BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNGNHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

Tên

Đề

tài:



VIỆN

CÔNG

NGHIỆP

THỰC

PHẨM
Chủ

nhiệm

đề

tài

:

TS.

NGUYỄN

LA

ANH

NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Tên

Đề

tài:NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẤT BẢO QUẢN SINH HỌC
BACTERIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH CÓ ỨNG DỤNG TRONG
CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
MÃ

(
ký

tên

đóng

dấu

trước

gửi

lưu

trữ)
1.2.5. Sinh tổng hợp và điều hòa phiên mã…………………… 14

1.2.6. Sự liên hệ giữa các tính trạng lên men sucrose, sinh tổng hợp nisin và kháng
nisin……………………………………………… ……………………….16
1.2.7. Sự ổn định tính trạng Suc-Nis…………………………………………… 17

1.2.8. Sự sắp xếp lại plasmid của Lactococcus trong quá trình ít dinh dưỡng kéo
dài………………………………………………………………… …… 18
1.3. Ứng dụng bacterioxin và nisin………………………………………… … ….…21

1.4. Công nghệ sản xuất sản xuất nisin…………………………………… …… ….26

1.4.1. Công nghệ lên men……………………………… ………………………26

1.4.2. Công nghệ lên men kết hợp hấp phụ nisin…………………….………… 28

1.4.3. Công nghệ thu hồi ………………………………………….……….…28

1.5. Giới thiệu một số công nghệ tinh chế và thu nhận protein ……….…………….32

1.5.1. Chiết pha rắn ………………………………………………… …………32

1.5.2. Phương pháp lọc tiếp tuyến - cắt phân đoạn ……………….……….……35

1.5.3. Phương pháp sấy phun………………………………………….…………39

1.5.4. Phương pháp sấy phun xung đốt………………………………… ………42

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 45



2.2.12. Phương pháp tách DNA tổng số……………………………………… ….50

2.2.13. Phương pháp đinh tên bằng đọc trình tự đoạn gen V1-V3 16S r.DNA… 50

2.2.14. Phương pháp tách plasmid……………………………………………… 51

2.2.15. Phương pháp PCR để tách dòng gen nis………………………………… 51

2.2.16. Tinh sạch sản phẩm DNA gen nis…………………….………………… 52

2.2.17. Xác định trình tự gene nis bằng phương pháp đọc trình tự trực tiếp…… 52

2.2.18. Xác định trình tự gene nis thông qua AT cloning…………………………53

2.2.19. Phương pháp xác định kích thước phân tử bacterioxin……………………53

2.2.20. Phương pháp Điện di Tricine –SDS – PAGE…………………………… 54

2.2.21. Phương pháp đọc trình tự amino acid từ N- terminus…………………… 54

2.2.22. Xác định hoạt tính bacterioxin bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch….55

2.2.23. Xác định hoạt tính nisin bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch …… 55

2.2.24. Xác định hoạt tính nisin bằng phương pháp HPLC……………………….56

2.2.25. Phương pháp xác định sinh khối………………………………………… 57

2.2.26. Phương pháp xác định đường tổng……………………………………… 57

3.3.3. Khảo sát tính nhạy cảm với kháng sinh clindamycin… 69

3.4. Nghiên cứu đặc điểm bacterioxin………………………………… ……….…….70

3.4.1. Khảo sát sự có mặt gen mã hóa nisin ở các chủng vi khuẩn ……….…….70

3.4.2. Đọc trình tự đoạn gen mã hóa nisin ………………………….………….71

3.4.2.1. Đặc điểm gen nis của chủng Lactococcus lactis subsp. lactis DSM

20729…………………………… ………………………………… 71

3.4.2.2. Trình thự gen nis của chủng Lactococcus garvieae BV20…………….72

3.4.2.3. Trình thự gen nis của chủng Lactococcus garvieae Tn63………….….73

3.4.2.4. Trình thự gen nis của chủng Lactococcus lactis subsp. lactis PĐ14… 74

3.4.3. Nghiên cứu đọc trình tự amino axit từ N-terminus…………….………….78

3.5. Ổn định hoạt tính chủng giống……………………………………….……………80

3.5.1. Sàng lọc phân lập chủng giống sinh tổng hợp nisin cao……….………….80

3.5.2. Xác định vị trí gen mã hóa nisin……………….………………………… 83

3.5.3. Nguyên nhân gây đến sự giảm hoạt tính…………….…………………….86

3.5.4. Ảnh hưởng quá trình hoạt hóa đến hoạt lực chủng giống…… …….……94



3.8.1.3.2. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng diatomite……………… 127

3.8.1.3.3. Thu hồi nisin bằng vật liệu hấp phụ là hạt trao đổi cation……….130

3.8.1.3.4. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng silica gel…………………… 133

