BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
LÊ PHƯƠNG HÀ
TÊN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN CHITOSAN NHẰM
TĂNG CƯỜNG HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN
THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN
THỰC PHẨM
Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG
Buôn Ma Thuột, năm 2009
i
ii
LỜI CẢM ƠN !
Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi xin gởi lời
cảm ơn chân thành ñến:
Ban giám hiệu trường Đại học Tây Nguyên.
Các thầy cô Khoa sau Đại học, Khoa KHKT&CN Trường Đại học
Tây Nguyên.
Các thầy cô phòng thí nghiệm Sinh học thực vật – Khoa Nông Lâm
Nghiệp Trường Đại học Tây nguyên ñã ñộng viên và giúp ñỡ cho tôi sớm
hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị, các bạn ñồng nghiệp và ñặc
biệt là Khoa Trồng Trọt trường Cao ñẳng Công Nghệ và Kinh Tế Bảo Lộc
ñã luôn tạo ñiều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian
công tác và học tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến PGS.TS Nguyễn Anh
Dũng, người ñã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ dạy và giúp ñỡ trong suốt
thời gian học tập và thực hiện luận văn.
Xin ghi nhận sự giúp ñỡ của các anh chị trong lớp Cao học Sinh Học
Thực Nghiệm K1 ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng tôi vô cùng biết ơn sự quan tâm , khích lệ của người thân
trong gia ñình ñã luôn luôn ñộng viên về mọi mặt ñể tôi hoàn thành tốt khóa
học này.
Xin chân thành cảm ơn!
LÊ PHƯƠNG HÀ
1.3.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus 28
iv
1.3.2.1. Đặc ñiểm chung 28
1.3.2.2. Phòng bệnh và chữa bệnh 29
Phần 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 30
2.1. Nội dung nghiên cứu 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu 30
2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu 30
2.2.2. Vật liệu hoá chất 30
2.2.3. Thiết kế thí nghiệm 30
2.2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 30
2.2.4. Các bước tiến hành 31
2.2.5. Phương pháp nghiên cứu cải biến chitosan 32
2.2.5.1. Phương pháp cải biến chitosan-glucose 32
2.2.5.2. Phương pháp cải biến chitosan-glucosamine 33
2.2.6. Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các dẫn suất
chitosan cải biến 33
2.2.6.1. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp ño ñộ ñục 33
2.2.6.2. Xác ñịnh khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên
ñĩa 34
2.2.7. Phương pháp thử nghiệm các dẫn suất chitosan cải biến trong bảo
quản thực phẩm 34
2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu 37
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Nghiên cứu chế tạo dẫn suất Chitosan cải biến 38
3.1.1. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và tỷ lệ nồng ñộ
chitosan/glucose ñến phản ứng Maillard 38
3.1.2. Ảnh hưởng khối lượng phân tử của chitosan và nồng ñộ ñường
glucose ñến phản ứng Maillard gắn glucosamine vào mạch chitosan 40
vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CGC Chitosan – glucose
CT1 Công thức 1
CT2 Công thức 2
CT3 Công thức 3
ĐC Đối chứng
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
CV Coefficient of Variation
Da Daton
ppm parts per million
CGC chitosan - glucose
LMWC khối lượng phân tử thấp
PEG polyethylene glycol
Bảng 3.4: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………………… 45
Bảng 3.5: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli………………………… 46
Bảng 3.6: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus………………… 48
Bảng 3.7: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli………………………… 50
Bảng 3.8: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose có khối lượng phân
tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus………………… 51
Bảng 3.9: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus……………….53
viii
Bảng 3.10: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 30000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………… 55
Bảng 3.11: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………… 56
Bảng 3.12: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 300000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………… 57
Bảng 3.13: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Staphylococcus aureus…………… 59
Bảng 3.14: Khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucosamine có khối lượng
phân tử 700000 Da ñối với vi khuẩn Escherichia coli…………………… 60
Bảng 3.15: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose
bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn S. aureus……… 62
Bảng 3.16: Kết quả xác ñịnh khả năng kháng khuẩn của chitosan - glucose
bằng phương pháp khuyếch tán trên ñĩa ñối với vi khuẩn Escherichia
coli………………………………………………………………………….63
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có
khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 25
0
C) ñến trạng thái
cảm quan của thịt………………………………………………………… 68
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có
khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ lạnh (5
0
C) ñến trạng thái cảm quan
của thịt…………………………………………………………………… 69
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có
khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ lạnh (5
0
C) ñến trạng thái cảm quan
của thịt…………………………………………………………………… 69
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucose có
khối lượng phân tử 700000Da ở nhiệt ñộ lạnh (5
0
C) ñến trạng thái cảm quan
của thịt…………………………………………………………………… 70
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine
có khối lượng phân tử 30000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 25
0
C) ñến trạng thái
cảm quan của thịt………………………………………………………… 71
x
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan – glucosamine
có khối lượng phân tử 300000Da ở nhiệt ñộ phòng (20 – 25
toàn xã hội và là vấn ñề thời sự ñược dư luận quan tâm, nhất là khi các cơ
quan chức năng mới phát hiện hàng loạt những vi phạm nghiêm trọng về vệ
sinh an toàn thực phẩm.
