BăGIÁOăDCăVẨăẨOăTO
TRNGăIăHCăMăTP.ăHCM BÁOăCÁOăKHịAăLUN TTăNGHIP

Tên đ tài:
SẨNGăLCăVIăKHUNăBacillus SINH
BACTERIOCIN NGăDNGăTRONG
BOăQUNăTHCăPHM

KHOAăCỌNGăNGHăSINHăHC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINHăHCăPHÂNăT CBHD:ăThS.ăNguynăVnăMinh
SVTH: LêăQunhăYnăNhi
MSSV: 105 301 2530
Khóa: 2010 ậ 2014

Tp. H Chí Minh, tháng 05 nm 2014
LIăCMăN
Viălòngăbit năsơuăsc, thyăcôăkhoaăCôngăNghăSinhăHcătrngăiă
Hcă Mă TP.HCMă luônă snă sƠngă truynă đtă nhngă kină thcă că bnă cngă nhă
chuyênăsơuătrongălnhăvcăsinhăhcăđăgiúpăemălƠmăcăsăchoănghiênăcuăsauănƠy.
EmăxinăchơnăthƠnhăcmănăthyăNguynăVnăMinhăvƠăcôăDngăNht Linh
đưătnătìnhăhngădn,ătruynăthăkinhănghim,ătoănhngăđiuăkinăttănhtăchoă
emătrongăsutăquáătrìnhăhcătpăvƠăcóăthăthcăhinăttăđătƠiă tiăphòngăthíănghimă
côngănghăviăsinhăcaătrngăiăHcăMăTP.HCM.
XinăghiănhăcôngănăcaăChaăM đưăkhôngăqunămiăgianălaoăkhóănhcăvƠă

1.3. TNGăQUANăVăBACTERIOCIN 15
1.3.1. Giiăthiuăchungăvăbacteriocin 15
1.3.2. PhơnăloiăbacteriocinăcaăchiăBacillus 16
1.3.3. TínhăchtăcaăBacillus bacteriocin 18
1.3.4. Hotăđngăcaăbacteriocin 19
1.3.5. TínhăđiăkhángăvƠăphngăphápăxácăđnhătínhăđiăkháng 20
1.3.6. Sinhătngăhpăbacteriocin 22
1.3.7. CácăngădngăcaăBacillus bacteriocin 23
PHNăII:ăVTăLIUăVẨ PHNGăPHÁP 31
2.1. VTăLIU 32
2.1.1. aăđimăvƠăthiăgianănghiênăcu 32
2.1.2. Chngăviăkhun dùngăthănghim 32
2.1.3. VtăliuăvƠăhóaăcht 32
KHÓA LUN TT NGHIP MC LC

SVTH:ăLÊăQUNHăYN NHI ii 2.2. PHNGăPHÁPăNGHIÊNăCU 33
2.2.1. Bătríăthíănghim 33
2.2.2. nhătínhăkhănngăsinhăbacteriocin 34
2.2.3. Xácăđnhăhotătínhăkhángăkhunăcaăbacteriocin 36
2.2.4. Tác đng caăcácănhităđăvƠăđăpHătrênăhotătínhăkhángăkhun 37
2.2.5. nhădanh 38
2.2.6. Xácăđnhănngăđăphaăloưngăthpănhtăcaădch bacteriocin thô cònăcă
chăviăviăkhunăchăth 46
2.2.7. Thănghimăbacteriocinănhăchtăboăqunăsinhăhctrong sa 48
2.2.8. Phngăphápăthngăkê 49
PHNăIII:ăKTăQUăVẨăTHOăLUN 50
3.1. XÁCă NHă KHă NNGă SINHă BACTERIOCINă CAă CÁCă CHNGă