3.8.1.3.5. Nghiên cứu thu thu hồi nisin bằng axit silicic……………………136

3.8.1.3.6. Kết luận nghiên cứu thu hồi nisin bằng vật liệu hấp phụ……… 141

3.8.1.4. Kết quả so sánh các phương pháp thu hồi nisin……………………… 142

3.8.2. Nghiên cứu các phương pháp tinh sạch……………………… …………143

3.8.2.1. Lọc và cô đặc dịch phản hấp phụ………………………………………143

3.8.2.2. Tinh sạch bằng SPE……………………………………………………145

3.8.3. Nghiên cứu các phương pháp tạo sản phẩm…………………………… 146

3.8.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt lực nisin trong dung dịch…….146

3.8.3.2. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của nisin………………………………146

3.8.3.3. Tạo sản phẩm bằng phương pháp sấy phun……………………………146

3.9. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bacterioxin……………………… … 150

3.10. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, phân tích tính vệ sinh an toàn thực phẩm của sản


3.11.2. Áp dụng sản phẩm tại cơ sở sản xuất sữa……………………………… 165

3.11.2.1. Xác định kháng khuẩn của nisin đối với chủng kiểm định
Listeria monocytogenes
ATCC13932…………………………………… 165
3.11.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng chất béo trong sữa đến khả năng nisin ức
chế Listeria monocytogenes ATCC13932……………………… 166
3.11.2.3. Ảnh hưởng của chất nhũ tương hóa đến khả năng nisin ức chế

Listeria monocytogenes ATCC13932 trong môi trường sữa…… 167

3.11.2.4. Ảnh hưởng của nisin và polysorbate 80 0,1% đến Listeria
monocytogenes ATCC13932 trong môi trường sữa…………… 169
3.11.2.5. Ứng dụng nisin và polysorbate 80 trong bảo quản sữa tươi trong điều
kiện phòng thí nghiệm……………………………………………170
3.11.2.6. Ứng dụng nisin và polysorbate 80 trong bảo quản sữa tươi tại cơ sở
sản xuất………………………………………………………… 172
CHƯƠNG IV. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC………………………………………… 173

4.1. Hoàn thành các nội dung nghiên cứu với kết quả có độ tin cậy cao ……………173

4.2. Sản phẩm của đề tài được thực hiện đầy đủ và cụ thể như sau………………… 174

4.3. Tác động đối với kinh tế, xã hội và môi trường………………………………….175

4.4. Một số hạn chế của đề tài……………………………………………………… 175

KẾT LUẬN……………………………………………………………………… …… 177


AU

Arbitary

Unit
bp

Base

pair(s)

CFU

Colony

Forming

Unit

CNTP

Ký

hiệu

chủng

giống

thuộc


DSM

Ký

hiệu

chủng

giống

thuộc

Bộ

sưu

tập

Vi

sinh

vật

và

Tế

bào

Agriculture

Organization

HPLC

High-performance

liquid

chromatography

or

high-pressure

liquid
chromatography

IU

International

Unit

JCM

Japanese

Collection

Minimal

Inhibitory

Concentration

MRS

CT1

Môi

trường

MRS

cải

tiến

số

1

MRS

CT2

Môi


Institute,

Japan

OD

Optical

density

RNA

Ribonucleic

acid

SDC

Sodium

deoxycholate

SDS

Sodium

dodecyl

sulfate


vi

sinh

vật

công

nghiệp,

Viện

Công

nghiệp

thực

phẩm

TCVN

Tiêu

chuẩn

Việt

Nam
TFA

Bảng 3.2. Một số đặc điểm của chủng LAB mới phân lập………… ………………… 62

Bảng 3.3. Một số đặc điểm các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh …63

Bảng 3.4. Sự nhậy cảm của bacterioxin với enzym proteinase………… …………… 65

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ bền của bacterioxin…………………….……65

Bảng 3.6. Một số đặc điểm sinh trưởng, sinh hóa………………………………….……66

Bảng 3.7. Một số đặc điểm hình thái, sinh trưởng, sinh hóa…………………………….66

Bảng 3.8. Một số khả năng lên men đường…………………….……………………… 67

Bảng 3.9. Sự tính nhảy cảm với clindamycin của các chủng nghiên cứu…………… …70

Bảng 3.10. Sự phát triển của chủng kiểm định khi có mặt bacterioxin với pH khác nhau 76

Bảng 3.11. Phổ kháng khuẩn của bacterioxin từ chủng 0-5 và DSM 20729…………… 76

Bảng 3.12. Tinh chế bacterioxin từ chủng 0-5… ……………………………………… 77

Bảng 3.13. Trình tự 18 amino acids từ đầu N-terminus của bacterioxin từ chủng 0-5……78

