MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Lúa gạo là cây lương thực chính của người dân Châu Á, cũng như ngô
của dân Châu Mỹ, hạt kê của dân Châu Phi hoặc lúa mì của dân Châu Âu và
Bắc Mỹ. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng đến lúa
gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa
gạo làm nguồn lương thực chính và hơn 110 quốc gia sản xuất và tiêu thụ gạo
với các mức độ khác nhau. Lượng lúa gạo được sản xuất ra và mức tiêu thụ
cao tập trung ở khu vực Châu Á. Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn
1,5 tỉ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á. Con số này ước
tính đã tăng lên gấp đôi, đối với những người này và người dân nghèo thường
dùng lúa gạo là nguồn lương thực chính, và là nguồn thức ăn chủ yếu cho
cuộc sống hằng ngày của họ. Khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu
hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và
vitamin hơn là năng lượng.
Lúa gạo là cây lương thực quan trọng nhất của nước ta và trồng lúa là
một nghề truyền thống của nhân dân Việt Nam từ rất xa xưa, từ người Việt
cổ. Kinh nghiệm sản xuất lúa đã được hình thành, tích lũy và phát triển cùng
với sự hình thành và phát triển của dân tộc ta. Những tiến bộ khoa học kỹ
thuật, sản xuất lúa trong nước và quốc tế đã thúc đẩy mạnh mẽ ngành trồng
lúa nước ta vươn lên bắt kịp trình độ tiên tiến của thế giới.
Những năm gần đây, Việt Nam đã tham gia vào thị trường lúa gạo
quốc tế với sản lượng gạo xuất khẩu hàng năm đứng thứ 2 trong số các nước
xuất khẩu gạo nhiều nhất thế giới. ĐBSCL và ĐBSH là hai vựa lúa lớn nhất
của cả nước, đã góp phần quan trọng trong thành quả chung đó.
Trong những năm qua Việt Nam đã chọn, tạo nhiều giống lúa có năng
suất cao, phẩm chất tốt. Tuy nhiên trong điều kiện khí hậu của Việt Nam nóng
ẩm quanh năm, các yếu tố như đất đai, cỏ dại, dịch bệnh và hạn hán diễn biến
rất phức tạp. Cây lúa dễ mắc các dịch bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra như
1
bệnh đạo ôn, khô vằn, bạc lá đã làm giảm chất lượng và năng suất của lúa từ

Ứng dụng qui trình tái sinh để chuyển gen Chitinase kháng bệnh đạo
ôn vào hai giống lúa DT
22
và lúa KDĐB nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Tạo ra giống lúa mang gen kháng bệnh đạo ôn
Sử dụng các kỹ thuật PCR để xác định cây lúa chuyển gen
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Xuất phát từ các mục tiêu nói trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các
nội dung sau:
Hiệu quả, thời gian và nồng độ thích hợp của hóa chất khử trùng với
hai giống lúa.
Bước đầu Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp để tạo callus, nhân
nhanh callus, tái sinh chồi từ callus và ra rễ.
Bước đầu xác định qui trình chuyển gen Chitinase vào hai giống lúa
DT
22
và lúa KDĐB nhờ Agrobacterium tumefaciens.
Sử dụng các kỹ thuật PCR để xác định cây lúa chuyển gen
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Ý nghĩa khoa học
Đề tài đã xác định được loại hóa chất, thời gian và nồng độ khử trùng
thích hợp đối với hai giống lúa nghiên cứu trên.
Bước đầu xác định được các điều kiện và thành phần môi trường thích
hợp cho việc tái sinh cây chuyển gen từ hai giống lúa trên. Tạo nguồn
nguyên liêu phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen.
Áp dụng qui trình tái sinh trong nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh
đạo ôn vào hai giống lúa DT
22
và lúa KDĐB nhờ Agrobacterium
tumefaciens.

Lúa Japonica thường được trồng ở những vùng ôn đới hoặc nơi có độ
cao trên 1000m (so với mặt nước biển), có thân ngắn, chống đổ, lá xanh đậm,
thẳng đứng, ít chồi, hạt gạo thường tròn, ngắn hoặc trung bình, dẻo khi nấu vì
hàm lượng tinh bột ít. Lúa Japonica thường có năng suất cao hơn Indica.
