PHẦN MỞ ĐẦU
Biện pháp sinh học sử dụng các sinh vật, vi sinh vật đối kháng hay sản
phẩm của chúng trong kiểm soát sinh học, nhằm ngăn chặn, diệt trừ các sinh
vật, vi sinh vật gây bệnh có nhiều ưu điểm to lớn. Nó không những phòng,
trị sâu bệnh hại có hiệu quả mà còn khắc phục được những nhược điểm của
biện pháp sử dụng các chất hoá học bảo vệ thực vật. Biện pháp sinh học
không hoặc rất ít gây ô nhiễm môi trường, góp phần vào việc giữ cân bằng
sinh thái, không độc hại với người sử dụng, các nông phẩm tạo ra có chất
lượng cao, sạch an toàn với sức khoẻ con người và vật nuôi. Vì vậy biện
pháp sinh học được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nước phát triển và hiện
đang từng bước được mở rộng, khuyến khích sử dụng ở hầu hết các nước
trên thế giới và có nhiều triển vọng phát triển mạnh trong tương lai.
Ở Việt Nam, trong những năm trở lại đây cũng đang có nhiều nghiên
cứu hướng vào khả năng đối kháng và tạo chế phẩm phân bón hay thuốc bảo
vệ thực vật có nguồn gốc từ những loài Trichoderma đặc biệt là ở thành phố
Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, những nghiên cứu về Trichoderma từ RNM là
hoàn toàn mới mẻ và mới chỉ được sơ bộ đánh giá từ năm 2008 tại Bộ môn
CNSH-VS, trường ĐHSP Hà Nội.
Chúng ta đang phải đối mặt và giải quyết hậu quả gây ra từ việc sử
dụng tràn lan, không có khoa học thuốc hoá học bảo vệ thực vật. Hậu quả đó
không những làm ô nhiễm nghiêm trọng môi trường đất, nước, không khí
ảnh hưởng trực tiếp đến các sinh vật sống trong các môi trường đó. Dư
lượng thuốc tồn lưu trong các nông phẩm còn ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ
con người làm phát sinh nhiều bệnh nan y như ung thư, viêm phổi, thai dị
dạng…Hơn nữa, do việc quá lạm dụng thuốc còn gây hiện tượng quen thuốc
của vi sinh vật gây bệnh.
Đứng trước thực tiễn đó, việc tạo ra các chế phẩm sinh học có hiệu quả
cao phòng, trị được sâu, bệnh và tiến tới thay thế dần biện pháp sử dụng chất
hoá học bảo vệ thực vật là yêu cầu và đòi hỏi cấp thiết không những để làm
giảm thiệt hại do sâu bệnh gây ra, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng
sản phẩm nông nghiệp mà còn vì mục đích giải quyết vấn đề môi trường và


2
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
- Các chủng nấm nghiên cứu: Gồm các chủng Trichoderma (34 chủng)
được phân lập từ Rừng ngập mặn Giao Thủy - Nam Định đang được lưu giữ
tại phòng CNSH – Vi sinh, khoa Sinh học, trường ĐHSP Hà Nội.
- Các chủng nấm kiểm định: Phytophthora sp., Fusarium sp. (L2) do
Bộ môn CNSH-VS cung cấp; nấm Colletotrichum gloeosporioides do Viện
di truyền Nông nghiệp phân lập và cung cấp; nấm Rhizoctonia solani do
Viện bảo vệ thực vật phân lập và cung cấp; nấm Phytophthora capsici được
chúng tôi phân lập tại Bộ môn CNSH-VS từ mẫu bệnh do Viện nghiên cứu
Rau quả cung cấp.
2.1.2. Đối tượng cây sử dụng trong nghiên cứu
- Ớt chỉ thiên (Capsicum annuum L.): hạt ớt chỉ thiên chúng tôi sử
dụng hai loại, một của Tổng công ty Rau quả nông sản Việt Nam, một loại
do chúng tôi thu và xử lí hạt.
2.1.2. Hóa chất
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
2.1.4. Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu
2.1.4.1. Môi trường giữ giống Trichoderma
2.1.4.2. Môi trường nuôi cấy Trichoderma trong nghiên cứu
2.1.4.3. Môi trường xác định hoạt tính enzyme
2.1.4.4. Môi trường tự nhiên kích thích sinh bào tử Phytophthora capsici
2.1.4.5. Môi trường phân lập nấm
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme
2.2.1.1. Phương pháp cấy chấm điểm
2.2.1.2. Phương pháp nhỏ dịch