Bảng 3.14. Hoạt lực còn lại của các chủng dẫn xuất sau sàng lọc so với thời điểm bắt đầu
bảo quản (%)……………………………………………… ………….…… 87
Bảng 3.15. Khả năng sống sót của các chủng dẫn xuất sau sang lọc kể từ thời điểm bắt đầu
bảo quản……………………………………………………………………….89
Bảng 3.16. So sánh hoạt lực chủng giống bằng các phương pháp hoạt hóa khác nhau… 95



Bảng 3.29. Hiệu suất thu hồi nisin khi lên men kết hợp với hâp phụ với thời điểm bổ sung
acid silicic khác nhau……………… ………………………………………117
Bảng 3.30. Kết quả thu hồi nisin trong lên men tiếp dần nồng độ 50% cơ chất so với ban
đầu, kết hợp với hấp phụ……………………………………………………119
Bảng 3.31. Điều kiện bổ sung cơ chất với các nồng độ khác nhau …………………120

Bảng 3.32. Kết quả thí nghiệm lên men tiếp dần nồng độ kết hợp thu hồi với nồng độ bổ
sung cơ chất khác nhau………………………………………………… …121
Bảng 3.33. Động học của quá trình lên men theo mẻ quy mô thiết bị lên men………….122

Bảng 3.34. Kết quả thu hồi nisin bằng phương pháp hấp phụ-phản hấp phụ tế bào…… 124

Bảng 3.35. Kết quả thu hồi nisin bằng phương pháp kết tủa bởi amonium sulphate…….125

Bảng 3.36. Ảnh hưởng của tỷ lệ silicone tới khả năng hấp phụ nisin……………………126

Bảng 3.37. Ảnh hưởng của chất phản hấp phụ đến sự phản hấp phụ nisin từ diatomite 128

Bảng 3.38. Kết quả thu hồi nisin khi sử dụng diatomite với các tỷ lệ khác nhau……… 129

Bảng 3.39. Ảnh hưởng của nồng độ SDS tới hiệu quả phản hấp phụ nisin từ diatomite 129

Bảng 3.40. Ảnh hưởng của tỷ lệ hạt trao đổi cation tới khả năng hấp phụ nisin … … 131

Bảng 3.41. Ảnh hưởng của pH dịch canh trường tới khả năng hấp phụ nisin của hạt trao

đổi cation……………………… ………………………………………… 132

Bảng 3.42. Ảnh hưởng của các chất phản hấp phụ đến sự phản hấp phụ nisin từ hạt trao

Bảng 3.56. Các kết quả phân tích dịch thu hồi trong SPE………………………………146

Bảng 3.57. Sự bền hoạt tính của nisin ở các pH khác nhau theo thời gian………………147

Bảng 3.58. Khảo sát nhiệt độ đầu vào trong việc tạo sản phẩm sấy phun……………….148

Bảng 3.59. Tinh sạch và thu nhận sản phẩm nisin thô và tinh………………… ………148

Bảng 3.60. Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của nisin thô……………………………….153

Bảng 3.61. Các chỉ tiêu vi sinh vật của nisin thô……………………………………… 153

Bảng 3.62. Hàm lượng kim loại nặng của nisin thô…………………………………… 153

Bảng 3.63. Hàm lượng các chất không mong muốn của nisin thô …………………….154

Bảng 3.64. Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của nisin tinh………………………………154

Bảng 3.65. Các chỉ tiêu vi sinh vật của nisin tinh……………………………………… 154

Bảng 3.66. Hàm lượng kim loại nặng của nisin tinh…………………………………… 155

Bảng 3.67. Hàm lượng các chất không mong muốn của nisin tinh………………………155

Bảng 3.68. Một số chỉ tiêu hóa học của nước mắm…………………………………… 156

Bảng 3.69. Chỉ số vi sinh của các mẫu nước mắm……………………………………….156

Bảng 3.70. Ảnh hưởng nồng độ muối đến khả năng nisin ức chế S. aureus CNTP6083 157



Hình 1.2. Mô hình nisin tấn công làm thủng màng tế bào………………………………13

Hình 1.3. Các gen tham gia vào sản xuất nisin Z, điều hòa và đề kháng………… … 15

Hình 1.4. Điện di agarose gel plasmid DNA…………………………………………….17

Hình 1.5. Điện di thành phần plasmid………………………………………………… 18

Hình 1.6. Sơ đồ phương pháp lọc dòng chảy ngang…………………………………….35

Hình 1.7. Dòng tuần hoàn của phương pháp lọc dòng chảy ngang…………………… 36

Hình 1.8. Phân loại các dạng lọc dòng chảy ngang theo kích cỡ lỗ trên vật liệu lọc……38