Lúa Japonica nhiệt đới được trồng phổ biến ở Indonesia, mang đặc
điểm của 2 loại lúa Japonica và Indica. Hình thức gần giống như lúa
Japonica, có lá rộng với nhiều lông và ít chồi, thân cứng, chắc và ít cảm
quang, hạt lúa thường có đuôi.
Lúa Oryra glaberrima được trồng ở tây Châu Phi cách đây 3500 năm.
Nguồn gốc của chúng có thể ở lưu vực sông Niger ở Mali, có thân cao như
Indica, gié lúa thẳng, có ít hoặc không có nhánh phụ. Hạt lúa không có lông
5
trên vỏ trấu, gạo đỏ, có thể kháng nhiều sâu bệnh và chịu được hạn, nhưng
năng suất kém hơn những loại lúa nói trên [43].
Nghiên cứu bằng isozyme, người ta có thể phân biệt O. sativa làm 6
nhóm rõ ràng hơn: Nhóm I (Indica), II, III, IV, V, và VI (Japonica). Trong đề
tài này chúng tôi sử dụng callus của loài O. sativa L. với hai thứ là: O. sativa
var. utitissima A. Camus (lúa tẻ) và O. sativa var. glutinosa Tanka (lúa nếp)
để tiến hành nghiên cứu [20].
1.2. Đặc điểm sinh học của lúa
Các giống lúa có nhiều đặc điểm khác nhau về chiều cao, thời gian
sinh trưởng, khả năng chịu thâm canh, chịu chua mặn, chống chịu sâu bệnh…
tuy nhiên, chúng đều có những đặc điểm chung về hình thái, giải phẫu và
sinh lý hóa sinh [10],[11],[19].
Trước hết về mặt hình thái, cơ quan sinh dưỡng của lúa bao gồm các
bộ phận như thân, lá, rễ, hoa và hạt, mỗi bộ phận đều có đặc điểm riêng phù
hợp với chức năng nhất định:
Rễ: rễ lúa là loại rễ chùm. Nó được chia làm hai loại: loại thứ nhất là
rễ mầm mọc từ phôi hạt, có tác dụng hút nước và chất dinh dưỡng đến lúc
cây có 3 lá, loại thứ 2 là rễ đốt mọc ra từ các đốt thân nằm dưới mặt đất, có

2
/ngày.
3. Yêu cầu về nhiệt độ: nhiệt độ làm lúa sinh trưởng nhanh hay chậm,
phát dục tốt hay xấu. Lúa sinh trưởng bình thường ở nhiệt độ 25 - 28
0
C. Nếu
nhiệt độ thấp hơn 17
0
C sinh trưởng của cây lúa chậm lại, thấp hơn 13
0
C thì
lúa ngừng sinh trưởng, nếu nhiệt độ thấp kéo dài nhiều ngày lúa có thể chết.
Nhiệt độ cao, trong phạm vi từ 28 - 35
0
C thì lúa sinh trưởng nhanh nhưng
chất lượng kém. Nhiệt độ lớn hơn 40
0
C cây lúa sinh trưởng nhanh nhưng tình
trạng sinh trưởng xấu, nếu kéo theo gió lào, ẩm độ thấp thì cây chết. Mức độ
ảnh hưởng nhiệt độ cao hay thấp, mạnh hay yếu là tùy thuộc vào giống lúa và
giai đoạn sinh trưởng, phát triển của lúa. Nhiệt độ thích hợp cho lúa nảy mầm
là 28 - 32
0
C, trổ bông, phơi màu yêu cầu nhiệt độ 20 - 38
0
C. Nhiệt độ ảnh
hưởng đến ra hoa kết quả sớm hay muộn của lúa. Một số giống lúa mẫn cảm
7
với nhiệt độ, khi tích lũy đủ một số nhiệt nhất định (tổng tích ôn) trong đời
sống của mình thì sẽ ra hoa kết quả. Tổng tích ôn của giống ngắn ngày là

8
[44]. Việt Nam có tổng dân số trên 80 triệu người và 100% dân số sử dụng
gạo làm lương thực chính.