SVTH: LÊ QUỲNH YN NHI iv

DANH MC CÁC BNG
Bng 1.1: Phân loi bacteriocin ca Bacillus, ví d, và so sánh vi phân loi ca
LAB bacteriocin 18
Bng 3.1 Kt qu xácăđnh kh nngăsinhăbacteriocinăca các chng Bacillus 51
Bng 3.2 Kt qu xácăđnh kh nngăsinhăbacteriocinăca các chng Bacillus da
vƠoăđng kính vòng vô khun ( = mm) 53
Bng 3.3: Kt qu xácăđnh hot tính kháng khun ca bacteriocin ca vi khun
th nghim (AU/mL) 55
Bng 3.4 Kt qu tácă đng ca các nhită đ trên hot tính kháng khun ca
bacteriocin ca chng K3 (%) 57
Bng 3.5 Kt qu tácă đng ca các nhită đ trên hot tính kháng khun ca
bacteriocin ca chng T3P (%) 59
Bng 3.6 Kt qu tácă đng caă cácă đ pH trên hot tính kháng khun ca
bacteriocin ca chng th nghim K3(%) 61
Bng 3.7 Kt qu tácă đng caă cácă đ pH trên hot tính kháng khun ca
bacteriocin ca chng th nghim T3P (%) 62
Bng 3.8 Kt qu đnh danh sinh hóa 65
Bng 3.9 Kt qu xácăđnh nngăđ pha loãng thp nht ca dch bacteriocin thô
còn c ch vi vi khun ch th (t l so vi nngăđ banăđu) 66
Bng 3.10 Kt qu th nghimăbacteriocinănhăcht bo qun sinh hc trong sa
ca các chng th nghim  nhităđ thng (gi) 67

KHÓA LUN TT NGHIP DANH MC

SVTH: LÊ QUỲNH YN NHI v

DANH MC HÌNH NH
Hình 1.1: Hình dng ca mt loài thuc chi Bacillus 7

S.faecalis: Streptococcus feacalis
S.typhi: Salmonella typhi
S.aureus: Staphylococcus aureus
Ecoli: Escherichia coli
o
C: Celsius degree

KHÓA LUN TT NGHIP T VNă

SVTH:ăLÊăQUNHăYNăNHI 1
T VNă

KHÓA LUN TT NGHIP T VNă

SVTH:ăLÊăQUNHăYNăNHI 2 An toƠnăvăsinhăthcăphmălƠăvnăđăluônăđcămiăngiăquanătơm,ănhtălƠă
viătìnhăhìnhăhinănay.ăiăsngăxưăhiăngƠyăcƠngătngăcaoădnătiănhuăcuăn
ungăcaăconăngiăcngăngƠyăđcănơngăcao.ăVìăthăvnăđăvăsinhăanătoƠnăthcă
phmăđcăchúătrngăvƠăđyămnh.
TìnhătrngăthcăphmăbănhimăkhunăngƠyăcƠngăphăbinăvƠăgơyăthităhiălnă
choăcôngătyăthcăphmăcngănhăscăkheăngiătiêuădùng. Cóărtănhiuănguyênă
nhơnăgơyăngăđcăthcăphmănh:ădoăviăsinhăvt,ănguyênăliuăvƠăsnăphmăchaă

phmătănhiênăđăciăthinăanătoƠnăsinhăhc vƠătngăthiăgianăboăqunăthcăphmă
viăvicăsădngăcácăloƠiăviăsinhăvtăkhôngăgơyăbnhăvƠănhngăchtăchuynăhóaă
caăchúng,ăđcăyêuăcuăngƠyăcƠngăcao.