Khi xu hướng sử dụng các loại thực phẩm chế biến sẵn của thị trường
ñang gia tăng, ñặc biệt là ñối với các sản phẩm thịt chế biến cổ truyền của
Việt Nam như giò lụa, nem chua, lạp xưởng, xúc xích ñược người tiêu dùng
ngày càng ưa chuộng. Tuy nhiên, theo báo cáo của Chi cục Thú y Thành phố
Hồ Chí Minh (1999) cho thấy 50-60% mẫu xét nghiệm không ñạt tiêu chuẩn
vi sinh và sinh hóa. Ngộ ñộc thực phẩm do vi khuẩn và ñộc tố của nó thường
xảy ra do thiếu sót trong quá trình chế biến, công tác kiểm tra, thanh tra thực
phẩm và nguyên liệu dùng ñể chế biến thực phẩm. Loại ngộ ñộc này thường do
Salmonella enteritidis, Clostridium perfrigens, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Hiện nay, ñể bảo quản các loại thực phẩm tươi như thịt, cá, giò
chả… phần lớn người ta ñã sử dụng các chất hóa học như phân urê, hàn the,
benzoate natri, trong nước mắm có urê hay sử dụng formon trong làm bánh phở,
hàn the ñể làm chả nem, hầu hết các chất này khi vào cơ thể tích tụ lâu ngày sẽ
gây ảnh hưởng ñến sức khỏe của con người và nghiêm trọng hơn nữa là gây ra các
bệnh ung thư và làm giảm giá trị của thực phẩm.
Chitosan là một polimer sinh học, ñược tách từ vỏ tôm, cua, côn trùng, giáp
xác và tế bào nấm. Chitosan là một poly-glucosamin ñược cấu tạo từ các gốc
glucosamin kiên kết với nhau bằng liên kết
β
- 1,4 glucoside. Chitosan và các
sản phẩm thủy phân của chitosan là chitosan oligomer là các sản phẩm của tự
nhiên, không ñộc, không gây ô nhiểm môi trường nhưng có hoạt tính sinh học
rất cao. Chitosan ñược chứng minh là một chất có hoạt tính kháng khuẩn,
chống nấm và chống oxi hóa nhờ tính chất polycation tự nhiên nên có nhiều
ứng dụng trong nông nghiệp và bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên, enzyme của
3Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chitosan và chitosan oligomer
1.1.1. Công thức cấu tạo
Chitosan là một polymer sinh học với các ñơn phân N-acetyl
glucosamine ñược deacetyl hoá một phần, hiện diện tự nhiên trong vách một
số giống nấm như Mucorales (Muzarelli, 1993)[42]. Tuy nhiên, phần lớn
lượng chitosan hiện ñang ñược thu nhận và sử dụng lại chủ yếu từ quá trình
deacetyl hoá chitin, thành phần chính của trong bộ xương ngoài của ñộng vật
giáp xác như tôm, cua hay mực.
Chitosan dễ tan trong các acid hữu cơ như axít lactic, axít acetic. Khi
phân hủy chitosan bằng các tác nhân khác nhau như axít clohidric, enzyme
chitosanase, cellulase hoặc bức xạ gamma sẽ tạo nên các sản phẩm có chiều
dài mạch ngắn hơn gọi là oligoglucosamine. Hình 1.1: Cấu trúc của chitin, chitosan và cellulose. 4Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong ñó nhóm (-NH
nhất của chitosan là: phân tử lượng, mức ñộ deacetyl hoá và ñộ tinh sạch.
Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức –OH, -NHCOCH
3
trong các mắt xích axetyl-D-glucosamine và nhóm –OH, nhóm –NH
2
trong 5mắt xích D-glucosamine có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là
amit. Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế
O-, dẫn xuất thế N- hoặc dẫn xuất thế O-, N
Mặt khác chitosan là những polimer và các monomer ñược nối với
nhau bởi các liên kết b-(1,4)-glicoside, các liên kết này rất dễ bị cắt ñứt bởi
các chất hóa học như: acid, bazơ, tác nhân oxy hóa và các enzime thủy phân.