Hạt lúa là bộ phận chính được dùng làm lương thực, tất cả các bộ phận
khác của cây lúa đều được con người sử dụng phục vụ cho nhu cầu cần thiết,
thậm chí bộ phận rễ lúa còn nằm trong đất sau khi thu hoạch cũng được cày
bừa vùi lấp để tăng chất mùn cho đất [7]. Do đó cây lúa có vai trò quan trọng
trong đời sống của con người. Những nghiên cứu của cây lúa không chỉ có ý
nghĩa về khoa học mà còn có ý nghĩa thực tế rất lớn [45],[48].
II. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT LÚA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
2.1. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới
Theo thống kê của FAO, năm 2005 cây lúa được trồng ở 114 nước và
có mặt trên khấp các châu lục. Trong đó, Châu Phi có 41 nước, Châu Á có 30
nước, Bắc Trung Mỹ có 14 nước, Nam Mỹ có 13 nước, Châu Âu có 11 nước
và Châu Đại Dương có 5 nước. Diện tích lúa biến động và đạt khoảng
152000 triệu ha, năng suất lúa bình quân xấp xỉ 4,0 tấn/ha. Ấn Độ là nước có
diện tích trồng lúa lớn nhất 44790 triệu ha, ngược lại Jamaica là nước có diện
tích trồng lúa thấp nhất 24 ha. Năng suất lúa cao nhất đạt 9,45 tấn/ha tại
Australia và thấp nhất là 0,9 tấn/ha tại Iraq [43], [44].
Giai đoạn 2001- 2005, sản lượng lúa trên thế giới đều tăng, năm 2005
đạt 618441 triệu tấn. Trong đó, sản lượng lúa Châu Á đạt 559349 triệu tấn
chiếm 90,45%; tương tự ở Nam Mỹ là 24020 triệu tấn (3,88%); ở Châu Phi là
18851 triệu tấn chiếm (3,04%); ở Bắc Trung Mỹ là 12537 triệu tấn (2,03%);
ở Châu Âu và Châu Đại Dương là 3684 triệu tấn (0,6%). Như vậy trong giai
đoạn này, Châu Á có sản lượng lúa lớn nhất thế giới.
2.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam
Nghề trồng lúa ở Việt Nam có lịch sử lâu đời nhất so với nghề trồng
lúa ở các nước Châu Á. Theo các tài liệu khảo cổ ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt
Nam…cây lúa đã có mặt từ 3000-2000 năm trước công nguyên. Tổ tiên
9

cổ bông) làm tắt nghẽn mạch dẫn nhựa nuôi hạt, bông lúa bị gãy, hạt bị lép
và lững (hình1.1)
Tác nhân gây bệnh là một loại nấm ký sinh có tên khoa học là:
Pyricularia grisea hay P. Oryzae Cav. (1988) [14] thuộc lớp nấm bất toàn
Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Monilaceae. Loại nấm bệnh này xâm
nhập và ký sinh ở lá, cổ bông và thân lúa để hút chất dinh dưỡng của cây chủ.
Khi xâm nhập vào lúa, sợi nấm hình thành một đĩa bám, bám chặt vào bề mặt
cây chủ, đồng thời hình thành một sợi xuyên đục thủng lớp biểu bì của tế bào
để hút chất dinh dưỡng. Sợi nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong tế bào
qua khí khổng. Trên lá, vết bệnh nhỏ màu nâu, sau phát triển thành vết bệnh
điển hình có dạng hình mắt én hoặc hình thoi, thuôn nhọn hai đầu, ở trung
tâm có màu xám, xung quanh có viềng nâu, ngoài viền nâu thường có một
quầng vàng. Nhiều vết bệnh liên kết lại làm cả lá lúa bị cháy khô. Sau đó, sợi
nấm mọc ra cuống bào tử, cuống đâm qua các lỗ khí hay các lỗ thoát nước
của cây lúa và lộ ra ngoài. Trên cuống có nhiều bào tử hình quả lê có một đến
hai vách ngang. Sợi nấm, cuống bào tử và bào tử nấm rất bé, qua kính hiển vi
mới nhìn thấy được. Khi trời râm mát, ẩm ướt ta thường thấy trên vết bệnh có
phủ một lớp mốc màu xám xanh, đó chính là cuống và bào tử của nấm.