Hình 1.9. Mô hình, thiết bị và vật liệu trong lọc dòng chảy ngang…………………… 39

Hình 1.10. Sơ đồ hoạt động của máy sấy phun………………………………………… 41

Hình 1.11. Các loại đầu phun của máy sấy phun SDX®…………………………………42

Hình 1.12. Sơ đồ máy sấy phun xung đốt…………………………………………………43

Hình 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin………… 63

Hình 3.2. Kiểm tra hoạt lực tính bacterioxin của vi khuẩn lactic bằng phương pháp
khuếch tán đĩa thạch với chủng kiểm định JCM 1149……………………… 64
Hình 3.3. Phát hiện gen mã hóa prenisin………… ……………………………………69

Hình 3.4. Các cấu tử bacterioxin do chủng 0-5 sinh tổng hợp………………………… 77


Hình 3.19. Khả năng sinh tổng hợp nisin của chủng DSM 20729 đã qua quy trình ổn định
hoạt lực chủng giống trên quy mô bình tam giác và thiết bị lên men……….123
Hình 3.20. So sánh hiệu quả của các phương pháp thu hồi nisin……………………… 143

Hình 3.21. Điện di về các mẫu thu nhận và tinh sạch nisin từ DSM 20729…………… 146

Hình 3.22. Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm nisin từ chủng vi khuẩn Lactococcus
lactis subsp. lactis DSM 20729 ( hay CNTP 6520)…………………… ….150
Hình 3.23. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lưc của nisin ức chế Bacillus cereus

CNTP6089 và Staphylococcus aureus CNTP6083………………………….158

Hình 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hoạt lực nisin theo thời gian…………….159

Hình 3.25. Nồng độ nisin và khả năng ức chế Bacillus cereus CNTP6089 và

Staphylococcus aureus CNTP6083 ……………………………………… 160

Hình 3.26. Ảnh hưởng của nisin đến B. cereus CNTP6089 và S. aureus CNTP6083 trong
lên men nước mắm………………………………………………………… 161
Hình 3.27. Ảnh hưởng của nisin đến S.aureus CNTP6083 và B.cereus CNTP6089 bổ sung
trong nước mắm thành phẩm……………………………………………… 162
Hình 3.28. Sơ đồ ứng dụng nisin trong quá trình chế biến và bảo quản nước mắm tại Công
ty Cổ phần Thủy sản Nghệ An………………………………………………164
Hình 3.29. Đường cong chuẩn của nisin ức chế Listeria monocytogenes ATCC13932 166
1MỞ ĐẦU

tổng

hợp

hóa

học

truyền

thống.

Nhu

cầu

về

chất

bảo

quản

tự

nhiên

này



phổ

biển.

Việc

sử
dụng

chất

kháng

sinh

có

nguốn

gốc

hoá

học

trong

công



nghiêm

cấm

sử

dụng

do

khó

bị

phân
huỷ,

để

lại

dư

lượng

trong

thực


hệ

vi

sinh

vật

đường

ruột.

Do

đó

chất

bảo

quản
thực

phẩm

có

nguồn

gốc

sản

xuất.

Hiện

nay

các

chất

bảo

quản

này

được

sản

xuất

chủ

yếu

bởi


giới

bacterioxin

được

sản

xuất

bằng

công

nghệ

lên

men

vi

sinh

bởi

vi
khuẩn

lactic

được

coi

là

an

toàn.

Tìm

kiếm

các

dạng

khác

nhau

của

bacterioxin

là

hướng



tính mới,

ứng

dụng

cao,

nhằm

cung

cấp

các

thông

tin

trong

việc

giải

thích

mối

nay

còn

chưa

được
sáng

tỏ

hoàn

toàn.Bacterioxin

được

nghiên

cứu

nhiều

nhất

là


phát

hiện

ra

nisin

-

chất

bảo
quản

sinh

học

có

giá

trị

vào

đầu

thế


điểm

của

phương

pháp

sử

dụng

hoá

chất,

chất

kháng sinh

có

nguồn

gốc

hoá

học,


của

nisin

khá

rộng

bao

gồm

các

sản

phẩm

tươi

sống

như

thịt, cá,

sữa,

rau


và nhiệt

độ

thanh

trùng

của

các

sản

phẩm

dẫn

tới

hiệu

quả

kinh

tế

cao,


hưởng

tới

sức khoẻ

con

người,

có

khả

năng

phân

huỷ

trong

cơ

thể

con

người


30

phút.

2Trên

thế

giới,

sự

phát

triển

mạnh

mẽ

của

ngành

công



ứng

dụng

bacterioxin

đã

đạt được

nhiều

thành

công

trong

các

lĩnh

vực

khác

nhau

như

giới

hiện

nay

là

tìm kiếm

các

bacterioxin

mới,

nghiên

cứu

sản

xuất

và

ứng

dụng



kỹ

thuật

lên

men

hiệu quả,

nâng

cao

hiệu

suất

thu

hồi,

xây

dựng

các

phương

ở

vi

khuẩn

lactic

chỉ

mới

bắt

đầu
trong

những

năm

gần

đây

và

đạt

được

phát

triển

công

nghệ

sinh

nhằm

hình

thành

và

phát

triển

ngành
công

nghiệp

sinh

học

dược

và

bảo

vệ

môi

trường,

sự

quan

tâm

của

các

khoa

học

đến

nghiên cứu


là

hiện

tượng

đáng

khích

lệ.