Bacteriocin lƠăchtăkhángăkhunăcóăbnăchtălƠăpeptideăhayăproteinăđcătngă
hpătrênăribosomeăăcăviăkhunăGramădngăvƠăGramăơm,ătíchăđinădng,ăcóă
khiălngăphơnătăthp,ăbn nhităvƠăcóăkhănngăcăchăviăkhunăkhácăcóăquană
hăgnăgiăviăchúng.ăNhiuăbacteriocin trong chi Bacillus đưăđcăbáoăcáo nhă
subtilină caă B.subtilis (Banerjee vƠă cngă s,ă 1988), megacin ca B.megaterium
(Korenblumvà cng s, 2008), mt s bacteriocin ca B.cereus (Pariot và cng s,
2008) mt s bacteriocin ca B.thuringiensis (Paik và cng s, 1997, Paik và cng
s, 2000). Mt nghiên cu gn đơy nht ca Kaewklom và cng s (2013) đư báo
cáo rng amysin ca vi khun B.amyloliquefaciens có kh nng kim soát
L.monocytogenes trên sn phm tht xông khói (Kellner và cng s, 1989)
Vì vy, vic sàng lc Bacillus sn xut bacteriocin đc coi là mt trong
nhng li ích ln trong nghiên cu bo qun thc phm. Xut phát t thc t này,
chúng tôi tin hành thc hin đ tài ắSƠngă lcă Bacillus sinh bacteriocin ngă
dngătrongăboăqunăthcăphmẰ.
Mcătiêu: Cungăcpăthêmăngunăsnăxutăbacteriocin mi ngădngătrongăboă
qunăthcăphm.
Niădungăthcăhin:
– nh tính kh nngăsinhăbacteriocin ca các chng th nghim
– Xácă đnh hot tính kháng khun ca bacteriocin thu nhn t các
chng th nghim vi vi khun ch th (L.monocytogenes, S.feacalis,
S.typhi, S.aureus, E.coli)
KHÓA LUN TT NGHIP T VNă

SVTH:ăLÊăQUNHăYNăNHI 4
Lp: Bacilli
B: Bacillales
H: Bacillaceae
Chi: Bacillus
1.1.2. Khái nim
T ắBacillusẰ nhmămiêuătăhìnhădángăcaămtănhómăviăkhunăkhiăđcăquană
sátădi kínhăhinăvi.ăNóăxutăphátătăting Latin cóănghaălƠăắhình queẰ.ăDoăđó,ă
mtăsăniăgiălƠ khunăque hoc trcăkhun.
Tuy nhiên, ắBacillus” lƠă tênă caă mt chi gmă các viă khun hình que, Gram
dng, hiuăkhí thucăv h: Bacillaceae ngành: Firmicutes.ăChúngăcóămtăăkhpă
miăniătrongătănhiên,ăkhiăgpăđiuăkinăbtăliăhayăăcuiăthiăkăphátătrinătă
nhiên,ăchúngăcóăkhănngătoăbƠoăt,ăđătnătiătrongătrngătháiăắngăđôngẰătrongă
thiăgianădƠi. CácăthƠnhăviênăca chiBacillus đcăbitănhălƠămtăắkhoăvăkhíẰ đă
snăxutăcácăchtăkhángăkhun,ătrongăđóăcóăpeptide và lipopeptide, kháng sinh và
bacteriocin.
1.1.3. căđim sinh thái và phân b trong t nhiên
Chi Bacillus baoă gmă 51ăloƠiă đưăđcăđnhă danhăvƠă mtăsă loƠiă chaă đcă
phơnăloiărõărƠng,ătrongăđóăđaăsăcácăloƠiălƠăvôăhi.
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN

SVTH:ăLÊăQUNHăYNăNHI 7 HuăhtăBacillus lƠăviăkhunăhìnhăque,ăGramădng,ăhiuăkhí,ătoăniăbƠoăt,ă
cácătăbƠoătnătiăriêngălăhayădínhănhauăthƠnhăchuiăngn.ăTuyănhiên,ăcngăcóămtă
să loƠiă Bacillus lƠă Gramă ơmă hayă Gramă dngă yuă nhă B.horti, B.oleronius,
B.azotoformans, B.thermosphaericus; khôngătoăbƠoătănhăB.halodenitrificans,
B.thermoamylovorans;ă dngă viă khună khôngă toă bƠoă t,ă kă khíă btă bucă nhă
B.infernus.