Việc lây nhiễm và phá hoại lúa của bệnh đạo ôn theo trình tự như sau:
sợi nấm nằm trong thóc giống hay rơm rạ bị bệnh cũ, đến vụ sau lúc gieo cấy
gặp thời tiết thích hợp, sợi nấm sinh bào tử, bào tử bay rơi bám vào cây lúa,
mọc mầm sinh sợi nấm, kết bám vào cây, tiếp tục sinh bào tử, phát triển và
lan truyền ra gây hại cho đến lúc thu hoạch thì nấm lại nằm trong thóc và
rơm rạ (1988) [14].
Tốc độ xâm nhập vào tế bào cây chủ tuỳ thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm,
nhiệt độ thuận lợi nhất cho sự xâm nhập này là ở 24 - 28
0
C, độ ẩm khoảng 85
- 100% và ít ánh sáng mặt trời. Do vậy, những lúc trời mát, có sương mù hay
mưa phùn ruộng thiếu nước và bón nhiều phân đạm, sạ cấy quá dày thì khả

trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc có thể phát triển thành callus. Callus là
loại tế bào chưa phân hóa, phân chia liên tục và có khả năng phát triển thành
phôi, chồi và cây hoàn chỉnh.
Tính toàn năng là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật, trong đó kỹ
thuật nuôi cấy mô và tế bào đang ngày càng phát triển và hoàn thiện.Nuôi
cấy mô và tế bào đã nhanh chóng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh
vực công tác cải tạo giống cây trồng, đưa ngành trồng trọt vào thế kỷ công
nghệ hiện đại [15].
4.2. Quy trình sản xuất cây nuôi cấy mô
Quy trình vi nhân giống thông thường gồm 5 giai đoạn chính, mỗi giai
đoạn có những yêu cầu riêng:
* Giai đoan 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu.
* Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng.
* Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
* Giai đoạn 4: Tạo rễ
* Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng.
4.3. Ứng dụng nuôi cấy mô trong công tác giống cây trồng
Ngày nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực
đang phát triển mạnh mẽ theo những hướng ứng dụng chính sau đây:
Nhân nhanh các giống cây trồng có giá trị kinh tế cao hoặc khó nhân
giống bằng các phương pháp nhân giống thông thường khác.
13
Duy trì và nhân nhanh những kiểu gen quý đặc biệt là những kiểu gen
có nguy cơ bị tyuệt chủng nhằm mục đích làm nguyên liệu khởi đầu cho việc
nhângiống cây trồng.
Duy trì và nhân nhanh những dòng bố mẹ đồng hợp tử để phục vụ cho
công tác sản xuất hạt lai.
Bảo quản nguồn gen thực vật
- Làm sạch virut
- Sản xuất và chuyển hoá sinh học các hợp chất tự nhiên.

Người ta sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng nhỏ
DNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn. Phương pháp
này có ưu điểm là DNA đưa vào tế bào một cách chính xác, thậm chí vào tận
nhân và có thể quan sát được. Phương pháp này cần có thiết bị có độ chính
xác cao, thao tác khéo léo, kỹ thuật và kỹ năng của người thực hiện phải
chính xác.
5.1.3. Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (pollen tube)
Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ nẩy
mầm và hình thành ống phấn. Lúc này tiêm gen mong muốn đi theo ống phấn
mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang
gen chuyển vào. Phương pháp này khá thành công, Đặc biệt trên cây lúa và
cây bông.
5.1.4. Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile
bombardment biolistics)
Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou
và cs, (1991) và kỹ thuật này đươc cải tiến bởi Cao va cs, (1992); Li và cs,
(1993) [5]. Ngay lập tức, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí
nghiệm chuyển gen lúa japonica. Gần đây kỹ thuật chuyển gen bằng súng
bắn gen cũng đã được áp dụng thành công với các giống lúa indica và nhiều
giống japonica (Christou và cs, 1998; Datta và cs, 1999 [6]. Cheng và cs
15
(1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào
lúa Japonica sử dụng súng bắn gen [6].
