh vật này.
Listeria thuộc loại ưa lạnh, có thể phát tirển ở nhiệt ñộ thấp ñến 2,5
0
C và cao ñến
44
0
C. Các chuyên gia FDA khuyến cáo cần lưu ý việc làm vệ sinh ống dẫn lạnh
trên trần vì ñó là nơi có ñiều kiện thuận lợi cho Listeria phát triển và tích tụ.
Liều lượng gây bệnh của Listeria monocytogenes hiện vẫn chưa ñược biết. Bệnh
bắt ñầu từ ñường tiêu hóa với những triệu chứng như tiêu chảy, sốt nhẹ. Trường
hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các ñại thực bào và gây nhiễm
trùng máu. Vi khuẩn tác ñộng lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể
xâm nhập vào bào thai trong bệnh mẹ gây sẩy thai, ñẻ non hoặc nhiễm trùng thai
nhi.
Listeria monocytogenes ñã ñược phân lập từ nhiều loại thực phẩm khác nhau như


CHƯƠNG I: MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề.
- ðất nước ta có nhiều ñiều kiện thuận lợi ñể phát triển ngành nuôi trồng
thủy hải sản. Bờ biển Việt Nam khá dài và rộng, lại nằm trong vùng giao
nhau giữa các dòng nước và có khí hậu nhiệt ñới nên trữ lượng hải sản rất
dồi dào và có giá trị kinh tế cao. Vì vậy, ngành ñánh bắt nuôi trồng thủy
hải sản ở nước ta không ngừng phát triển, không những ñáp ứng mhu cầu
trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường nước ngoài như: Trung Quốc,
ðài Loan, Hàn Quốc, Nhật, Mỹ, Anh…. Chất lượng vệ sinh thực phẩm
hiện nay ñang là mối quan tâm hàng ñầu khi xuất khẩu thực phẩm sang
các quốc gia khác, ñặc biệt là ñối với mặt hàng thủy hải sản ñông lạnh.
- Tuy nhiên, việc xuất khẩu thủy hải sản của nước ta ñang gặp khá nhiều
khó khăn và một trong nhửng vấn ñề ñó là việc nhiễm các tác nhân gây
bệnh, gây ñộc như: dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh…. và
Listeria monocytogenes là một trong những tác nhân gây bệnh và gây ngộ
ñộc trong sản phẩm thủy hải sản ñông lạnh.
- Trong vấn ñề ngộ ñộc thực phẩm, vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra
bệnh Losteriosis. Ca ñầu tiên của bệnh Listeriosis ñã ñược nói ñến cách
ñây 70 năm, nhưng phải ñợi ñến những năm 1980, vi khuẩn Listeria
monocytogenes mới ñược chính thức xác nhận là tác nhân gây ngộ ñộc từ
thực phẩm. Listeria monocytogenes hình thành nên các triệu chứng như;
sốt, khó chịu, ñau lưng. Nếu ñộc tố ñủ mạnh, chúng sẽ gây ra ngộ ñộc thực
phẩm cấp tính trong khoảng 12 giờ, với các triệu chứng như: nôn mửa,
tiêu chảy, ñau quặn bụng, nhức ñầu…
4

- Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn như vậy, chúng tôi quyết ñịnh thực hiện
ñề tài: “quy trình phát hiện Listeria trong thủy sản ñông lạnh”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu.

và các ñộng vất có vỏ khác ( bao gồm cả ñộng vật thân mềm và ñộng vật
giáp xác.).
- Việc thu hoạch thủy hải sản tự nhiên ñược gọi là ñánh bắt cá. Ngành ñánh
bắt cá và nuôi trồng thủy hải sản ñược biết ñến như là: nuôi biển, nuôi
trồng thủy sản, hoặc trong trường hợp của cá thì nuôi cá. Hải sản thường
ñươc phân biệt với thịt. Mặc dù, nó vẫn có một số tính chất của ñộng vật
và nó ñược loại trừ trong một số chế ñộ ăn chay. Hải sản là một nguồn
quan trọng trong việc bổ sung nguồn protein trong nhiều khẩu phần ăn
trên thế giới, ñặc biệt ở các vùng ven biển.
- Hiện có hơn 32000 loài cá ñược sử dụng làm nguồn thực phẩm cho con
người. Ví dụ như: cá ñối, cá chép, cá da trơn, cá chim lớn, cá trích, cá thu,
cá mè, cá cơm… và một số loài khác.
- Thủy hải sản ñông lạnh là thủy hải sản sạch ñược sơ chế, chế biến theo
quy trình nghiêm ngặt về vệ sinh an toàn thực phẩm. Quy trình sơ chế, chế
biến và ñưa ra sản phẩm theo phương pháp IQF ñưa ra sản phẩm ñông
lạnh với chất lượng tốt nhất. Ngay từ khâu nguyên liệu ñược tuyển chọn
kỹ lượng với chất lượng ñảm bảo và sau ñó sẽ ñược sản xuất trên dây
truyền vô trùng tuyệt ñối ñảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, từ ñó sẽ ñưa
ra các sản phẩm an toàn. Trước khi các sản phẩm ñó ñến tay người tiêu
6

