B GIÁO DCăVẨăẨOăTO
TRNGăI HC M TP. HCM



BÁO CÁO KHOÁ LUN TT NGHP

 tài:
SÀNG LC VI KHUN NI SINH
CÓ KH NNGăKệCHăTHệCH
TNGăTRNG VÀ KHÁNG NM
COLLECTOTRICHUM SP. GÂY BNH TRÊN
CÂY T KHOA: CÔNG NGH SINH HC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGH VI SINH GVHD 1: ThS. Nguyn Thanh Thun
GVHD 2: ThS. NguynăVnăMinh

SVTH: Nguyn Th Thùy Linh
MSSV: 1053010394
Khóa: 2010 ậ 2014

Tp. H Chí Minh, Tháng 05 n14
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP

LI CMăN


DANH MC HÌNH vii
DANH MC BIUă viii
T VNă 1
PHN 1: TNG QUAN TÀI LIU 4
1.1 CÂY T VÀ BNHăTHÁNăTHăTRểNăCỂYăT 5
1.1.1 Tng quan v cây t 5
1.1.2 Bnhăthánăthătrênăcơyăt 6
1.2 VIăKHUNăNIăSINH 7
1.2.1 Sălc v vi khun ni sinh 8
1.2.2 Mt s hotătínhăkíchăthíchătngătrng cây trng ca vi khun
ni sinh 8
1.2.3 Tình hình nghiên cu th gii 13
1.2.4 Tình hình nghiên cuătrongănc 14
PHN 2: VT LIUăVẨăPHNGăPHÁPăNGHIểNăCU 16
2.1 AăIM VÀ THI GIAN NGHIÊN CU 17
2.2 VT LIU 17
2.3 THIT B, DNG C,ăMÔIăTRNG 17
2.3.1 Thit b 17
2.3.2 Dng c 18
2.3.3 Môiătrng, hóa cht và thuc nhum 18
2.4 PHNGăPHÁPăTHệăNGHIM 19
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP
SVTH: Nguyn Th Thùy Linh ii

2.4.1 B trí thí nghim 19
2.4.2 Phngăpháp 20
2.5 PHNGăPHÁPăTHNG KÊ S LIU 42
PHN 3: KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 43
3.1 KT QU PHÂN LP VI SINH VT NI SINH 44
3.1.1 Quanăsátăđi th 44

DANH MC VIT TT
C. capsici Colletotrichum capsici
C. nigrum Colletotrichum nigrum
IAA IndolAcetic Acid
MS Minimal Salt
NA Nutrent Agar
NB Nutrient Broth
PDA Potato Dextrose Agar
ppm pasts permilion
OD Optical Density
TSA Trypticase Soy Agar
TSB Trypticase Soy Broth

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP
SVTH: Nguyn Th Thùy Linh v

DANH MC BNG
Bng 2. 1 Xây dngăđng chun phospho 26
Bng 2. 2 Xây dng đng chun IAA 29
Bng 3. 1 Kt qu quanăsátăđi th các chng vi khun ni sinh 44
Bng 3. 2 Kt qu quan sát vi th các chng vi khun ni sinh 47
Bng 3. 3 Kt qu đnhălng hòa tan lân ca các chng 53
Bng 3. 4 KtăquăđnhălngăsinhăIAAăcaăcácăchng 55
Bngă 3.5ă ng kính vòng c ch và phnă trmă c ch nm
Collectotrichum sp. ca vi khun 58
Bng 3.6 Kt qu đnh danh ca chng TL2 60
Bng 3.7 Kt qu đnh danh ca các chng TL5, TL11, TL19 61
Bng 4.1. Giá tr OD
600nm
caăđng chun phospho 87

Hình 3.4 Mt s mu bnh thu thpăđc 51
Hình 3.5 Hình nhăquanăsátăđi th ca nm bnhătrênămôiătrng PDA 51
Hình 3.6 Bào t nm bnhăquanăsátădi kính hin vi 52
Hình 3.7 Triu chng bnh thán thătrênăqu tăđc gây bnh nhân to
51
Hình 3.8 Kh nngă phátă trin ca chng TL2 trênă môiă trngă vôă đm
Ashby 52
Hình 3.9 Kh nngăhòaătanălơnăca chng TL4 trênămôiătrng Pikovskaya
53
Hìnhă3.10ănhălng phospho tan trong dch nuôi cy 54
Hìnhă3.11ănhălng kh nngăsinhăIAAătrongădch nuôi cy 57
Hình 3.12 Kh nngăđi kháng nm Collectotrichum sp. ca chng TL5
58
Hình 3.13 Th kh nngăđi kháng gia các chng TL5 và TL11 63

BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP
SVTH: Nguyn Th Thùy Linh viii

DANH MC BIU 
Biuăđ 3.ă1ă th biu din nngăđ phospho tan dch nuôi cy các chng. .
54
Biuăđ 3.ă2ă th biu din nngăđ IAA trong dch nuôi cy các chng . 56
Biuăđ 3.3ă th biu din phnătrmăc ch nm (%) 59
Biuă đ 4.1.ă  th tngă quană gia mtă đ quang và nngă đ phospho
chun 88
Biuăđ 4.2.ă th tngăquan gia mtăđ quang và nngăđ IAA chun 90 BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP
SVTH: Nguyn Th Thùy Linh 1

khnălnăchoăsnăxutăt.ăBnhăthánăthăgơyăraăbiăloƠi Colletotrichum sp., héo
xanhăviăkhunădoăPseudomonas solanacearum gơyăra,ăvƠăbnhăkhmăt do vi
rútăđmă(CVMV)ăhocăvirut khmădaăchută(CMV)ălƠănhngăloiăbnhăpháă
hoiănghiêmătrngănhtăcaătă[54].
Doăđ́ăđăvicătrngătăđtăktăquătt,ăngiănôngădơnăphiăćăchăđăchmă
śc,ădinhădngăhpălíăvƠăqunălíăttăcácăđiătngădchăhi.ăHinătiătrênăthă
trngăcngăđưăćămtăsăsnăphmăphơnăb́năvƠăthucăboăvăthcăvtăćăthă
d̀ngăchoăcơyăt.ăTuyănhiên,ăcácăsnăphmănƠyăthngăćăngunăgcăh́aăhcă
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP
SVTH: Nguyn Th Thùy Linh 3

nênărtăđcăhiăviămôiătrngăvƠăngiănôngădơn.ăcăbit,ăđăđiuătrămtăsă
bnhă hiă dină tină nhanhă vƠoă thiă kìă choă tráiă ngiă nôngă dơnă thngă phună
thucăvƠoăsátăthiăgianăthuăhochănênăkhôngăđmăboăanătoƠnăvăsinh,ăgơyăđcă
hiăchoăngiătiêuăd̀ng.ă
MtătrongănhngăchinălcăquanătrngălƠăngădngăCôngănghăSinhăhcă
trongăsnăxutăphơnăb́năviăsinhăphcăvăchoănôngănghipăvƠăquaăđ́,ăhiăvngăsă
đemăliăchoăthăgiiămtăngunăthcăphmăanătoƠnăvƠăćăgiáătrăkinhătăcao.
Mtăsănghiênăcuăchoăthyărng,ăviăkhunăv̀ngărăvƠăviăkhunăniăsinh
phơnălpătărăcơyălúaăćăkhănngăthúcăđyătngătrngăbngăkhănngăcăđnhă
nitătădo,ăhòaătơnălơn,ăsinhăhormonăIAAầăvƠăcăchăcácăbnhătrênăcơyătrng
[3], [55], [56]. Bênăcnhăđ́,ăkimăsoátădchăbnhăbngăphngăphápăsinhăhcă
(kimăsoátăsinhăhc)ăđangădnătrăthƠnhăxuăhngăphăbinăvƠăđcăápădngă
rngă rưiătrongăNôngă nghipă ă nhiuăncătrênă thă giiă [16]. Trongăđ́,ăbină
phápăsădngăviăsinhăvtănhămtătácănhơnăkimăsoátăvƠăphòngăngaăbnhăhi
đangădnătrănênăphăbină[7],ăvìăhiuăquăr̃ărtămƠăńămangăli,ăcácăchngăviă
sinhăvtălaăchnăphiăćăhotătínhăđiăkhángăcao,ănăđnhătrongăthiăgianădƠiă
mƠăkhôngăgơyăhiăchoăđngăvt,ăthcăvtă[16].ăMtăsăviăsinhăvtăniăsinhăćă
hotătínhăsinhăhcătoăraăcácăchtăkhángăsinhăđiăkhángăviăcácăviăsinhăvtăgơyă
bnhăchoăcơyăchăcngăđưăđcănghiênăcuă[19].