Đây là kỹ thuât tương đối hiện đại và có hiệu quả. Khi sử dụng thiết bị
(súng bắn gen) tạo được áp lực sẽ đẩy viên đạn được làm bằng kim loại trơ
(vàng, tungsten, wolfram) đã bọc plasmid mang gen đã thiết kế, có kích
thước vào khoảng 1μm, với vận tôc 130 m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu
bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ
gen của tế bào chủ.
Hiệu quả chuyển gen vào lúa bằng phương pháp dùng súng bắn gen

6.1. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Vào những năm đầu thế kỷ XIX, người ta đã nhận thấy ở một số cây
hai lá mầm xuất hiện những nốt sần hay khối u và đã phân lập được một loài
vi khuẩn và đặt tên cho chúng là Agrobacterium tumefaciens (sau đó người ta
tìm thấy một loại vi khuẩn Agrobacterium gây bệnh rễ tơ ở thực vật, đó là vi
khuẩn A. rhizogenes, chúng làm mất khả năng điều khiển sự phát triển của rễ
dẫn đến sự tăng sinh khối và phân nhánh cao tạo ra rất nhiều rễ tơ (còn gọi là
bệnh rễ tóc) gọi là vi khuẩn A. rhizogenes [3].
Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, là vi khuẩn yếm khí
gram âm. Chi này có ba loài sau: A. Radiobacter, A. rhizogenes, A.
tumefaciens [1] [7] [25].
Qua nhiều công trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã xác định, ở
những tế bào của cây bị tổn thương, A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm
và kích thích tạo khối u tại vị trí đó. Các khối u là nơi cư trú và cung cấp các
chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của A. tumefaciens trong
tế bào thực vật.
Khi phân tích khối u, người ta thấy trong nó có các chất lạ chưa hề có
trong đó như các acid amin lạ: octopin, nopalin. khối u không ngừng phát
triển kể cả khi diệt hết vi khuẩn. Như vậy, chứng tỏ vi khuẩn đã chuyển vào
17
trong cây một tác nhân gây khối u và sản sinh ra vật chất lạ, tác nhân có bản
chất là vật chất di truyền. Khi nghiên cứu vi khuẩn này, người ta thấy trong
vi khuẩn có chứa một plasmid có kích thước lớn mà nếu xử lí vết thương
cho cây bằng vi khuẩn không chứa plasmid thì không gây khối u, còn nếu
chữa vết thương bằng vi khuẩn có chứa plasmid thì gây ra khối u. Như vậy
có thể nói plasmid chính là tác nhân gây khối u và sản sinh ra vật chất lạ do
vi khuẩn chuyển vào, plasmid này được gọi tên là Ti-plasmid (tumor
inducing plasmid)
Sự hình thành khối u xảy ra ở nhiệt độ từ 28
0

dẫn đến sự phân chia các tế bào một cách liên tục do nồng độ auxin và
cytokinin tăng lên, gây ra khối u.
- Hệ gen thứ hai quy định quá trình sinh tổng hợp các opine. Đây la
các acid amin lạ có nguồn gốc từ arginine và không bao giờ xuất hiện trong
tế bào bình thường. Cac opine này được phân giải nhờ các enzym do gen
nằm trên Ti-plasmid quy định và được sử dụng làm nguồn dinh dưỡng nitơ
và cacbon cho vi khuẩn. Dựa vào các opine ta có các chủng A.tumefaciens
khác nhau [25]:
- Chủng tạo octopine.
- Chủng tạo nopaline.
- Chủng tạo succinamopine hoặc L-succinamopine.
T-DNA được giới hạn bởi hai bờ phải (Right border) và bờ trái (left
border). Hai bờ có cấu trúc lặp lại gồm 24 cặp bazơ nitơ. Chỉ những đoạn
DNA nằm giữa hai bờ mới được chuyển vào tế bào thực vật, còn hai bờ phải
và bờ trái là những yếu tố cần thiết cho sự chuyển DNA. Tuy nhiên, quá trình
chuyển T-DNA lại do vùng gây độc quy định [25].