dùng, chúng ñược kiểm tra bởi các cơ quan y tế và ñược cấp giấy phép vệ
sinh an toàn thực phẩm. Chính vì vậy, thực phẩm ñông lạnh là sản phẩm
có chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm rất cao.
2.1.2. Tình hình nhiễm khuẩn của thủy hải sản Việt Nam.
- Trong 3 mùa hè liên tiếp, Viện dinh dưỡng quốc gia ñã thực hiện ñề tài
nghiên cứu: “Thực trạng ô nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm thủy hải sản
ñông lạnh và chế biến trên ñịa bàn Hà Nội”. Kết quả kiểm tra vi sinh vật
tại phòng thí nghiệm 300 mẫu thực phẩm thủy hải sản ñông lạnh và chế
biến sẵn (ñược lấy ngẫu nhiên) từ một số chợ và siêu thị trong 6 quận

có 13 trường hợp ngộ ñộc do ăn phải tảo ñỏ Polycavemosa tsudai, có 3
trong số ñó bị chết.
- Năm 2004 ñã có 53 cảnh báo về vượt quá giới hạn sulphit trong tôm.
Trong ñó mặt hàng tôm chín chiếm 31 cảnh báo, ñây cũng là mặt hàng có
quy ñịnh sulphit nghiêm ngặt nhất (không quá 50 miligram/kg tôm). Quy
ñịnh này cũng có nghĩa là: mặc dù, nếu một nhà chế biến thực phẩm tuân
thủ nghiêm các tiêu chuẩn ñối với tôm nguyên liệu, nhưng sau khi nấu
chín tôm thì công ty này vẫn có thể vi phạm giới hạn tiêu chuẩn (do giới
hạn quy ñịnh ñối với tôm chín thấp hơn rất nhiều).
- Năm ngoái, ñã có 41 trường hợp bị Rasff cảnh báo lây nhiễm loại vi khuẩn
Listeria monocytogenes. Trong ñó, cá hồi xông khói của ðan Mạch bị
cảnh báo 19 lần và cá hồi của ðức bị 10 lần.
8

- Cũng theo hệ thống cảnh báo của Rasff, năm ngoái có 39 cảnh báo về sự
xuất hiện của Histamin trong thủy sản. Trong ñó, cá ngừ chiếm 31 cảnh
báo và hầu hết là mặt hàng ướp lạnh, sau khi nhập khẩu ñã ñược ñóng túi
chân không ở Hà Lan. Nước bị cảnh báo nhiều nhất là Inñônêxia.
- Các thanh tra của Italia cũng ñã phát hiện và cảnh báo 41 lần về việc lây
nhiễm ký sinh trùng (Anisakis), chủ yếu trong cá thu tươi xuất xứ từ Nauy,
ðan Mạch, và cá vây chân từ Anh.
- Cảnh báo về dư lượng Cactimi trong thủy hải sản chiếm 43 lần, ít hơn một
nửa so với số lượng cảnh báo hồi năm 2003 (103) lần, và chủ yếu liên
quan ñến các sản phẩm cá kiếm và nhuyễn thể chân ñầu. Số lần cảnh báo
về lây nhiễm thủy ngân trong cá kiếm năm 2004 là 30 lần, tăng nhẹ so với
năm 2004.
2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Listeria monocytogenes.
2.2.1. Lịch sử phát hiện.
nhiễm Listeria trên người ñã thực hiện. Tuy nhiên, phải mất thêm ba thập
kỷ nữa, sau hàng loạt các báo cáo dịch ñược công bố mới thấy, nghiên cứu
về Listeria monocytogenes từ chỗ tương ñối bế tắc ñã trở nên sáng sủa
hơn. Từ ñó tới nay, chủ ñề này ñã thu hút ñược sự quan tâm nghiên cứu
của nhiều chuyên ngành, không chỉ bởi vì tầm quan trọng của Listeria
monocytogenes với sức khỏe cộng ñồng, mà còn là vì, vi khuẩn này ñã trở
thành một mẫu hình nghiên cứu thực nghiệm cho hiện tượng ký sinh nội
bào không bắt buộc.
2.2.2 Phân loại.