* Các phản ứng của nhóm –OH
Phản ứng của nhóm –OH có thể tạo ra các dẫn suất.
- Dẫn xuất sunfat.
- Dẫn xuất O-axyl của chitin/chitosan.
- Dẫn xuất O-tosyl hóa chitin/ chitoan.
* Phản ứng ở vị trí N.
- Phản ứng N-acetyl hóa chitosan.
- Dẫn xuất N-sunfat chitosan.
- Dẫn xuất N-glycochitosan(N-hydroxyl-etylchitosan).
- Dẫn xuất acroleylen chitosan.
* Các phản ứng xảy ra tại vị trí O, N.
-Dẫn xuất O,N-cacboxymetylchitosan.
+ Hiệu suất thu hồi các phân ñoạn cao.
+ Điều kiện diễn ra phản ứng thủy phân nhẹ nhàng, nhiệt ñộ thấp, pH
ôn hòa nên chi phí thiết bị thấp, không gây ô nhiễm môi trường.
+ Nhược ñiểm của phương pháp này là chi phí dành cho enzyme khá
cao.
1.1.3. Các ñặc tính của chitosan
Chitosan có ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công, nông nghiệp, y
dược, thực phẩm… nhờ vào những ñặc tính sau Antoni (2005)[73]:
- Tính chất ña ñiện ly mang ñiện tích dương (cationic polyelectrolyte) cho
phép gắn kết với các thành phần sinh học mang ñiện tích âm.
- Có thể tái sinh theo con ñường sinh học trên trái ñất.
- Có khả năng thủy phân sinh học bằng enzyme trong cơ thể.
- Có khả năng tương hợp sinh học với các cơ quan, mô và tế bào ñộng
thực vật.
- Có khả năng kích thích quá trình ñông máu và làm lành vết thương. 7- Có khả năng tương tác chuyên biệt với các thành phần của chất nền ngoại
bào và các nhân tố tăng trưởng.
- Giảm cholesterol do liên kết có chọn lọc với các lành axít béo.
- Không gây ñộc do các sản phẩm sau thủy phân ñều là các chất chuyển
hoá tự nhiên.
- Không gây ñáp ứng miễn dịch trong mô và cơ quan ñộng vật.
- Có tác dụng hỗ trợ trong ñiều hòa miễn dịch.
- Có thể xử lý tạo nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, màng, tấm xốp,
sợi, hạt, bột mịn, bông và gel.
1.1.4. Ứng dụng của chitosan và các dẫn suất
ñồng vị phóng xạ nguy hiểm từ nước bị nhiễm phóng xạ và thu hồi
uranium từ nước biển và nước ngọt.
- Loại bỏ 100% các polyme hiện diện trong nước thải.
- Giảm mùi hôi khó chịu (do làm giảm số lượng vi sinh vật gây thối)
- Một số ứng dụng mở rộng khác bao gồm: xử lý vệt dầu loang, xử lý
nước thải sinh hoạt, tái sử dụng nước hồ bơi, thu hồi protein và khoáng
từ nước thải nông nghiệp, phân lập các chất có hoạt tính sinh học trong
nước tiểu và tách các ñộc tố từ dung dịch.
+ Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm
Chitosan ñược dùng như một thành phần trong thực phẩm ở Nhật và
Châu Âu từ khoảng 20 năm trước. Chất này có tác dụng ổn ñịnh màu, mùi vị
của thực phẩm. Ngoài ra, chitosan còn thể hiện tác dụng tuyệt vời trong bảo
quản thực phẩm.
Ở Mỹ, chất này ñược sử dụng ñể "bẫy" lipid trong thực phẩm chức
năng chống béo phì. Chitosan ñược ưa chuộng không chỉ vì có tác dụng như
chất xơ, thành phần quan trọng trong khẩu phần ăn, mà còn gắn với lipid
trong dạ dày và ruột tạo thành một dạng chất mà cơ thể không thể hấp thu và
sẽ ñược loại thải ra ngoài. Các nghiên cứu cho thấy chitosan gắn ñược với
lượng chất béo gấp 4 lần khối lượng của chúng Andreu (2003)[14].
9+ Trong công nghiệp mỹ phẩm
Chitosan là loại polymer tích ñiện dương tự nhiên duy nhất có khả năng
chuyển thành dạng dung dịch nhớt khi hòa tan trong môi trường acid yếu.
Nhờ tính chất này mà chitosan ñã ñược ứng dụng rất nhiều trong sản phẩm
chăm sóc tóc như dầu gội, dầu xả và sản phẩm tạo nếp Harida (1996)[74].