6.2.2 Vùng gen vir
Vùng vir dài 35kb mang các gen gây độc. Vùng này bao gồm gen vir
A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir G (một số chủng còn có vir F). Trong đó gen
vir A, vir B, vir D, vir G cần thiết cho tạo độc tính [25]. Hoạt động của gen
vir giúp T-DNA này ra khỏi vi khuẩn, xâm nhập vào tế bào thực vật.
Sự biểu hiện của các gen vùng vir là một quá trình sinh hoá phức tạp ma
các tác nhân đầu tiên tác động đến nó là hợp chất phenolic. Với những đặc tính
này A.tumafaciens được sử dụng như một vectơ để chuyển gen vào cây [24].
6.3 Các vectơ chuyển gen và quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật
Cấu trúc của vectơ chuyển gen vào thực vật là đặt các gen mong muốn
vào môi trường di truyền và vi khuẩn thích hợp để chuyển gen mong muốn
19
nào vào cây và hợp nhất với bộ gen của cây chủ. Một vectơ chuyển gen cần
chứa các thành phần sau:

ung thư) và thay thế vào đó là một đoạn DNA mới. Vectơ này không có khả
năng gây tạo khối u do không còn vùng gen quy định sinh tổng hợp auxin và
cytokinin nhưng vẫn còn chức năng chuyển gen do còn giữ lại hai bờ cần
thiết cho quá trình chuyển.
Để đưa DNA ngoại lại vào giữa hai bờ của T-DNA cần sử dụng một
vectơ trung gian. Vectơ này có khả năng hoat động trong E.coli và có một
vùng tương đồng với vùng nằm giữa hai bờ của T-DNA. Nó được chuyển từ
E.coli sang Agrobacterium thông qua sự tiếp hợp. Trong Agrobacterium các
plasmid không có điểm khởi đầu sao chép phù hợp sẽ bị đào thải. Nếu giữa
vectơ trung gian và vectơ liên hợp xảy ra sự tái tổ hợp, chúng sẽ được giữ lại
trong Agrobacterium và bằng cách sử dụng các dấu chuẩn di truyền thích hợp
như kháng sinh để xác định tái tổ hợp [3].
6.3.2 Vectơ nhị phân (binary vector)
Điểm khác biệt của hai vectơ chuyển gen là hai vùng T-DNA và vùng
gen vir tồn tại trên hai vùng ptasmid khác nhau, sao chép một cách độc lập
với nhau. Ưu điểm của vectơ này là không cần đến tái tổ hợp in vivo nên quá
trình biến nạp có hiệu quả hơn và nhanh hơn.
* Hệ thống này gồm hai plasmid [25]:
- Một plasmid có khả năng sao chép ở cả E.coli và Agrobacterum vì
mang điểm khởi đầu sao chép có dãy vật chủ phổ rộng. Phần mang gen gây
khối u đã bị loai bỏ và không chứa các gen vir. Sau khi sản xuất trong E.coli,
các vectơ này được chuyển vào Agrobacterium thông qua quá trình tiếp hợp.
- Một plasmid khác nằm trong Agrobacterum là Ti-plasmid bị loại bỏ
hoàn toàn vùng T-DNA và hai bờ ranh giới, chỉ giữ lại vùng vir cần thiết
đóng vai trò như một plasmid trợ giúp cung cấp các sản phẩm gen vir cho
quá trình chuyển gen từ tế bào vi khuẩn sang tế bào thực vật. Một vài vectơ
21
nhị phân không bền vững trong Agrobacterium và để duy trì vi khuẩn phải
được nuôi trong điều kiện chọn lọc.
Hệ thống vectơ được phát triển đầu tiên là pGV3850, môt loai vectơ

hợp phenolic làm tăng cường biểu hiện của các gen vir [3].
Tiếp theo đó, T-DNA sợi đơn kể cả hai bờ ranh giới được hình thành
nhờ sự cắt giới hạn của endonuclease vir D2 tại vị trí thứ ba và thứ tư tính từ
trái sang ở bờ phải, đoạn T-DNA luôn được tách ra khỏi Ti-plasmid và
chuyển từ vi khuẩn vào tế bào thực vật. Đoạn DNA còn lại trên Ti-plasmid sẽ
làm khuôn để tổng hợp nên mạch DNA bổ trợ mới theo chiều 5
’-
3
’
.