Hình 2.2. Vi khuẩn Listeria monocytogenes
- Loài khuẩn giống Listeria là những vi khuẩn hình que Gram dương, ngắn,
chúng kỵ khí, dương tính với catalase, âm tính với oxidase, di ñộng ở 20-
25
0
C và không di ñộng ở 37
0
C.
- Phân loại học của Listeria.spp trong giới vi sinh vật như sau:
 Thuộc giới: Bacteria.
 Ngành : Fitmicutes.
 Lớp: Bacilli.
11

 Bộ: Bacillales.
 Họ: Listeriaceae.
 Giống: Listeria.
- Hiện tại có 7 loài Listeria ñược công nhận:
 Listeria monocytogenes.
 Listeria ivanovii.

ñể ñảm bảo cho sự thành lập một chi mới, Murraya, nhưng ngày nay ñược
xếp thành một loài duy nhất Listeria grayi. Gần ñây, Listeria ivanovii
ñược chia thành hai loài phụ là: subsp.ivanovii, và subsp.londonniensis.
Trong số các loài không thuộc “monocytogenes” chỉ duy nhất Listeria
ivanovii ñược xác ñịnh là tác nhân gây bệnh trên người.
2.2.4. ðặc ñiểm hình thái và kháng nguyên.
- Các loài Listeria là trực khuẩn Gram dương có kích thước ngắn (0.4-
0.5×0.5-2.0 µm). Chúng mọc trên các môi trường nuôi cấy không acid,
không sinh nha bào. Ở 20
0
C, chúng chỉ di ñộng bằng lông mọc xung
quanh than, nhưng sự di ñộng không quan sát ñược ở 37
0
C. Chúng là vi
khuẩn kỵ khí không bắt buộc và có thể mọc trên khoảng nhiệt ñộ dao ñộng
từ 0-45
0
C ( tối ưu là 30-36
0
C), mặc dù tốc ñộ mọc ở nhiệt ñộ thấp là chậm.
Chúng cũng mọc trên một khoảng pH dao ñộng rộng, một số chủng có thể
mọc ở pH 9.6, nhưng ñạt ñiều kiện tối ưu ở môi trường trung tính hoặc hơi
kiềm.
13

- Kháng nguyên chính của các loài Listeria là kháng nguyên thân (O) và
kháng nguyên lông (H).Quy trình ñịnh type huyết thanh hiện nay dựa trên
các kháng nguyên này, ñã phân loại ñược 6 nhóm huyết thanh (1/2, 3, 4, 5,
6 và 7) và phân loại sâu hơn thành các serovar cho tất cả các loài trừ
Listeria grayu và Listeria invanoii. Trong khi Listeria invanoii và Listeria

-

-
+

W

-
+

-

-
-

-

-
-

-

-
-

-

-
14-
-

+
+
-
+
-
-

-
+
-
-
+
-

-
V
V
-

mã hóa bởi vi khuẩn này mang ñộ tương ñồng rất cao so với Bacillus
subtilis. Listeria monocytogenes có mức ñộ ña dạng thường ở nhiều quần
thể, do vậy,chúng có tới 331 gen mã hóa cho các protein vận chuyển khác
15