13 GTb4.8 - + + + ++
14 GTb5.3 - + + + +
15 GTB2.4 - + + + +
16 GTB2.5 - - + ++ ++
17 GTB2.6 - - - - -
18 GTB4.5 - + ++ +++ +++
19 GTB5.7 - - ++ ++ ++
20 GTd4.2 - + + + +
4
STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày
21 GTd4.3 - + + + ++
22 R221A1 + ++ +++ * *
23 L2T - - + + +
24 TT4 + ++ +++ * *
25 TT5 + ++ +++ * *
26 TT44 - + + + +
27 TT60 - - + + +
28 6 - - ++ ++ +++
29 11 - - + + +
30 17 - - + +++ +++
31 19 - - + ++ ++
32 25(1) - + ++ ++ ++
33 25(2) + + ++ +++ +++
34 NHA7.17 - - - - -
Trong đó:
-: không có khả năng đối kháng ; +: có đối kháng, hiệu quả ức chế 40-60%;
++: đối kháng mạnh, hiệu quả ức chế 60-80%; +++: đối kháng rất mạnh,
hiệu quả ức chế 80-90%; *: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90%.
3.1.2 Khả năng đối kháng của Trichoderma với Colletotrichum
gloeosporioides

26 TT44 - ++ +++ * *
27 TT60 - - - + +
28 6 - - + + +
29 11 - - + ++ ++
30 17 - + ++ ++ ++
31 19 - - - - -
32 25(1) - + ++ ++ ++
33 25(2) - + ++ +++ +++
34 NHA7.17 - - - - -
Trong đó:
-: không có khả năng đối kháng; +: có đối kháng, hiệu quả ức chế 40-60%; +
+: đối kháng mạnh, hiệu quả ức chế 60-80%; +++: đối kháng rất mạnh, hiệu
quả ức chế 80-90%;*: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90%
6
3.1.3. Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Rhizoctonia
solani
Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Rhizoctonia
solani được thể hiện ở bảng 3.3:
Bảng 3.3. Kết quả đối kháng giữa các chủng Trichoderma với
Rhizoctonia solani
STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày
1 NHA7.3 - - + ++ ++
2 NHA7.4 - + +++ +++ +++
3 NHA7.5 - + ++ +++ +++
4 NHA8.6 - - - - -
5 NHA8.8 - - - - -
6 GTa2.2 - - + ++ ++
7 GTa3.2 - - + + +
8 GTA3.5 - + + + +
9 GTA5.1 - - + ++ ++

quả ức chế 80-90%; *: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90%
3.1.4. Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Fusarium sp.
Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Fusarium sp.
được thể hiện ở bảng 3.4:
Bảng 3.4. Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với
Fusarium sp (L2)
STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày
1 NHA7.3 - - - - -
2 NHA7.4 - - + + +
3 NHA7.5 - ++ +++ * *
4 NHA8.6 - - - - -
5 NHA8.8 - - - - -
6 GTa2.2 - + ++ * *
7 GTa3.2 - - + + +
8 GTA3.5 - - + ++ +++
9 GTA5.1 - - - - -
10 GTA5.5 - - - - -
11 GTb2.1 - - + + +
12 GTb4.7 - - - - -
8
STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày
13 GTb4.8 - - - - -
14 GTb5.3 - - + + +
15 GTB2.4 - + + ++ ++
16 GTB2.5 - - - - -
17 GTB2.6 - - - - -
18 GTB4.5 - ++ +++ +++ +++
19 GTB5.7 - + + ++ ++
20 GTd4.2 - - - - -
21 GTd4.3 - - + + +