Protein vir D2 còn có thêm chức năng nhận biết nhân của tế bào thực
vật. Hệ gen vir B mã hoá cho 11 protein có tác dụng kết hợp với màng tế bào
thực vật và định vị tại đó để hình thành cầu nối vận chuyển phức hợp protein-
T-DNA. Như vậy, cấu trúc màng tế bào thực vật bị thay đổi trong suốt quá
trình phức hợp protein-T-DNA đi qua [3].
Sau khi đã qua màng tế bào, T-DNA sẽ được chuyển đến nhân và kết
hợp với DNA trong nhân của tế bào vật chủ ở những vị trí ngẫu nhiên và
được biểu hiện nhờ sự điều khiển của hệ gen vật chủ [25]. Ngoài ra, người ta
còn xác định được rằng các gen nằm trên T-DNA di truyền qua các thế hệ
tuân theo qui luật Menden và cho rằng quá trình chuyển T-DNA là sự cải
biên của cơ chế tiếp hợp vi khuẩn [3].
6.4. Một số yêu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen và tái sinh cây
chuyển gen
Quá trình chuyển gen nhờ Agrobacterium có tần số biến nạp khá cao,
các cây chuyển gen thu được tương đối dễ. Tuy nhiên hiệu quả nay phụ thuộc
vào nhiều yếu tố. Các cây hai lá mầm phù hợp với quá trình này hơn các cây
một lá mầm [24]. Hiệu quả biến nạp ở các mô khác nhau biểu hiện sự tiếp
nhận gen ngoại lai cũng khác nhau (các mô phân sinh dễ biến nạp hơn). Ở
cây cà chua (giống seeda) các mô lá mầm cho hiệu quả biến nạp cao hơn gấp
6 lần mô lá.

6.5. Chuyển gen vào lúa nhờ vi khuẩn Agrobacterium.
Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn
Agrobacterium không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm. Ban
đầu, những cố gắng trong việc tái sinh callus lúa chuyển gen thông qua
Agrobacterium không thành công (Raineri và cs, 1990) [6], ngay sau đó
vấn để này được khắc phục với những callus lây nhiễm với Agrobacterium
được sinh ra từ mô rễ (Chan và cs, 1992) và phôi chưa trưởng thành (Chan
và cs, 1993) [6].
Gần đây, bước ngoặt trong nghiên cứu chuyển gen lúa thông qua
Agrobacterium được đánh dấu bởi công trình nghiên cứu của Smith và Hood
(1995); Komari và cs, (1996); Hiei và cs (1997) [6]. Trong công trình nghiên
cứu của Hiei và cs, tác giả đã thiết kế thành công vectơ đặc hiệu có tên gọi:
Vectơ Super-binary. Đặc điểm của vectơ này là đã được bổ sung gen vir.
Chính sự thay đổi này làm tăng hiệu quả chuyển gen vào lúa japonica. Các
callus từ vỏ phôi và dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 là
thích hợp nhất cho chuyển gen lúa thông qua Agrobacterium. Ngoài ra việc
sử dụng acetosyringone và điều kiện nhiệt độ từ 22 - 28
o
C sau quá trình lây
nhiễm (Cocultivation) cũng được xem là nhân tố quan trọng trong việc nâng
cao hiệu suất chuyển gen. Các phân tích di truyền và phân tử trên số lượng
lớn các cây chuyển gen ở thế hệ thứ 3 đã được chứng minh [6].
Bước ngoặc thứ hai trong nghiên cứu chuyển gen lúa thông qua
Agrobacterium được đánh dấu bởi công trình của Komari và cs, (1996). Ở
công trình này, một plasmid đặc hiệu mang hai đoạn T-DNA riêng biệt một
gen đánh dấu không chọn lọc (Gus), một mang gen đánh dấu chọn lọc (hpt)
đã được tạo ra. Các plasmid này đã được sử dụng cho việc tạo ra các thế hệ
thực vật chuyển gen mang các gen đánh dấu tự do. Hiệu suất chuyển của
đoạn T-DNA là 47% chứng tỏ sự ưu việt của loại vectơ đặc hiệu này. Sự gắn
và sự phân bố riêng biệt của các đoạn T-DNA trong hệ gen thực vật đã được