nhau (11,6% trong số tất cả các gen dự kiến) và 209 các vị trí ñiều hòa quá
trình dịch mã ñược tìm thấy trên loại vi khuẩn này.
- Khoảng 0-79% các chủng Listeria monocytogenes có chứa plasmid này ở
dạng ẩn, sự ñề kháng với cadmium là hiện tượng phụ thuộc plasmid và các
plasmid ñặc hiệu cho hiện tượng ñề kháng với một hoặc nhiều loại kháng
sinh ñã ñược ghi nhận. Plasmid thường thấy trong các chủng Listeria
monocytogenes thuộc nhóm huyết thanh 1.
2.2.5.2. Cấu trúc tế bào.
- Nhân: là vùng nhân nguyên thủy, chưa có màng nhân nên không có hình
dạng cố ñịnh vì vậy còn gọi là vùng nhân.
- Ribosome: nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng của
tế bào chất. Ribosome gồm hai tiểu phần ( 50S và 30S), hai tiểu phần này
kết hợp với nhau tạo thành ribosome 70S.
- Lông ( khuẩn mao ): là những sợi lông rất mảnh, chúng có tác dụng giúp
vi khuẩn bám vào giá thể.
- Màng tế bào: Màng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid (PL) chiếm 30 – 40% khối
lượng của màng, các protein chiếm 60 -70% khối lượng các màng. ðầu
phosphate của PL tích ñiện phân cực, ưa nước. ðầu hydrocacbon không tích
ñiện, không phân cực, và có tính kỵ nước.
16Hình 2.3. Màng tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes.
- Chức năng chủ yếu của màng.
- Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao ñổi chất.

2.2.6. Yếu tố ñộc lực.
2.2.6.1. Tổ hợp gen của Listeria monocytogenes.
_ Gen prfA (prfA): hoạt hoá quá trình lây lan cho tế bào chủ của vi khuẩn.
_ Gen plcA (PI-PLC) (phosphatidy linocitol-specific phospholipase C) là
protein ñược mã hoá bởi gen plcA,33kDa), có tác dụng dung giải màng
không bào của thể thực bào.
_ Gen plcB(PC-PLC) (phosphatidulcholine-spefic phospholipase C, là
protein ñược mã hoá bởi gen pclB, 29kDa):, có tác dụng dung giải màng
không bào của thể thực bào.
_ Gen hly (LLO là protein ñược mã hoá bởi gen hly, 58.5kDa), có tác dụng
giải phóng vi khuẩn ra khỏi lkhông bào của tế bào chủ.
_ Gen mpl (Mpl metallprotease ñược mã hoá bởi gen mpl,60kDa) là gen
chứa 510 amino axit, có vai trò tham gia vào quá trình hoạt ñộng của gen
plcB.
_ Gen actA ( AtcA là protein ñược mã hoá bởi gen ACTa,97kDa) có chức
năng giúp vi khuẩn lây lan từ tế bào này sang tế bào khác.
_ Gen inlA (InlA là protein ñược mã hoá bởi gen inlA, 80kDa). Protein InlA
ảnh hưởng mạnh tới internalin khác, xoá bỏ inlA thì sẽ dẫn tới biểu hiện
inlB cao hơn, có chức năng nội bộ hoá tế bào chủ.
_ Gen inlB (InlB là protein ñược mã hoá bởi gen inlB, 67kDa), có chức
năng nội bộ hoá tế bào chủ.
_ Trong ñó gen prfA có vai trò như yếu tố ñiều hoà chính nhằm ổn ñịnh hoạt
ñộng của các gen plcA, plcB, hly, mpl, actA, inlA, inlB. Ngoài ra, còn có
gen hly mã hoá protein tạo ra sản phẩm Listeriolysin O (LLO) là tác nhân
gây bệnh Listeriosis ở người và ñộng vật, plcA mã hoá tạo PI-PLC và gen
19

plcB mã hoá tạo PC-PLC, gen inlA ,mã hoá cho internalin A, gen inlB mã
hoá cho internalin B, gen inlC mã hoá cho internalin C. tất cả các gen này
ñều phụ thuộpc vào gen prfA.

InlB nhận diện Clq-R ( hoặc Met) cho phép Listeria monocytogenes xâm
nhập vào trong nhiều loại tế bào của vật chủ. Sauk hi xâm nhiễm ñược vào
tế bào vật chủ, Listeria monocytogenes phân giải không bào tạo ra các lỗ
trên màng tế bào và hoạt giải ñộc tính lưu huỳnh PI-PLC kết hợp với PC-
PLC, giúp LLO phân giảikhông bào.