nhngănmă60ănhngăvi din tích rt nh. tăcayăđc trng ph bin  n
,ăchơuăPhiăvƠăcácănc nhităđi khác,ăđc s dng làm gia v. t cay là
cây có giá tr kinh t và trng ph binăhnăt ngt. Trong s các cây trng
thuc h cà (Solanaceae), cây t có tm quan trng th hai ch sau cà chua
[17].
Theo Bosland và Votava (2003) qu t có nhiu li th trong vic nu
nng. Trong qu t có cha nhiu cht hóa hc bao gm cht du d bayăhi,ă
du béo, capsaicinoit, carotenoit, vitamin, protein, cht si và các nguyên t
khoáng cht. Nhiu thành phn trong qu t có giá tr dinhădng quan trng,
làm gia v, m̀iă thmă vƠă mƠuă sc. Qu t giúp làm gim nhim x và
cholesterol, giàu vitamin A và C, nhiu khoáng kali, axit folic và vitamin E.
Trong qu tătiăcha nhiuăvitaminăCăhnăsoăvi qu thuc h cây có múi và
cha nhiuăvitaminăAăhnăsoăvi c cà rt. Hai nhóm cht hóa hc quan trng
trong t là capsaicinoit và carotenoit. Capsaicinoit là alkaloit to ra v cay cho
qu t. Mt s lng ln carotenoit cung cp giá tr dinhădng cao và màu sc
cho qu t [54].
t là cây mtănm, còn  dng hoang di (qu rt nh) có th sng và
cho qu liên tc trong nhiuănm.ătălƠăcơyăaănhit. Nhităđ thích hp cho s
sinhătrng và phát trin ca t là 25 ậ 28
o
C ban ngày và 18 ậ 20
o
Căbanăđêm.ă
Cây cn nhiu ánh sáng. Thiu ánh sáng nht là vào thiăđim ra hoa s làm
gim t l đu trái ca cây. tăcngăchuăđc hn.  thi k raăhoaăvƠăđu trái,
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP
SVTH: Nguyn Th Thùy Linh 6

đ mă(đtăvƠăkhôngăkhí)ăđ́ngăvaiătròăquanătrng trong vic hình thành khi
lng và chtălng qu.ă măđt thpă(di 70%) qu hay b cong và v

lôngăgaiăđenănhnăăđnh,ăkíchăthcă55ă- 190 x 6,5 - 65µm.ăBƠoătăphơnăsinhă
hình buădcăhocăhìnhătrăhaiăđuătròn,ăkhôngămƠu,ăđnăbƠo,ăkíchăthcă18ă-
25ăxă3ăµm.ăCƠnhăbƠoătăphơnăsinhăngnăhìnhăgyăkíchăthcă20ă- 50ăxă25ăµm.ăă
nmăC. capsici thìăđaăcƠnhăćăđngăkínhă70ăậ 100 µm có lông gai màu nâu
sm,ăđnhăćămƠuăhiănhtăćănhiuăngnăngangăvƠădƠiătiă150ăµm.ăBƠoătăphơnă
sinhăkhôngămƠu,ăđnăbƠo,ăhiăcongăhìnhăliălim,ăkíchăthcă17ă- 28 x 3 ậ 4
µmăćă gităduăbênătrong.ăBƠoă tăphơnăsinhăcaă haiăloiănmănƠyănyă mmă
trongăncăsauă4ăgi,ănhităđăthíchăhpăchoănmăgơyăbnhălƠă28 ậ 30
o
C.ăBnhă
phátătrinămnhătrongăđiuăkinănhităđăcao,ămăđăcao.ăBƠoătăphátătánănhă
gíăvƠănhăcônătr̀ng.
Bnhă gơyăthită hiă lnătrongă nhngănmămaă nhiu.ă ăncăta,ă bnhă
phátătrinămnhăvƠoăthángă5ă- 7ăkhiăcơyătăđangăăthiăkăthuăhochăqu.ăBnhă
cònă gơyă hiă vƠoă giaiă đonă sauă thuă hochă trongă quáă trìnhă boă qună vƠă vnă
chuyn.ăănhngărungăb́năđmănhiu,ămtăđătrngăcaoăthngăbnhănng.ă
Ging t chìa vôi Hu và sng bò nhim bnhănngăhnăcácăging ch thiên và
mt s ging Thái Lan nhp ni. Nm tn ti trên ht gingădi dng si nm
và bào t phơnăsinhăvƠătrênătƠnădăcơyăbnh. Bào t phân sinh có sc sng cao,
trongăđiu kin khô mcăd̀ătƠnădăb v̀iătrongăđt vn có th ny mm vào v
sau [9].
 Bin pháp phòng tr
Tiêu dit ngun bnh. Dn schătƠnădăcơyăbnh, chn ht ging khe,
sch bnh. X lý ht ging viănc nóng 52
o
C trong 2 gi hoc KMnO
4
0,1%
t 1 - 2 gi hoc vi các loi thuc tr nm.
Luân canh vi cây trng khác h. B trí mtăđ trng thích hp. Dit côn