Để

thực

hiện

được

nhiệm

vụ

này,

việc

hợp


nghệ

sinh học

phát

triển

là

rất

cần

thiết.

Giáo

sư,

tiến

sĩ

Jun

Shima

nguyên


Thực

phẩm Quốc

gia

(Tsukuba,

Nhật

Bản),

đến

4/2010

ông

giữ

trách

nhiệm

Chủ

nhiệm

Bộ phận


Kyoto. Ông

là

chuyên

gia

có

nhiều

năm

nghiên

cứu

về

các

hoạt

chất

kháng

sinh,


với

doanh
nghiệp,

tham

gia

hướng

dẫn

đào

tạo

các

nghiên

cứu

viên

trong

và

ngoài


Nhật

Bản

thực

hiện đề

tài

nghị

định

thư

“

Nghiên

cứu

công

nghệ

sản

xuất

công

nghiệp

thực

phẩm”
với

các

mục

tiêu

như

sau:

(i)-

Có

được

bộ

chủng

vi

định;

(ii)-

Có

được

quy

trình

công
nghệ

sản

xuất

nisin

bằng

phương

pháp

sinh

tổng

sản

xuất

sữa

và

nước

mắm

.

3CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1.

Giới

thiệu

về

bacterioxin

và


tạo

ra

bởi

vi

khuẩn,

có

bản

chất

là
polypeptide,

có

đặc

tính

tiêu

diệt



2001)
.

Bacterioxin

có

hoạt

tính

kháng

khuẩn,

được

sản

sinh

ra

bởi
nhiều

nhóm

vi

tử

lượng,

đặc

điểm

sinh

hóa

và

nguồn

gốc

gen

(Klaenhammer

1993).Bacterioxin

được

biết

coli

có

tác

dụng

chống

lại

các

chủng

E.

coli

khác.

Đến

năm

1953

Jacob



khả

năng kháng

khuẩn.Bacterioxin

được

phát

hiện

ở

cả

vi

khuẩn

Gram

dương

và



quả,

mức

độ

an

toàn

và

khả
năng

ứng

dụng

làm

chất

bảo

quản

tự



biến

thực

phẩm.

Trên

thế

giới
bacterioxin

được

sản

xuất

bằng

công

nghệ

lên

men



các

peptide

mang

điện

dương,

có
kích

cơ

nhỏ,

được

tổng

hợp

tại

ribosome

và



vi

khuẩn

lactic

bao

gồm

các

nhóm

sau

đây

(Klaenhammer

1993):-

Nhóm

I:



chịu

nhiệt,

có

chứa

Lanthionine

hoặc

β
-methyllanthionine

s

và
một

số

axit

amin

dehydrat

(2,3-didehydroalanine

Bacterioxin

nhỏ,

kích

thước

phân

tử

thường

nhỏ

hơn

10Kda,

chịu nhiệt

không

chứa

Lanthionine

;


peptide;

(IIc)-

bacterioxin

vòng,

được

kích

hoạt

bởi nhóm

thiol.-

Nhóm

III:

Bacteriolysin

hoặc

protein

IV:

Bacterioxin

có

cấu

tạo

phức

giữa

peptide/

protein

với

các

nhóm

khác.Trong

nhiều


cùng

một

nhóm

(De

Vuyst

&

Leroy,

2007).

Sự

đa

dạng

về

bacterioxin

được

thể hiện


là

các peptide

mang

điện

dương

và

có

khả

năng

thấm

qua

màng

tế

bào,

gây


dẫn

đến

tiêu

diệt

tế

bào (Klaenhammer

1988,1993;

Jack

và

cs.

,1995).

Nhóm

lantibiotics

là

nhóm


có

khả

năng phân

tử

nhỏ

hơn

5

kDa,

có

khả

năng

chịu

nhiệt,

chứa

các


được

phát

hiện

có

đặc

tính

ức

chế một

số

vi

khuẩn

Gram

dương,

trong

đó


monocytogenes,

Bacillus cereus

Bacterioxin

cũng

được

chứng

minh

có

tác

dụng

lên

vi

khuẩn

Gram

âm


bởi

các

yếu

tố sau:

sốc

thẩm

thấu,

pH

thấp,

sự

có

mặt

của

chất

bề


(Stevens

và

cs.,

1991).Bảng

1.1.