ñiều hòa tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết. Chitosan ñược sử
dụng như chất mang tự nhiên ñể kếp hợp và phóng thích từ từ các hợp chất
mong muốn vào trong ñất. Chitosan bị phân hủy sinh học trong ñất trong
khoảng 2 tháng, kèm theo sự phóng thích các chất. Do ñó, người ta tiết kiệm
ñược ñáng kể lượng chất sử dụng và thời gian bón lặp khi dùng chitosan làm
chất mang.
+ Vỏ bao của hạt
Hoạt ñộng chitinase ñược gia tăng trong giai ñoạn nảy mầm khi bề mặt
của hạt giống ñược bao bằng một lớp chitosan. Khi sử dụng chitosan làm vỏ
bao của hạt, khả năng kháng nấm và vi khuẩn của chitosan hỗ trợ hữu hiệu
cho sự nảy mầm và sự phát triển của cây trồng.
+ Chất bổ sung vào thức ăn gia súc
Các khảo sát liên quan ñến việc bổ sung chitin và chitosan vào thức ăn
gia súc cho một số kết quả sau:
- Ở gà mái và gà giò, chitin và chitosan cho ăn hầu như ñược tiêu hoá
hoàn toàn.
- Ở thỏ khoảng 30% lượng chitin cho ăn ñược tiêu hoá hoàn toàn. Tỉ lệ
này hầu như không thay ñổi sau 25 ngày cho ăn liên tục. Trong khi ñó,
chitosan ñược tiêu hoá 35% sau 5 ngày cho ăn và khả năng này tăng tới
80% sau 15 ngày. Điều này có lẽ là do sự gia tăng số lượng vi khuẩn
ñường ruột, Antoni (2005)[73].
11
+ Kích thích tăng trưởng thực vật
Hiện nay, oligoglucosamine ñược xếp vào nhóm ñiều hoà sinh trưởng
thế hệ mới (Zubay, 1998)[75]. Hiện nay ñang ñược nghiên cứu sử dụng trong
(Suwalee, 2002) thử nghiệm phun chitosan cho cây ngô ñể trị bệnh bạc
lá, kết quả cho thấy nếu sử dụng nồng ñộ 80 ppm thì chitosan hiệu quả hơn và
an toàn hơn so với các loại thuốc bảo vệ thực vật trên thị trường. (Nguyễn
Anh Dũng, 2006)[62] nghiên cứu sử dụng chitosan oligomer và chitosan
oligomer cải biến ñể kháng nấm Fusarium, vi khuẩn gây bệnh héo xanh cho
lạc Pseudomnas solanacerum và tuyến trùng ký sinh Meloidogine incognita,
số lượng tuyến trùng ký sinh giảm từ 6-8 lần sau khi tưới chitosan oligomer 3
tháng. (Rabea, 2004) cũng nghiên cứu tổng hợp alkyl và aryl-chitosan sử
dụng làm thuốc trừ nấm và trừ sâu.
+ Bảo quản nông sản
Trong bảo quản thực phẩm, chitosan không những phát huy khả năng
kháng khuẩn và nấm, mà còn giúp ñiều chỉnh môi trường bên trong rau quả
thông qua kiểm soát quá trình trao ñổi khí giữa rau quả và môi trường
(Nguyễn Anh Dũng và các cộng sự, 1999). Dung dịch chitosan ñã ñược dùng
ñể tạo lớp màng bảo quản hoa quả và rau củ chống vi khuẩn và nấm. Ở Nhật,
dung dịch chitosan cũng ñược phun lên táo và cam cho mục ñích này. Nghiên
cứu của (André Bégin, 2003)[77] cũng ñề xuất quy trình bảo quản dâu bằng
chitosan. Chitosan còn ñược sử dụng ñể làm bao bảo vệ chống sương giá
(Andreu, 2003)[14].
(Ghaouth, 1996) nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng ức chế các
loại nấm gây hại sau thu hoạch rau quả như Rhizopus, Colletotrichum,
chitosan bảo quản dâu tươi và các loại trái cây khác lâu hơn do hạn chế nấm
gây hư thối và ức chế hô hấp. (Fajado, 1994) cho thấy chitosan ức chế nấm
mốc sinh ñộc tố A. flavus trên lạc, ñậu tương.
Sử dụng chitosan ñể bảo quản trái cây cũng rất ñược chú ý. Chitosan ñã
ñược sử dụng ñể bảo quản xoài, cam, dâu tây (Piyabutr, 2002; Varaporn,
2002; Chucheep, 2002). Sử dụng chitosan bao trái cây (coating) có thể kéo
dài thời gian bảo quản 15 ngày ở nhiệt ñộ phòng so với ñối chứng.
Copyright: Tài liệu đại học ©