21Hình 2.5. Cơ chế xâm nhập vào tế bào của vi khuẩn Listeria monocytogenes.
22

_ Sau khi phân giải không bào, Listeria monocytogenes ñược phóng thích
vào cytosol, tại ñây chúng phát triển và nhân lên, trong giai ñoạn này ñòi
hỏi phải có protein bề mặt khác như ActA ñể nó di chuyển từ tế bào này
sang tế bào khác, và tổng hợp actin. ðuôi actin cho phép vi khuẩn xâm
nhập vào tế bào chủ khác, nó phụ thuộc vào hoạt ñộng của PC-PLC và
Mpl.
2.2.7. Bệnh và triệu chứng của bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes”
gây ra.
2.2.7.1. Bệnh do vi khuẩn “Listeria monocytogenes” gây ra.
- Nhiễm Listeria ở phụ nữ mang thai:
 Hội chứng này xuất hiện trong khoảng một phần ba các trường hợp nhiễm
Listeria mặc dù tỷ lệ này có thể cao hơn nhiều trong các ñợt dịch. Hầu hết
các trường hợp nhiễm khuẩn ñều xãy ra vào 3 tháng cuối của thai kỳ. ða
số phụ nữ mang thai bị nhiễm Listeria monocytogenes có dấu hiệu: sốt ,
mệt mỏi và ñau lưng, có khi thấy bị tiêu chảy, ñau bụng, buồn nôn hoặc
nôn trong suốt thời kỳ nhiễm khuẩn. Vi khuẩn có thể lây truyền qua rau
thai dẫn ñến nhiễm khuẩn tử cung, viêm màng ñệm và màng ối, sinh non,
hoặc bệnh khởi phát ở giai ñoạn sớm ở những trẻ mới sinh. Phụ nữ nhiễm

khởi phát muộn. Bệnh khởi phát muộn hay có viêm màng não hoặc viêm
não màng não (ở 90% các trường hợp). Khởi phát muôn thường âm thầm
hơn so với thể bệnh khởi phát sớm với những triệu chứng thường gặp như
trẻ bú kém hoặc bỏ bú, khó chịu và sốt.
24

- Nhiễm Listeria ở người trưởng thành.
 Nhiễm Listeria ở người trưởng thành thường gặp trên các bệnh cảnh suy
giảm miễn dịch, ñặc biệt khi hệ miễn dịch của tế bào bị suy giảm như
trong u hệ lympho, các hệ thống ñiều trị chống thải ghép trong các ca ghép
cơ quan nội tạng hoặc ghép tủy xương tự thân hoặc cùng loài, khi ñó bệnh
xãy ra ñiển hình dưới dạng một biến chứng muộn. Ngay trong thời kỳ ñầu
của ñại dịch AIDS, Listeria monocytogenes không ñược coi là tác nhân
gây bệnh quan trọng với bệnh nhân nhiễm HIV, và có một số ý kiến giải
thích khá thuyết phục cho hiện tượng này như hoạt tính kháng Listeria của
cotrimoxazole ñược dùng trong ñiều trị dự phòng nhiễm Pneumocystis
jiroveci trước ñó. Những nghiên cứu gần ñây lại cho thấy, nhiễm Listeria
xãy ra ở bệnh nhân dương tính với HIV cao hơn 150-300 lần so với nhóm
ñối chứng. Những bệnh mạn tính khác như nghiện rượu và tiểu ñường
cũng là ñiều kiện thuận lợi cho việc lây nhiễm Listeria monocytogenes.
 Nhiễm Listeria tiến triển ở người trưởng thành có thể ñược xếp thành ba
nhóm tùy theo các biểu hiện lâm sàng: bệnh liên quan ñến hệ thống thần
kinh trung ương (CNS) chiếm khoảng 75% các trường hợp, nhiễm khuẩn
huyết nguyên phát và nhóm các loại khác bao gồm phổ rộng các loại
nhiễm trùng tại chỗ.
- Nhiễm khuẩn hệ thần kinh:
 Viêm màng não có hoặc không có dấu hiệu thần kinh cục bộ là biểu hiện
hay gặp nhất của nhiễm Listeria hệ thần kinh trung ương. Giống như các
trường hợp viêm màng não mủ khác, viêm màng não do Listeria thường
khởi phát cấp tính với sốt cao, cứng gáy và sợ ánh sáng, nhưng có thêm