Một

số

bacterioxin

từ

vi

khuẩn

lacticBacterioxin

Lactococcin M Lactococcus lactis Hẹp 48

Mesenterocin 52B
Leuconostoc
mesenteroides

Hẹp

32
Curvaticin FS47 Lactobacillus curvatus Trung bình 31
Bacterioxin giống Pediocin
Sakacin A Lactobacillus sake Trung bình 41
Sakacin P Lactobacillus sake Trung bình 41
CarnoBacterioxin A,B Carnobacterium piscicola Trung bình 48; 53
Pediocin AcH/PA-1 Pediococcus acidilactici Trung bình 44
Leucocin A-UAL-187 Leuconostoc gelidum Trung bình 37
Enterocin 1146/A Enterococcus faecium Trung bình 47
Piscicolin 126 Carnobacterium piscicola Trung bình 44

Mesenterocin Y105
Leuconostoc
mesenteroides

Trung bình

37
Nhóm III: Kích thước lớn, kém bền nhiệt
Helveticin J Lactobacillus helveticus Hẹp 333

Bacterioxin

1994).

Một

số

bacterioxin

không

nhạy

cảm

với

dịch

vị

thường

được

sử
dụng

trong

sản

Lb.

plantarum

không

bị

ảnh

hưởng

bởi

tác

dụng

của

một số

enzym

như

lipase,

amylase


cứu

gần

đây

đã

công

bố

những

phát

hiện

mới

về

bacterioxin

ở

các loài

thuộc


ở

chủng

Lb.

brevis

(Filipov,

1979;

Benoit

và

cs.,

1997),

bacterioxin

từ

P.

acidilactici

(Bhunia


(Filipov,

1979),

từ

Lb.

pentosus

(Okkers

và

cs.,

1999),

divercin

từ

Carnobacterium

divergen(
Metivier


2000),

mundticin

từ

Enterococcus

mundtii

(Kawamoto

và

cs.,

2002),
enterocin

từ

Enterococcus

faecium

(Đỗ

Thị

Huyền,

muối

chua

và

sản

phẩm

từ

sữa

(Diop
và

cs.,

2007;

Leroy

&

De

Vuyst,

2004;

nghiên

cứu

được

nhiều nhà

khoa

học

tham

gia

theo

đuổi,

nhằm

tìm

ra

các

bacterioxin


các

thông

tin

quý

báu

trong

việc giải

thích

mối

liên

hệ

giữa

cấu

trúc

và


và

cs.,

1976;

Eijsink

và

cs.,

1998;

Sato

và

cs.,

2002;
Sakayori

và

cs.,

2003).

Bacterioxin

khác

thường

yếu

hơn.

Sự

đa

dạng

vi

khẩn

lactic

sinh bacterioxins

thể

hiện

trên

bảng



vậy

đã
có

nhiều

công

trình

về

xây

dựng

các

công

cụ

gen

để

biểu



gen

khởi

động

cấu

trúc
(consitutive

promotor)

của

Lac.

lactis

để

sản

xuất

protein

có



biểu

hiện

được

kiểm

soát

bởi
gen

khởi

động

cảm

ứng

bởi

nisin

(NICE-

nisin



dạng

vi

khuẩn

lactic

sinh

tổng

hợp

bacterioxin

Vi khuẩn lactic sinh tổng hợp
bacterioxin
Tên bacterioxin Trích dẫn
Lactobacillus
Lb. plantarum plantaricin A Nissen-Meyer và cs., 1993
Lb. plantarum plantaricin EF Anderssen và cs., 1998
Lb. plantarum plantaricin JK Anderssen và cs., 1998
Lb. plantarum plantaricin S Jimenez-Diaz và cs., 1995
Lb. plantarum LL441 plantaricin C Gonzalez và cs., 1994
Lb. acidophilus acidocin B Leer và cs., 1995
Lb. acidophilus JCM1132 acidocin J1132 Tahara và cs., 1996
Lb. acidophilus TK9201 acidocin A Kanatani và cs., 1995
Lb. heleveticus helveticin J Joerger & Klaenhammer, 1986

Lactostrepsin
Van Belkum và cs., 1991
Martinez và cs.,1999
Ivanova và cs., 2000
Zajdel et al., 1985
Pediococcus
Pediococcus acidilactici pediocin PA-1/AcH Bhunia và cs., 1988;
Henderson và cs., 1992;
Motlagh và cs., 1992
Pediococcus pentosaceous Pediocin Piva & Headon, 1994
Pediococcus acidilactici PAC
1.0
pediocin PA-1 Cintas và cs., 1998
Eijsink và cs., 1998
Chikindas và cs., 1993;
Martinez và cs.,1998
Carnobacterium
Carnobacterium spp. Carnocin Stoffels và cs., 1992
Carnobacterium piscicola Piscicolin Schillinger và cs., 1993
Carnobacterium divergen divercin Metivier và cs., 1998
Enterococcus
E. faecium enterocin Aymerich và cs., 1996;
Đỗ Thị Huyền, 2009
E. mundtii mundticin Kawamoto và cs., 2002
8
được

nghiên

cứu

nhiều

nhất

là

nisin

được

sinh

tổng

hợp

bởi
Lactococcus

lactis

subsp.

lactis.