vt (Xie vƠăcngăs,ă2009).ăKhănngăđătnătiăvƠăphátătrinătrongăcácăhăsinhătháiă
khácănhauănhăvyălƠădaătrên vicăsinhăbƠoătămnhăm,ăsăđaădngătrongăcácă
thucătínhăsinhălỦăvƠăyêuăcuătngătrngăcaăchúng.
1.1.4. Dinhădng và s phát trin ca Bacillus
1.1.4.1. Môi trng nuôi cy
PhnălnăcácăchiăBacillus cóăthăphátătrinăttătrênăcácămôiătrngădinhădngă
căbn:ăNB,ăNA ,ămcădùătrongămtăsătrngăhpăđcăbitămôiătrngăcnăđcă
điuăchnhăpHăhocănngăđămui.ăTrongăphòngăthíănghim,ădiăđiuăkinăphátă
trinătiău,ăthiăgianăthăhăcaăBacillus khongă25ăphút.ăTrongămôiătrngănuôiă
cyălng,ăchúngătoăvángătrênăbămt.ăTrênămôiătrngăthchătoăkhunălcăto,ătrònă
hayăhìnhădángăbtăthng,ăcóămƠuăxámăngăvƠngănht,ăbămtăkhómăsnăsùi,ăhiă
nhnăhocătoămƠngămnălanătrênăbămtăthch(Chang vƠăcngăs,ă2003)
Hìnhădángăkhunălcăthayăđiătheoăđătui,ăcácăđaăcyăriêngălăcóăthătoăraăcácă
dngăkhunălcăkhácănhau.MtăsăloƠiăBacillus khiănuôiăcyăcnăbăsungămtăsă
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN

SVTH:ăLÊăQUNHăYNăNHI 9 thƠnhăphnănh:ăB.larvae và B.poliliae trongămôiătrngănuôiăcyăbăsungăthêmă
thiamine,B.stearothermophilus băsungăcalciăvƠăst(Kaewklom vƠăcngăs,ă2013)
HuăhtăcácăloƠiăBacillus cnămôiătrngăđcăbităđăcóăthăthúcăđyăvicătoă
bƠoăt.ăSătoăbƠoătăđcăcmăngăsauăphaătngătrngăhƠmămădoănngăđădinhă
dngăthp,ăđcăbitălƠăthiuăngunăcarbon,ănitrogen,ăhocăphospho.ăMôiătrngă
nhơnă toă đă cmăngă toăbƠoă tă thngăthyă lƠă Difico sporulation agar (DSM)
2xSG agar(NguynăcăQunhăNh,ă2008)
1.1.4.2. Nhit đ phát trin
PhnălnăBacillus aă nhităđătrungătínhăvƠătoăkhună lcăđcătrngăsauă khiă
nuôiăcyă37
o

nhit,ă vƠă B.subtilis subsp globigii viă khănngă chuănhit,ă hóaăchtă vƠă bcăx,ă
đcăsădngărngărưiăđăxácănhnăvicăkhătrùngăvƠăkhătrùngăthayăth.
MtăsătácănhơnăgơyăbnhăcônătrùngăcaăBacillus đcăsădngănhălƠăthƠnhă
phnă caă thucă tră sơuă (B.thuringiensis). B.thuringiensis subsp. làm chă phmă
israelensisserotypeăH14ăditălngăqung.ăBacillus spp.ăđcăsădngălƠmăprobiotică
choăngi,ăchnănuôiă vƠăthyăsnănhăkhă nngătoăbƠoă tăchuănhit,ăsinhăcácă
enzymă ngoiă bƠoă vƠă khă nngă điă khángă viă cácă viă sinhă gơyă bnhă nh
Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenza, Candida albicans, E.coli,
S.aureus, Shigella, Vibrio spp., Víănh:ăB. polyfermenticus SCD (polyfermenticin
snăxutăSCD)ălƠămtăprobioticăthngămiăđăđiuătrăriălonăđngărutădƠiăhnă
ă ngiă doă hotă đngă că chă caă nóă điă viă C.perfringens; bƠoă tă caă
B.amyloliquefaciens CECTă5940ăđcăsădngănhămtăprobioticătrongăthcănă
giaăcmă(Ecobiols,ăNorelă&ăNatureăNutrition)ăhotăđngătrongăđngărutăcaăgiaă
cm,ă lƠmă gimă hiuă lcă caă viă khună gơyă bnhă nhă C.perfringens, E.coli và
Yersinia,ădoăđóălƠmăgimătălătăvongăgiaăcmầB.subtilis dùngălƠmăchăphmă
phòngăvƠăđiuătrăviêmătai miăhngăăngiă(MartiraniăvƠăcngăs,ă2002)
Mtă să chngă Bacillus nhă B.laterosporus, B.firmus và B.cereusđangă đcă
nghiênăcuă trongăsnăxutăchtădoă sinhăhcă(hydroxybutyrate).ăB.pasteurii đaă
vƠoăđtătătoăraăcalcite-mtăchtăliênăktăxiămngăviăđt,ăchuynăhóaăđtăthƠnhă
đáălƠmăvngămóngăcácătòaănhƠ,ăgiúpăchngăchuăđngăđt (Martirani vƠăcngăs,ă
2002)
1.2. TNG QUAN V VI KHUN GÂY BNH
1.2.1. Staphylococcus aureus
Phân loi:
Gii: Prokaryote
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN

SVTH:ăLÊăQUNHăYNăNHI 11
SVTH:ăLÊăQUNHăYNăNHI 12 Phân loi:
Ngành: Proteobacteria
Lp:ă Gamma Proteobacteria
B:ă Enterobacteriales
H:ă Enterobacteriaceae
Chi: Escherichia
Loài: Escherichia coli (Holt,
2000)
E.coli là trc khunăGramă ơm.ăKíchă thc
trung bình t 2 ậ 3 µm x 0,5 µm; trong nhng
điu kin không thích hp (ví d nhătrongămôiă
trng có kháng sinh) vi khun có th rtădƠiănhăsi ch. Rt ít chng E.coli có
v,ănhngăhu ht có lông và có kh nngădiăđng.
E.coli phát trin d dƠngătrênăcácămôiătrng nuôi cyăthôngăthng , hiu khí
tùy nghi, nhităđ t 5 ậ 40
o
C.ă Trongă điu kin thích hp E.coli phát trin rt
nhanh, thi gian th h ch khongă20ăđn 30 phút.
E.coli là vi khunăthng trú  đng tiêu hóa caăngi, có th đc tìm thy
 đng hô hpătrênăhayăđng sinh dc. E.coli đngăđu trong các vi khun gây
bnh tiêu chy,ă viêmăđng tit niu,ă viêmă đng mt,ă cnă nguyênăgơyă nhim
khun huyt. E.coli có kh nngăgơyăbnh khi xâm nhp vào nhng v tríătrongăcă
th mƠăbìnhăthng chúng không hin din.
E.coli hiăsinhăcóătrongăphơnăngi khe mnh ch gây bnh khi có d vt hay
h thng min dch ca ký ch b suy yu.
E.coli gây bnhăđng rut. Tác nhân gây bnhăquaăđng tiêu hóa bt c khi
nào ký ch nutăvƠoăđ s lng vi khun. Truyn bnh ch yu qua thcănăhayă

Ngành: Firmicutes
Lp: Bacilli
B: Lactobacillales
H: Streptococcaceae
Chi: Streptococcus
Hình 1.5: Streptococcus faecalis
(Ngunăwww.ohsu.edu)
Hình 1.4: Salmonella typhi
(Ngun: textbookofbacteriology.net)
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN

SVTH:ăLÊăQUNHăYNăNHI 14 Loài: Streptococcus faecalis (Holt, 2000)
S.faecalis lƠăliênăcuăkhun,ăcóădngăhìnhăcuăhocăovalăkéoădƠi;ăGramădng,ă
khôngă diă dng,ă khôngă sinhă bƠoă t,ă mtă să loƠiă toă vă nhy;ă hiuă khíă tùyă nghiă
nhngăphátătrinăttătrongăđiuăkinăkăkhí;ăkhunălcăcóămƠuăhngăđnăđăđmăkhiă
nuôiăcyă trênămôiătrngă aziceătetrazoliumăchaă TTC;ăcóă phnăngă catalaseăvƠă
oxidaseăơmătính.ăViăkhunăchuăđcănngăđămuiă6,4ă%,ăpHă4,5-10,ănhităđă10-
45
o
C
BnhădoăS.faecalis:
– Viêm hng, viêm hch có m, viêm khp, viêm thn cp tính, viêm các
van tim
– Gơyăđauăd dày và mùi hôi  c hng
– Triu chng:ăđauăhng, st, mnăđ da, tiêu chy, nôn ma
– Thng xut hin sau khoàng 12-14 gi, kéo dài 2-3 ngày (Lêă Vnă
Phng, 2012)