3 NHA7.5 + +++ * * *
4 NHA8.6 - + ++ ++ ++
5 NHA8.8 - - ++ ++ ++
6 GTa2.2 - - + + +
7 GTa3.2 - + + + +
8 GTA3.5 - + ++ ++ ++
9 GTA5.1 - + ++ ++ ++
10 GTA5.5 - + +++ * *
11 GTb2.1 - ++ ++ ++ ++
12 GTb4.7 - + ++ +++ +++
13 GTb4.8 - - + ++ ++
14 GTb5.3 - + ++ ++ ++
15 GTB2.4 - ++ +++ * *
16 GTB2.5 - + + + +
17 GTB2.6 - + + + +
18 GTB4.5 - - + ++ ++
19 GTB5.7 - + + + +
20 GTd4.2 + +++ * * *
21 GTd4.3 - - + ++ ++
22 R221A1 + +++ * * *
23 L2T - + ++ +++ +++
24 TT4 - ++ * * *
25 TT5 - + ++ +++ +++
26 TT44 - ++ +++ +++ +++
27 TT60 - + ++ +++ +++
28 6 - + + + +
10
STT
Các chủng
Trichoderma

9 GTA5.1 10
10 GTA5.5 11
11 GTb2.1 11
12 GTb4.7 10
11
STT Các chủng Trichoderma
Hoạt tính enzyme chitinase
(D-d) mm
13 GTb4.8 17
14 GTb5.3 8
15 GTB2.4 21
16 GTB2.5 6
17 GTB2.6 9
18 GTB4.5 25
19 GTB5.7 8
20 GTd4.2 27
21 GTd4.3 23
22 R221A1 21
23 L2T 6
24 TT4 19
25 TT5 7
26 TT44 23
27 TT60 13
28 6 10
29 11 19
30 17 +
31 19 15
32 25(1) 20
33 25(2) 16
34 NHA7.17 10

17 GTB2.6 -
18 GTB4.5 15
19 GTB5.7 16
20 GTd4.2 31
21 GTd4.3 2,0
22 R221A1 37
23 L2T +
24 TT4 32
25 TT5 17
26 TT44 26
27 TT60 -
28 6 20
13
STT Các chủng Trichoderma
Hoạt tính enzyme cellulase
(D-d) mm
29 11 +
30 17 36
31 19 -
32 25(1) +
33 25(2) 20
34 NHA7.17 +
Trong đó:
D: Đường kính vòng phân giải (mm); d: Đường kính lỗ thạch (10mm); +: Có
hoạt tính enzyme nhưng rất yếu; -: Không có hoạt tính enzyme.
3.3. Kết quả bước đầu nghiên cứu hiệu quả ứng dụng trên cây trồng của
một số chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao được chọn lọc
3.3.1. Ảnh hưởng của hai chủng NHA7.5 và TT4 tới tốc độ sinh trưởng,
phát triển của
Bảng 3.8. Chiều cao trung bình và số lượng lá/cây từng tuần theo dõi

Chiều cao
TB (mm)
Số cây
2 lá 3 lá 4 lá 5 lá 6 lá 7 lá
2
NBCT(TT4) 26,66 ± 0,39 28 7
NBCT(NHA7.
5)
26,31 ± 0,41 23 12
ĐC1 25,74 ± 0,53 21 14
ĐC2 26,57 ± 0,31 25 10
Tuần
3
TT4(1) 31,89 ± 0,48 4 28 3
TT4(2) 31,79 ± 0,37 3 30 2
NHA7.5(1) 33,83 ± 0,41 4 23 8
NHA7.5(2) 31,80 ± 0,45 2 28 5
NBCT(TT4) 29,80 ± 0,45 10 23 2
NBCT(NHA7.
5)
29,29 ± 0,47 9 24 2
ĐC1 28,77 ± 0,39 8 25 2
ĐC2 29,96 ± 0,33 9 24 2
Tuần
TT4(1) 35,93 ± 0,50 21 14
TT4(2) 34,84 ± 0,42 22 12 1
NHA7.5(1) 36,86 ± 0,49 11 23 1
NHA7.5(2) 34,80 ± 0,41 23 11 1
NBCT(TT4) 32,69 ± 0,47 22 13
NBCT(NHA7.