ức

chế

Lactobacillus

bulgaricus

(Rogers

và

Whittier,

1928).

Tên

nisin

được

Mattick

và

Hirsch

(1947)



ban

đầu

đươc

phân

vào

nhóm

N
Streptococcus
.Khi

được

phát

hiện

vào

năm



ức

chế

sinh

học

do

Streptococcus

lactis

sinh

tổng
hợp.

Năm

1985,

theo

khoá

phân



Streptococcus

mesophiles

(ưa

ấm)

và
Streptococcus

thermophiles

(ưa

nhiệt).

Nhóm

Streptococcus

mesophiles

bao

gồm

2 loài



loài

Lactococcus

lactis

(Schleifert

và

cs.,

1985).

Theo

khóa

phân

loại chi

Lactococcus

có

7

loài


loài

Lactococcus

garvieae

và

Lactococcus

lactis

rất

xa

nhau

về

mặt

phả hệ

là

nhưng

lại


này đựơc

thực

hiện

bởi

các

kỹ

thuật

DNA

homology

(Garvie

và

cs.,

1981),

phân

tích


1991), hoặc

các

phương

pháp

khác

như

xác

định

sự

kháng

với

clindamycin

(Collins

và

cs.,


hiệu

với

Lac.
garvieae

(Zlotkin

và

cs.,

1998).

Theo

Elliott

và

Facklam

(1996),

MIC

clindamycin (µg/ml)


8µg/ml.Lactoccocus

lactis

là

vi

khuẩn

Gram

âm

được

sử

dụng

phổ

biến

trong

sản


chuỗi

ngắn,

đường

kính

tế bào

từ

0,5-1,5µm

tuỳ

thuộc

vào

điều

kiện

sinh

trưởng.

Chúng

(pH

9,6

trở

lên)

và

có

thể

sinh
trưởng

trong

môi

trường

sữa

chứa

0,1%

xanh


năng

tạo

bào

tử,

không

di

động

và

là

vi khuẩn

Gram

(+).

Trong

điều

kiện

dạng

khuẩn

lạc

màu

vàng

sáng.

Chúng

thực

hiện qúa

9

trình

lên

men

đồng

hình,


axít

lactic

D(-)

khi

nuôi

cấy

trong

điều

kiện

pH

thấp.

Khả

năng tạo

axít

lactic


đóng

vai

trò quan

trọng

nhất

trong

công

nghiệp

sữa.

Lac.

lactis

là

loại

vi

khuẩn



(buttermilk),

sữa

chua, pho

mát.

Khi

Lac.

lactis

được

thêm

vào

sữa,

chúng

sử

dụng

enzym


khuẩn

làm

đông

sữa

và

được

sử dụng

để

sản

xuất

pho

mát

và

sữa

tương

nghệ

sản

xuất

các
loại

rau

muối

chua,

bia,

rượu

vang,

một

số

loại

bánh

mỳ


tưởng

rằng

việc

hiểu

biết

về

đặc

tính sinh

lý

và

di

truyền

của

loài

vi


lợi

quý.1.2.2.

Cấu

trúc

phân

tử

của

nisinCông

thức

hoàn

chỉnh

của

34

axit

amin

trong

đó

có

một

số

axit

amin

dị

thường

như

sự

khử


nhau

qua

cầu

nối

lưu

huỳnh

tạo

5

vòng

đặc

trưng

(Gross

và

Morell,

1971)
.

lanthionine

và

3-methyllanthionine

(Klaenhammer,

1993).

Đến

nay

người

ta

đã

phát

hiện

ra

4

dạng


1991),

nisin

Q

(Zendo

và

cs.,

2003)

và

nisin

F
(Kwaadsteniet

và

cs.,

2008).

NisA

và

NisA

và

NisF

khác

nhau

ở

2

vị

trí

axit

amin

thứ

27

(NisA-
histidin;

NisF-


NisA

ở

4

axit

amin

(ở

vị

trí

thứ

tự

15,

21,

27

và

30)


15,

21

và

30).

Tìm

kiếm

các

dạng

khác

nhau

của bacterioxin

là

hướng

nghiên

cứu

đặc

tính

ứng

dụng

cao;

nhằm

so

sánh

các

bacterioxin

để

cung
cấp

các

thông

tin

của

bacterioxin

–

một

vấn

đề

đến

nay

còn

chưa

hoàn

toàn

được

sáng

tỏ


2003).

