I HC M TP. HCM

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHP

 tài:
SÀNG LC VI KHUN VÙNG R CÓ KH
NG VÀ
KHÁNG NM GÂY BNH
COLLECTOTRICHUM SP. CHO CÂY T
KHOA: CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGH VI SINH

GVHD: ThS Nguyn Thanh Thun
ThS Nguy
SVTT: Lê Th Yn Nhi
MSSV: 1053010532
Khóa: 2010  2014
Tp. H Chí Minh, Tháng 06 Nm 2014

LI CM N
 hoàn thành đ tài này, em xin gi li cm n đn các Thy Cô khoa Công Ngh
Sinh Hc, trng i hc M thành ph H Chí Minh đã ging dy và truyn đt
kin thc cho em trong sut nhng nm va qua đ em làm tt đ tài khóa lun này.
Em xin gi cm n sâu sc ti thy Nguyn Vn Minh đã tn tình hng dn, ch
bo em trong sut thi gian em thc hin đ tài. Em xin cm cô Dng Nht Linh,
ngi đã truyn đt cho chúng em nhiu kinh nghim quý báu.
Em xin cm n anh an Duy Pháp, ch Võ Ngc Yn Nhi và ch Nguyn Th M
Linh, nhng ngi anh, ngi ch luôn ng h, giúp đ em trong lúc làm đ tài.

KHÓA LUN TT NGHIP DANH MC
SVTH: LÊ TH YN NHI ii
DANH MC HÌNH NH
Hình 1.1: Hình nh t bào (a) và khun lc (b)ca vi khun Bacillussubtilis 13
Hình 2.1: Vòng kháng nm bng phng pháp khch tan đa 37
Hình 3.1: Quan sát đi th khun lc trên môi trng NA 53
Hình 3.2 Quan sát vi th vi khun di kính hin vi x100 55
Hình 3.3: Mt s mu bnh thu thp đc 56
Hình 3.4: Quan sát đi th nm trên môi trng PDA 57
Hình 3.5: Bào t nm bnh quan sát di kính hin vi quang hc 57
Hình 3.6: Triu chng bnh thán th trên qu t đc lây bnh nhân to 58
Hình 3.7: Khun lc chng T7 mc trên môi trng Ashby 60
Hình 3.8: Phn ng màu gia thuc th Nesler’s vi lng NH
3
sinh ra t các chng vi
khun 63
Hình 3.9: Phn ng màu gia thuc th FeCl
3
-H
2
SO
4
và IAA sinh ra bi vi khun 66
Hình 3.10: Kh nng phơn gii Ca
3
(PO
4
)
2
trong môi trng Pikovskaya 68

)
2
67
Bng 3.8: Nng đ phospho do các chng vi khun hòa tan đc 68
Bng 3.9: Kt qu kh nng kháng vi nm gây bnh ca vi khun vùng r 71
Bng 3.10: ng kính vòng kháng nm gây bnh ca vi khun vùng r cây t 72
Bng 3.11: Kt qu đnh danh sinh hóa chng T7 74
Bng 1.12: Kt qu đnh danh chng T16 75
Bng 3.13: Kt qu đnh danh chng B21 75
Bng 3.14: Kt qu đnh danh chng B6 76
Bng 3.15: Kt qu tng trng ca cây t 78
KHÓA LUN TT NGHIP DANH MC
SVTH: LÊ TH YN NHI v
DANH MC BI
Biu đ 3.1: Nng đ NH
3
ca các chng c đnh đm 62
Biu đ 3.2: Nng đ IAA ca vi khun 65
Biu đ 3.3: Nng đ phospho hoà tan ca vi khun 69
Biu đ 3.4: ng kính kháng nm gây bnh 72
Biu đ 3.5: Chiu cao cây ca các nghim thc 79
Biu đ 3.6: Khi lng ti, khi lng khô ca các nghim thc 79
Biu đ 3.7: Ch s GPE ca các nghim thc theo phn trm 80