5)
40,17 ± 0,50 2 22 9 2
ĐC1 39,56 ± 0,48 3 24 7 1
ĐC2 40,08 ± 0,29 3 22 9 1
Sự chênh lệch chiều cao trung bình giữa các lô thí nghiệm khác nhau
được thể hiện rất rõ qua biểu đồ hình cột dưới đây:
Hình 3.10. Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình của cây ở các công thức
thí nghiệm khác nhau qua từng tuần (TN ứng dụng hai chủng TT4 và
NHA7.5)
16
Cây ở các công thức thí nghiệm có xử lí Trichoderma cao hơn rõ rệt so
với cây ở các công thức không được xử lí với Trichoderma. Hơn nữa thông
qua việc quan sát hàng ngày màu sắc lá của cây ở các công thức thí nghiệm
khác nhau cho thấy: ở các lô thí nghiệm xử lí hạt trước khi gieo trồng với
nấm Trichoderma lá cây có màu xanh hơn và mỡ hơn, cây khoẻ hơn so với
các lô không được xử lí với nấm Trichoderma.
3.3.2. Ảnh hưởng của hai chủng R221A1 và GTd4.2 tới tốc độ sinh
trưởng, phát triển của cây.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của R221A1 và GTd4.2 tới tốc độ sinh
trưởng, phát triển của cây (chiều cao cây, tốc độ ra lá, màu sắc lá) được thể
hiện ở bảng 3.9:
Bảng 3.9. Chiều cao trung bình và số lượng lá/cây từng tuần theo dõi
(TN ứng dụng hai chủng GTd4.2 và R221A1)
Thời
gian
Các công
thức TN
Chiều cao TB
(mm)
Số cây

ĐC2 29,16 ± 0,50 19 11
Tuần
3
GTd 4.2(1) 35,15 ± 0,35 2 15 13
17
Thời
gian
Các công
thức TN
Chiều cao TB
(mm)
Số cây
2
lá
3
lá
4
lá
5
lá
6
lá
7 lá
GTd 4.2(2) 35,17 ± 0,44 19 11
R221A1(1) 35,03 ± 0,46 3 12 15
R221A1(2) 35,57 ± 0,39 15 14 1
NBCT(GTd4.2) 33,47 ± 0,37 7 13 10
NBCT(R221A1) 33,14 ± 0,48 10 12 8
ĐC1 33,55 ± 0,44 9 11 10
ĐC2 33,03 ± 0,39 10 11 9

2
lá
3
lá
4
lá
5
lá
6
lá
7 lá
Tuần
6
ĐC1 45,18 ± 0,44 5 23 2
ĐC2 45,25 ± 0,48 3 25 2
Qua bảng kết quả thấy rằng, chiều cao trung bình hàng tuần và tốc độ
tăng trưởng chiều cao của những lô thí nghiệm có Trichoderma hơn hẳn so
với những lô không có xử lí Trichoderma. Quan sát màu sắc lá cây ở các
công thức thí nghiệm có GTd4.2 và R221A1 cũng nhận thấy, nhiều cây lá có
màu xanh hơn, bề mặt lá to hơn.
3.4. Hiệu quả phòng, trừ và ứng dụng của 4 chủng Trichoderma (NHA7.5,
TT4, R221A1, GTd4.2) với nấm bệnh Phytophthora capsici trên ớt
3.4.1. Hiệu quả ứng dụng phòng, trừ của hai chủng NHA7.5, TT4 với
nấm Phytophthora capsici
Kết quả tính tỉ lệ bệnh (%) và hiệu lực phòng trừ (%) được thể hiện ở
bảng 3.10:
Bảng 3.10. Tỉ lệ bệnh và hiệu lực phòng trừ của các công thức thí
nghiệm có xử lí Trichoderma (chủng NHA7.5 và TT4)
Các công thức thí nghiệm
Tỉ lệ bệnh