Ala-S-Ala : Lanthionine ; Abu-S-Ala: 3-methyllanthionine ;
DHA : dehydroalanine
DHB : Dehydrobutyrine
( β-metyldehydroalanine) Hình

1.1.



tương

tự

colixin,

khoảng

cách

của

cầu

nối

C

–

S

là

1,83A¨


amino

và

cacboxyl

ở

cuối

nhóm,
năm

vòng

bên

trong

được

tạo

bởi

liên

kết

thioether.


Ngoài

cầu

nối disulfide

giữa

dạng

lanthionine

với

methyllanthionine,

mạch

peptide

còn

nối

với

nhau bằng

–NH

sóng

260

nm

hay

280

nm

do

trong

cấu

trúc

phân

tử

của

nó

không


lượng phân

tử

khoảng

7000

và

14000

Da

(Bailey

và

Hurst,

1971).1.2.3.

Tính

chất

của

nisin

phụ

thuộc

nhiều
vào

pH.

Khi

thanh

trùng

ở

115
0
C

nisin

vẫn

bền

ở

90%

ở

pH

6,8.

Khi

pH

>7

xảy

ra

hiện

tượng

mất

hoạt

tính

không


của

nisin

tốt

nhất

ở

pH

2,

tại

pH

2,5

giảm

xuống

còn

60%,

tại
pH


kiềm.

Khi

hoà tan

nisin

trong

HCl

pH

2,5

(hoặc

thấp

hơn),

tại

nhiệt

độ

sôi


Nisin

có

độ

hoà

tan

thấp

ở

pH

sinh lý

(Hurst,

1981).Nồng

độ

muối



NaCl

từ

0%

đến

4%.

Trong

dung

dịch

4

–

10%

NaCl,

hoạt

tính

nisin

năng

áp

dụng
nisin

trong

bảo

quản

các

sản

phẩm

thực

phẩm

có

nồng

độ

muối

Bacillus

cereus

và

nisinase

của

Streptococcus

thermophilus
.

Nisin

thường

bị

hạn

chế bởi

một

số

protease


nước

bọt

của

con

người

sau

hơn

10

phút

ăn

thực

phẩm

có

chứa

nisin.


thực

phẩm

an
toàn

đối

với

con

người

được

tin

tưởng

sử

dụng

hiện

nay.


khuẩn

gram

dương,

đặc

biệt

là

các

vi

khuẩn

gây

bệnh,
gây

hỏng

thực

phẩm

như


Hurst,

1981;

Rauch

và

De

Vos,

1992).

Đối

với

bào

tử,

nisin

có

khả

năng

và

tiêu

diệt

vi

khuẩn

Gram (-
)

nhưng

khi

kết

hợp

với

EDTA

hoặc

một

vài


triển

của

vài

loại

vi

khuẩn

này

(Blackburn

và
cs.,1989;

Stevens

và

cs.,

1991).Nisin


vi
khuẩn

Gram

(+).

Tác

dụng

của

nisin

lên

tế

bào

tại

pha

sinh

trưởng



1996).

Nguyên

nhân

do

sự

phá
vỡ

các

tổ

chức

cục

bộ

trên

màng

tế


bào

chất

và

làm

chết

tế

bào

vi

sinh

vật

đó

(

Garriga

và

cs.,



năng

ức

chế

và

tiêu
diệt

vi

khuẩn

Gram

(-),

trừ

Salmonella

typhimurium
,

E.

coli

nào

của

vi

khuẩn

lactic

đối

với

vi

khuẩn

Gram

(-) đều

do

các

nguyên

nhân



tính

kỵ

nước

của

chúng.

Điều

này

được

giải

thích

là

do

sự

khác

nhau của


lỗ

thủng trên

thành

tế

bào

Gram

(+)

mà

không

tạo

được

lỗ

thủng

trên

thành


bao

gồm

2

kiểu

hình

(Hình

1.2). Kiểu

tác

dụng

không

đặc

trưng:

nisin

bám

dính

một

thụ

thể

đặc

biệt

nào

của

vi

khuẩn

Gram

(+)

và

phá

thủng
màng

tế


và

cs.,

1994;

Gao

và

cs.,

1991).

Kiểu

hình

thứ

2:

nisin

tương

tác

đặc

và

cs.,

2001)

và

sự

tương tắc

đặc

hiệu

có

sự

tham

gia

của

2

peptide



của

nisin

lên

các

loại

vi

khuẩn

rất

khác

nhau,

phụ

thuộc

vào
thành

phần


(+),

peptidoglycan

chiếm

90%

khối

lượng

thành

tế

bào,

số

lớp peptidoglycan

có

thể

lên

tới


khối

lượng

thành

tế

bào,

ngoài

ra

chúng

còn

có

một lớp

màng

ngoài

quan

trọng


nguyên

sinh

chất

nhưng

không

chỉ

có

phospholipid

hình

thành nên

cấu

trúc

mà

còn

có


trúc

lipopolysaccharide

đặc

biệt

bên

ngoài

thành