hìnhă thƠnhă cơyă conă trongă điuă kină btă li [26] vƠă nơngă caoă khă nngă tngă
trngăcaăthcăvtă[24].ăViăkhunăniăsinhăcònăćăthăngnăchnămmăbnhă
phátătrinăbngăcáchătngăhpăcácăchtăniăsinhătrungăgian,ăquaăđ́ăđătipătcă
tngăhpăcácăchtăchuynăh́aăvƠăcácăhpăchtăhuăcămi.
1.2.2 Mt s hot tính kích thích tng trng cây trng ca vi khun ni sinh
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP
SVTH: Nguyn Th Thùy Linh 9

1.2.2.1 S c đnh nit phân t ca vi khun
 Quá trình c đnh nit phân t
Mt trong nhng quá trình vi sinh vt hcăćăỦănghaălnăđi vi nông
nghip là quá trình c đnhănităphơnăt.ămălƠădinhădng thit yuăđ cây
trngăsinhătrng và phát trin. Trong nông nghip,ănngăsut ca cây trng
đc cung cp ch yu bngăcáchăd̀ngăcácăphơnăđmăvôăcănhngăphơnănƠyă
thìăđtăđ và có hiăchoămôiătrng. Trong khong không khí trên miăhectaăđt
có ti 80.000 tnănitănhngă ngi, gia súc và cây trngă đu không có kh
nngăs dngăđcănită dng phân t này. Cây trngătrênătoƠnătráiăđt mi
nmăs dng khong 100-110 triu tnănit,ătrongăkhiăđ́ăphơnăđm hóa hc ca
tt c cácănc trên th gii ch b sung khong 30% s lngănităb lyăđi.ă
Mun phá v ba liên kt trong phân t nită(N=N)ăđ d to ra các loi phân
hóa hc, cn phi s dngăcácăđiu kin k thut rt phc tp (nhităđ cao, áp
sut cao, chtăxúcătácăđt tin). Theo tính toán, mun tng hp ra 1 tn NH
3
t
N
2
và H
2
cnănngălngătngăđngăvi nngălngăsinhăraădoăđt cháy ht 5
tnăthanăđá.ăTrongăkhiăđ́ăviăsinhăvt,ătrongăđ́ăćăviăkhunăđ́ngăvaiătròăch yu

 dng rt bn và s lng rt phong phú, chim 78,16%
theo th tích và 75,5% theo khiălng. Cây trngăcngănhăcácăloƠiăđng vt
vƠăngi không có kh nngăđng hóa trc tip ngun N
2
t do t không khí.
Quá trình c đnhăđm xy ra trong t bào vi khun và vi khunălamăđu ging
nhau là nh chúng có h thng gen nif (ni là ch vit tt ca nitrogen-nităvƠăfă
là fixing-c đnh)ă điu khin quá trình tng hp enzym nitrogenase.
Nitrogenase là h enzym xúc tác cho phn ng kh N
2
thành NH
3
.ăNhăvy, h
thngăgenănifăđc xem là h thngăgenăđiu khin cho quá trình c đnhăđm
sinh hc [2], [12].
Ngày nay nhiu nhà nghiên cu khoa hcăđưăchng minh NH
3
va là sn
phm ca quá trình c đnhănităphơnăt va là nhân t điu hoà hot tính ca
enzym nitrogenase. Khi NH
3
tíchă lyăđn mt nngăđ nhtăđnh thì nó làm
đìnhăch tc khc hotăđng ca nitrogenase. KiuăđiuăhoƠănhăvy giălƠăắă
iu hoà liên h ngc”.ăTuyănhiênăNH
3
khôngăthamăgiaăđiu hoà trc tip mà
thông qua mt protein khác là enzym glutamin synthetase.ăăKhiăămôiăătrng
có nhiu NH
3
thì enzym này b adenin hoá nên  trng thái bt hot.ăNgc