Bacteriocin lƠăchtăkhángăkhunăcóăbnăchtălƠăpeptideăhayăproteinăđcătngă
hpătrênăribosomeăăcăviăkhunăGramădngăvƠăGramăơm,ătíchăđinădng,ăcóă
khiălngăphơnătăthp,ăbnănhităvƠăcóăkhănngăcăchăviăkhunăkhácăcóăquană
hăgnăgiăviăchúng.
Loiă viă khună toă raă loiă bacteriocin nƠoă thìă cóă khă nngă khángă liă chínhă
bacteriocin đó.ăNgoƠiăra,ăkhôngăgơyăphnăngădăngătrongăconăngiăvƠăcácăvnă
đăvăscăkhe,ăbăphơn hyănhanhăbiăenzymăprotease,ălipase.
Cóărtănhiuăgingăviăkhunăsinhătngăhpăbacteriocin,ătrongăđóăcóăviăkhună
Bacillus. Bacteriocin caăBacillus cóăphăkhángăkhunărng,ăcóătimănngădùngă
lƠmăchtăboăqunăthcăphm.
Ngiătaăđưăđaăraănhiuătiêuăchíăđăđnhănghaăbacteriocin,ănhngătiêuăchíănƠyă
đcădùngătrongănhiuă trngăhp,ăápădngă viănhngămcăkhácănhauă đăđnhă
nghaănhngăloiăbacteriocin khácănhau.ăNhngătiêuăchíănhăsau:
 Phm vi c ch đi vi nhng loi khác
 S có mt ca loi protein hotăđng
 Cách thc hotăđng ca hot tính kháng khun
 Loi t bào mà nó tác dng
KHÓA LUN TT NGHIP TNG QUAN

SVTH:ăLÊăQUNHăYNăNHI 16  Nhng yu t di truyn
 Do quá trình tng hp có cht c ch
1.3.2. Phân loi bacteriocin ca chi Bacillus
ăánă phơnăloiă chínhăchoă cácăpeptideăkhángă khunăcaăribosomeă tngăhpă
hinăcóălƠăcaăLABăbacteriocin. VicăphơnăloiăLABăbacteriocin trcăđơy đcă
thƠnhălpăbiăKlaenhammeră(1993),ăvƠăsauăđóăchuynăthăhocăphơnăloiăliăđcă
thcă hină bi Van Belkum và Stiles (2000), Nes vƠă cngă s (2007). Mtă să
bacteriocin snăxutăbiăviăkhunăBacillus thucănhómăcaălantibiotics. Tuy nhiên

coagulans I4,ăcngănhăbacteriocin sn xut bi Bacillus circulans và
chng Paenibacillus polymyxa (SRCAM 37, SRCAM 602, SRCAM
1580) thuc lp này.
 Lp ph II.2 bao gm peptide gingănhăthuricinăvi mt motif bo tn
DWTXWSXL gnăđu N, chng hnănhăbacthuricinăF4,ăthurincinăHăvƠă
thurincinsă Să vƠă 17ă đc sn xut bi các chng B.thuringiensis, và
cerein MRX1 sn xut bi các chngB.cereus.
 Lp ph II.3 bao gm các peptide tuyn tính khác, chng hnă nhă
lichenin sn xut bi B.licheniformis, hoc cereins 7A và 7B.
 Lp III bao gm các protein ln (430 kDa) vi các hotă đng ca
phospholipaseăănh:ămegacinsăA-216 và A-19.213ăđc sn xut bi các
chng vi khun B.megaterium.
 Nhiu polypeptide kháng khunăkhácăcóăkíchăthc trung bình (10-30 kDa)
và các protein kháng khun lnăkhácăđc sn sinh bi trc khun không
đc bao gmătrongă chngătrìnhă phơnăloi này do thiu các d liu v
protein hoc trình t gen, mc dù chúng s đc mô t trongăcácăvnăbn
di các th loi ca BLIS_nhng cht kháng khun mà không có tính cht
đcătrng.