3.4.2. Hiệu quả phòng, trị Phytophthora capsici trên ớt của hai
chủng GTd4.2 và R221A1
Kết quả tính tỉ lệ bệnh và hiệu lực phòng, trừ của GTd4.2 và R221A1
được thể hiện ở bảng 3.11 dưới đây:
Bảng 3.11. Tỉ lệ bệnh và hiệu lực phòng trừ của các công thức thí
nghiệm có xử lí GTd4.2 và R221A1.
Các công thức thí nghiệm
Tỉ lệ bệnh
(%)
Hiệu lực
phòng trừ (%)
20
GTd4.2(2) ( xử lí hạt, bổ sung vào đất với
GTd4.2 trước khi chủng bệnh)
36,67 35,29
NBCT (GTd4.2) (xử lí với GTd4.2 sau khi
chủng bệnh)
50 11,76
R221A1 (2) (xử lí hạt, bổ sung vào đất với
R221A1 trước khi chủng bệnh)
26,67 52,94
NBCT(R221A1) (xử lí với R221A1 sau khi
chủng bệnh)
43,33 23,53
Hình 3.13. Tỉ lệ (%) cây bị bênh ở 8 công thức thí nghiệm khác nhau
(GTd4.2(1), GTd4.2(2), R221A1(1), R221A1(2), NBCT(GTd4.2),
NBCT(R221A1), ĐC1, ĐC2)
Trong đó: - GTd4.2(1): Xử lí Trichoderma (chủng GTd4.2) không xử
lí nấm bệnh; GTd4.2(2): Xử lí Trichoderma (chủng GTd4.2) trước khi
chủng bệnh; R221A1(1): Xử lí Trichoderma (chủng R221A1) không xử lí

Phytophthora
capsici
Khuẩn lạc nấm
Phytophthora
capsici
Những hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi cho thấy các sợi nấm
Trichoderma sinh trưởng bám sát và hướng tới nấm bệnh kết hợp với những
kết quả quan sát được khi thử nghiệm đối kháng theo phương pháp Dual và
kết quả hoạt tính enzyme chitinase và cellulase, có thể cho rằng những chủng
Trichoderma này có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng mạnh với nguồn bệnh.
Chúng tiết ra các enzyme làm tiêu hủy thành tế bào nấm bệnh, phá hủy cấu
trúc hệ sợi làm chúng tàn lụi và chết dần. Sợi nấm Trichoderma thường rất
nhỏ so với sợi nấm bệnh. Do đó tại vị trí tiếp xúc khi các enzyme phá hủy
thành tế bào được tiết ra có thể hình thành những lỗ thủng tại một số chỗ tiếp
xúc và các sợi nấm nhỏ Trichoderma này có thể qua các lỗ thủng đó chui vào
khoang trong của sợi nấm bệnh và sử dụng chất dinh dưỡng của nấm bệnh,
sinh trưởng trong đó, nhanh chóng tiêu hủy và làm chết nấm bệnh.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Hầu hết các chủng Trichoderma đều biểu hiện khả năng đối kháng
với nấm bệnh (với nấm Phytophthora sp. có 30/34 chủng, với nấm
Colletotrichum gloeosporioides có 27/34 chủng, với nấm Rhizoctonia solani
có 30/34 chủng, với nấm Fusarium sp. có 19/34 chủng, với nấm
Phytophthora capsici cả 34 chủng đều biểu hiện khả năng đối kháng). Nhiều
chủng có khả năng đối kháng rất mạnh và hoàn toàn, trong đó 3 chủng
(R221A1, TT4, TT5) đối kháng hoàn toàn với Phytophthora sp., 3 chủng
(NHA7.4, GTd4.2, TT44) đối kháng hoàn toàn với nấm Colletotrichum
gloeosporioides, 4 chủng (R221A1, TT4, TT5, TT44) có khả năng đối
kháng hoàn toàn với Rhizoctonia solani, 3 chủng (NHA7.5, GTa2.2, L2T)
có khả năng đối kháng hoàn toàn với Fusarium sp., có 8 chủng có khả năng

chủng này.
Tiếp tục có những nghiên cứu sâu hơn nữa về cơ chế đối kháng của
các chủng nấm Trichoderma có hiệu quả cao với nấm bệnh đặc biệt là hai
chủng NHA7.5 và R221A1. Vì đây là hai chủng có khả năng đối kháng
mạnh và hoàn với hầu như cả 5 loại nấm kiểm định đã thử nghiệm. Trên cơ
sở hiểu rõ được cơ chế đối kháng của nó để có phương pháp ứng dụng
chúng sao cho có hiệu quả nhất trong thực tiễn.
24