(FePO
4
), phosphate nhôm (AlPO
4
),ầăviăsinhăvt có th chuyn hóa chúng sang
dng d tiêu. Vi khun phân gii phosphate (PSB) sng ph bin  vùng r có
th khc phc vnă đ trên bng cách tit ra các acid hu că vƠă enzymeă
phosphatase chuyn phosphate không tan thành phosphate hòa tan (ion
monobasicăvƠădibasic)ăđ cây trng có th s dng.ăng vtănăthc vt và
bin phospho huăcăthc vt thành phospho huăcăđng vt [43].
 Vi sinh vt hòa tan lân hu c
Vi sinh vt hòa tan lân huăcăch yu gm Bacillus và Pseudomonas.
ángăchúăỦălƠăB. megaterium var phosphatsum có kh nngăhòaătanălơnăhuăcă
cao,ăđng thi B. megaterium còn có kh nngăhìnhăthƠnhăbƠoăt nên sc sng
rt mnh. Phân giiă xácă đng vt, thc vt axít nucleic, nucleotid,
phospholipid, sn phm phân gii cui cùng là H
3
PO
4
. Quá trình phân gii cn
s tham gia ca nhiu nhóm VSV thuc các ging Bacillus và Pseudomonas.
Quá trình có th biu din tngăquátătheoăsăđ sau [12]:
NucleoproteinăăănucleinăăăaxítănucleicăăănucleotideăăăH
3
PO
4
.
LeucithinăăăGlyceroăphosphatăăăH
3
PO

, HNO
3
, H
2
SO
4
,ătrongăđ́ăH
2
CO
3
rt quan trng. Chính H
2
CO
3

đưălƠmăchoăCa3(PO4)2ăphơnăgii. Quá trình phân giiănhăsau [12].
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 4 H
2
CO
3
+ H
2
OăăCa(HPO4)
2

 L trình indole-3-acetamic:
Tryptophan  indole-3-acetamide  IAA
Hu ht các vi khună ćă íchă nhă Rhizobium,ă Bradyrhizobium,ă vƠă
Azospirillum tng hpăIAAăquaăđng Indole-3-pyruvic acid. Mt vài vi khun
gây bnhănhăPseudomonas syringae, Agrobacterium tumefaciens, và Erwinia
herbicola tng hpăIAAătheoăđngindole-3-acetamide [43].
1.2.3 Tình hình nghiên cu th gii
MtănghiênăcuăcaăLodewyckxăvƠăcngăsă(2002) [41] nêuălênăphngă
phápăphơnălpăvƠămôătăđcăđimăviăkhunăniăsinhătăcácăloƠiăthcăvtăkhácă
nhau.ăDaătrênănnătngănghiênăcuăcaăHallmannăvƠăcngăsă(1997) [34] và
LodewyckxăvƠăcngăsă(2002) [41], Rosenblueth và Martinez-Romero (2006)
[48] đưăcôngăbămtădanhăsáchătoƠnădinăcaăviăkhunăniăsinhăđcăphơnălpă
tămtălotăcácăbăphnăcaăcơy.ăMtăsănghiênăcuăcaăSturzăvƠăMathesonă
(1996) [52],ăDuijffăvƠăcngăsă(1997) [27], Krishnamurthy và Gnanamanickam
(1997) [38] đưăchăraărngăviăkhunăniăsinhăćăkhănngăkimăsoátăđcămmă
bnhătrênăthcăvt,ănghiênăcuăcaăAzevedoăvƠăcngăsă(2000)ă[22] viăkhună
niăsinhăćăkhănngăkimăsoátăđcămmăbnhăăcônătr̀ngăvƠănghiênăcuăcaă
HallmannăvƠăcngăsă(1997,ă1998)ă[34], [35] cngăđưăchăraărngăviăkhunăniă
sinhăćăkhănngăkimăsoátăđcămmăbnhăcăătuynătr̀ng.ăNghiênăcuăcaă
Chanway (1997) [26] chăraătrongămtăsătrngăhpăchúngăćăthăđyămnhă
tcăđănyămmăcaăht,ăthúcăđyăsăhìnhăthƠnhăcơyăconătrongăđiuăkinăbtăliă
vƠănơngăcaoăkhănngătngătrngăcaăthcăvt.ăViăkhunăniăsinhăcònăćăthă
ngnă chnămmă bnhăphátătrină bngă cáchătngă hpăcácăchtă niă sinhătrungă
gian,ăquaăđ́ăđătipătcătngăhpăcácăchtăchuynăh́aăvƠăcácăhpăchtăhuăcă
mi.ăNghiênăcuăcaăStrobelăvƠăcngăsă(2004) [50] văcăchăsnăsinhăchtă
chuynăh́aămiătrongăsăđaădngăsinhăhcăcaăviăkhunăniăsinhăćăthăphátă
BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP
SVTH: Nguyn Th Thùy Linh 14

hinăcácăloiăthucămiăđăđiuătrăćăhiuăquăcácăbnhăăngi,ăthcăvtăvƠă


ARDRA IGS. Tuy nhiên vnăchaăćănghiênăcu nào v vi khun ni sinh cây
tăđc thc hin.

Trích đoạn ngă3.5ă ng kính vòng cch và ph nătr măc ch nm

---