KHÓA LUN TT NGHIP DANH MC
SVTH: LÊ TH YN NHI vi
DANH M
S đ 2.1: B trí thí nghim 23
S đ 2.2: Quy trình phân lp 24
S đ 2.3: Quy trình đnh lng NH

2.3.1 Thit b 20
2.3.2 Dng c 21
2.3.3 Môi trng và hóa cht 21
KHÓA LUN TT NGHIP MC LC
SVTH: LÊ TH YN NHI viii
2.4 U 22
2.4.1 B trí thí nghim 22
2.4.2 Phng pháp ly mu và làm thun 23
2.4.3 Tin hƠnh quan sát đi th và vi th 25
2.4.4 Xác đnh hot tính kích thích tng trng ca vi khun vùng r
28
2.4.5 Phng pháp thng kê s liu 38
2.4.6 nh danh 38
2.4.7 Thí nghim kho xác kh nng kích thích tng trng trên cây t
46
PHN 3: KT QU VÀ THO LUN 50
3.1 KT QU PHÂN LP 51
3.1.1 Quan sát đi th 51
3.1.2 Quan sát vi th 53
3.1.3 Kt qu phân lp và lây bnh nhân to nm Collectotrichum sp. trên
t 56
3.2 KT QU KH NG 58
3.2.1 Kh nng c đnh nit phơn t 59
3.2.2 Kh nng sinh IAA 63
3.2.3 Kh nng hòa tan Ca
3
(PO
4
)
2

trong các cây h đu, thúc đy vi khun c đnh đm sng t do, tng cng cung cp
các cht dinh dng khác nh: P, S, Fe, Cu, sn xut kích thích t thc vt, tng
cng vi khun hoc nm có li, kim soát các bnh nm, vi khun và góp phn kim
soát côn trùng gây hi (Saharan, 2011). Nhiu loài vi khun vùng r nh:
Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter, Alcaligenes,
Arthrobacter, Burkholderia, Bacillus và Serratia đư đc báo cáo lƠ giúp tng cng
s tng trng thc vt (Joseph và cs, 2007). Có rt nhiu nghiên cu chng minh kh
nng kích thích tng trng ca vi khun vùng r đi vi cây trng: nghiên cu ca
Kloepper và cs (1980) cho thy kh nng kích thích tng trng ca thc vt qua vi
khun vùng r nh to ra siderophores c ch nm bnh, Ahmad (2005), Egamberdieva
(2008), đư có nhng nghiên cu cho thy kh nng to hormone kích thích tng trng
t nhng vi khun vùng r Pseudomonas, Azotobacter. Yadegari và cs (2010) ch ra
kh nng c đnh đm trên cơy đu cô ve (Phaseolus vulgaris) ca PGPR.
t (Capsicum) là cây gia v quan trng nht trên th gii (Burt, 2005). Trong s
các cây trng thuc h cà (Solanaceae), cây t có tm quan trng th 2 ch sau cây cà
chua. Nhiu thành phn trong qu t có giá tr dinh dng quan trng, làm gia v, mùi
thm vƠ mƠu sc. Trong qu t có cha nhiu vitamin C hn so vi qu thuc h cây
có múi và cha nhiu vitamin A hn so vi c cà rt. (Tài liu Nông nghip, 2013)
Tuy nhiên, cơy t thng chu s tn công ca nhiu đi tng bnh hi. Trong
đó, bnh thán th gơy ra bi loƠi nm Colletotrichum sp., (Isaac, 1992), bnh cht r vƠ
thi gc do nm Phytophthora capsici gây ra (Nguyn Vnh Tng và cs, 2008). Tác
KHÓA LUN TT NGHIP T VN 
SVTH: LÊ TH YN NHI 2
nhân kim soát nm bnh ph bin hin nay là x dng các thuc hóa hc nh:
Benlate, Topsin M 70WP, Score 250ND (V Triu Mn, 2007). Tuy nhiên,vic s
dng hóa cht trong sn xut không ch làm mt tính an toàn, mà còn phá v s cân
bng sinh hc trên đng rung, va gây ô nhim môi trng, va lƠm gia tng chi phí
đu t
Nhiu nghiên cu cho thy s dng PGPR có th kim soát đc các nm bnh
trên hiu qu: nghiên cu ca Lamsal vƠ cs (2012), đư chng minh kh nng kim soát


KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN TÀI LIU
SVTH: LÊ TH YN NHI 5
1.1 CÂY T VÀ BT
1.1.1 c v cây t
Cây t thuc h cà (Solanaceae) có ngun gc t Nam M, có hai nhóm ph bin
là t cay (Capsicum annuum L.) và t không cay (Capsicum annuum var. grossum). t
cay đc trng  nhiu tnh, thành trong c nc, ph bin nht là: Hi Dng, Hi
Phòng, các tnh min Trung và thành Ph H Chí Minh (Hóc Môn, Bình Chánh). t
ngt đc trng nhiu  Vnh Phúc, HƠ Ni vƠ Ơ Lt-Lơm ng. (Lê Th Thanh
Thy và cs, 2008)
t là cây thân tho, chu hn tt hn các cơy h cƠ khác nh: cƠ chua.  m đt
di 70% thì qu b cong, mt qu xù xì, không mn mt. Cây t sinh trng phát trin
tt  nhit đ 21-27
o
C. ( Tp chí Nông nghip Vit Nam, 2013)
Cây t hay đc trng quanh nm, nhng vƠo mùa ma cơy t hay b bnh, đin
hình là bnh héo r thi qu làm nh hng ln ti nng sut và phm cht t. Cho đn
nay cha có bin pháp hu hiu nào có th ngn chn và phòng tr bnh này. S dng
phân bón, thuc hóa hc bo v thc vt đi vi cây t làm gim đc sâu bnh nhanh
chóng nhng gơy nh hng xu đn môi trng và sc khe cng đng. (Lê Th
Thanh Thy và cs, 2008)
1.1.2 Bt
 Phân b
Bnh thán th (Colletotrichum nigrum Elet Stal) hoc (Colletotrichum capsici
Bul and Bis) là bnh nguy him, gây thi qu t hàng lot. Bnh rt ph bin  rt
nhiu nc trên th gii, đc bit là nhng nc có khí hu nhit đi. Bnh gây hi
nng trên hu ht các vùng trng t  nc ta. Tt c các vùng trng t tp trung thuc
Hà Ni, Bc Giang, Hi Dng, Hng Yên, Thái Bình, HoƠ Bình, Ngh An, Thanh
Hoá, Qung Bình, Qung Tr, Tha Thiên Hu đu b bnh này phá hoi nng. T l

bên trong. Bào t phân sinh ca hai loi nm này ny mm trong nc sau 4 gi, nhit
đ thích hp cho nm gây bnh là 28-30
o
C. Bnh phát trin mnh trong điu kin nhit
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN TÀI LIU
SVTH: LÊ TH YN NHI 7
đ cao, m đ cao. Bào t phát tán nh gió và nh côn trùng. Bnh gây thit hi ln
trong nhng nm ma nhiu.  nc ta, bnh phát trin mnh vào tháng 5-7 khi cây t
đang thi kì thu hoch qu. Bnh còn gây hi vƠo giai đon sau thu hoch trong quá
trình bo qun và vn chuyn.  nhng rung bón đm nhiu, mt đ trng cao bnh
nng. Ging t chìa vôi Hu và sng bò nhim bnh nng hn các ging ch thiên và
mt s ging Thái Lan nhp ni. Nm tn ti trên ht ging di dng si nm và bào
t phơn sinh vƠ trên tƠn d cơy bnh. Bào t phân sinh có sc sng cao, trong điu kin
khô mc dù tƠn d b vùi trong đt vn có th ny mm vào v sau. (V Triu Mn,
2007)
 Bin pháp phòng tr
Tiêu dit ngun bnh. Dn sch tƠn d cơy bnh, chn ht ging khe, sch bnh.
X lý ht ging vi nc nóng 52
o
C trong 2 gi hoc KMnO
4
0,1% t 1 -2 gi hoc
vi các loi thuc tr nm.
Luân canh vi cây trng khác h. B trí mt đ trng thích hp. Dit côn trùng
hi qu. Khi bnh xut hin có th phun mt vài loi thuc sau: Benlate 50WP 1 kg/
ha; Topsin M 70WP 0,4 ậ 0,6 kg/ ha; Score 250ND 0,5 lít/ ha. (V Triu Mn, 2007)
1.2 MT S VI KHUN VÙNG R
1.2.1 Khái nim vùng r
Vùng r lƠ vùng đt nh hng đn r cơy, lƠ ni mƠ hot đng tng tác gia vi
sinh vt và cây trng din ra mnh m. Nhng tng tác nƠy có th nh hng đáng k

(Maheshwari, 2011)
Hu ht các vi khun có ích nh Rhizobium, Bradyrhizobium, và Azospirillum
tng hp IAA qua đng Indole-3-pyruvic acid (IPyA). Mt vài vi khun gây bnh
nh Pseudomonas syringae, Agrobacterium tumefaciens, và Erwinia herbicola tng
hp IAA theo đngindole-3-acetamide (IAM). (Maheshwari, 2011)
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN TÀI LIU
SVTH: LÊ TH YN NHI 9
IAA là mt hormon quan trng đc sn xut bi mt s PGPR, có rt nhiu
nghiên cu đư chng minh rng khi cây trng đc x lý vi IAA do PGPR sn xut s
gia tng s phát trin. Vic  vi khun Bacillus RC23, Paenibacillus polymyxa RC05,
B. subtilis OSU142, Bacillus RC03, Comamonas acidovorans RC41, B. megaterium
RC01, B. simplex RC19 vi trƠ đư lƠm gia tng t l r so vi đi chng do vi khun
có kh nng sinh IAA. (Maheshwari, 2011). Mt nghiên cu khác cho thy
Azospirillum không ch có kh nng c đnh đm mà còn có kh nng sn xut IAA.
Các chng Azospirillum đc nghiên cu cho thy rng sn phm IAA ph thuc vào
môi trng nuôi cy và tin cht tryptophan. (Lim, 2010)
 Hòa tan phospho
Phospho là ngun dinh dng ch yu nh hng đn s phát trin ca cây trng.
Dù trong đt rt giƠu phosphate nhng cơy trng hu nh cng không th s dng đc
do mt lng ln phospho tn ti di dng không tan. Bao gm các dng phospho
hu c tn ti trong xác bã thc vt và trong vi sinh vt, phospho vô c thng là
nhng phosphate nh phosphate canxi, phosphate st, phosphate nhôm, thng  dng
khó tan. Các dng phospho vô c vƠ hu c nƠy, cơy trng không th hút trc tip
đc, chúng phi chuyn hóa thành các dng d tan thì cây trng mi hp thu đc.
Vi khun phân gii phosphate sng ph bin  vùng r có th khc phc vn đ
trên bng cách tit ra các acid hu c vƠ enzym phosphatase chuyn phosphate không
tan thành phosphate hòa tan (ion monobasic vƠ dibasic) đ cây trng có th s dng.
ng vt n thc vt và bin phospho hu c thc vt thành phospho hu c đng vt.
(Maheshwari, 2011)
Vi sinh vt s bin đi lân thành dng mui ca acid phosphoric Di dng

có liên quan mt thit đn s sn sinh acid
trong quá trình sng ca VSV. Tác dng vi mt trong bn loi acid: H
3
PO
4
, H
2
CO
3
,
HNO
3
, H
2
SO
4
, trong đó H
2
CO
3
rt quan trng. Chính H
2
CO
3
đư lƠm cho Ca
3
(PO4 )
2

phân gii. (Bc Lan Phng, 2004)

trình tng hp enzyme nitrogenase. Nitrogenase là h enzyme xúc tác cho phn ng
kh N
2
thành NH
3
. Nh vy, h thng gen nif đc xem là h thng gen điu khin cho
quá trình c đnh đm sinh hc.
Ngày nay nhiu nhà nghiên cu khoa hc đư chng minh NH
3
va là sn phm
ca quá trình c đnh nit phơn t va là nhân t điu hoà hot tính ca enzyme
nitrogenase. Khi NH
3
tích ly đn mt nng đ nht đnh thì nó lƠm đình ch tc khc
hot đng ca nitrogenase. Kiu điu hoƠ nh vy gi lƠ “ iu hoà liên h ngc”.
Tuy nhiên NH
3
không tham gia điu hoà trc tip mà thông qua mt protein khác là
enzyme glutamin synthetase. Khi môi trng có nhiu NH
3
thì enzyme này b adenin
hoá nên  trng thái bt hot. Ngc li môi trng vi nng đ NH
3
thp hoc không
có thì không b adenin hoá và enzyme s  dng hot đng. Khi  trng thái hot đng
nó s hot hóa h gen chu trách nhim tng hp nitrogenase. (Bch Lan Phng,
2010)
 Sn xut các hp cht kháng nm gây bnh trên cây trng
Trên th gii, các loi nm nh: Colletotrichum sp., Rhizoctonia solani, Pythium,
Rhizopus, Fusarium đư vƠ đang gơy thit hi nghiêm trng đi vi nng sut ca nhiu

chín mm bnh đc kim tra in vitro, vƠ sau đó đc khng đnh rng có kh nng
kích thích tng trng cây trng. T nm 1990, Bacillus spp. đư đc phát trin nh
mt tác nhân kim soát nm bnh trên cây trng. Vi khun thuc chi Bacillus có kh
nng sn xut kháng sinh nh enzym phơn gii vách t bào nm: chitinase, cellulase,
amylase, glucanses,…Hu ht các kháng sinh lƠ các đon peptide có kh nng chng
li vi khun Gram (-), Gram (+) và nm. Vài loài Bacillus sn xut các đon peptide
vòng nh: iturin, fengycin, bacillopeptin và surfactin. Iturin và fengycin có hot tính
kháng nm mnh và nh hng đn s phát trin ca mt dãy rng các mm bnh.
(Maheshwari, 2011)
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN TÀI LIU
SVTH: LÊ TH YN NHI 13
Pseudomonas c trú trong đt, nc và trên b mt cây trng. Nhiu loài
Pseudomonas sng hi sinh thân thin vi cây trng, tn dng dinh dng r a t b
mt cây trng. Pseudomonas là mt vi khun vùng r ph bin và mt vƠi loƠi cng
đc s dng nh mt tác nhân kim soát nm Gaeumannomyces graminis var tritici,
Rhizoctonia solani, Erwinia carotovora var. carotovora, Pythium ultimum, và
Fusarium oxysporum.Chúng c ch nm bnh thông qua mt s hot đông nh sn
xut các kháng sinh, các cht kìm hãm ion, các enzym phân gii, các cht hot đng b
mt và cnh tranh dinh dng vi mm bnh. Pseudomonas có mt kh nng đc bit
là sn xut các hp cht có ph hot đng rng bao gm các kháng sinh: pyrrolnitrin,
pyoluteorin (Plt), hp cht phenazine vƠ chitinase lƠ đc t đi vi mm bnh cây
trng. Các protein kháng nm nh chitinase có th tn công nhiu nhóm nm và vi
khun. Nhng enzym ly gii vi khun nƠy đc s dng rng rãi cho vic qun lý dch
bnh trên cây trng. Nhng enzym này thy phân chitin hin din trong thành t bào,
do đó nm b tiêu dit.( Maheshwari, 2011)
1.2.3 Bacillus

Hình 1.1 Hình nh t bào (a) và khun lc (b)ca vi khun Bacillussubtilis (
Theo khóa phân loi ca Bergey (Holt, 2000), vi khun Bacillus đc phân loi
nh sau:

Trích đoạn Quan sát vi th

---