MỤC LỤC
PHẦN I MỞ ĐẦU 3
1.1 Đặt vấn đề 3
1.2 Mục đích nghiên cứu 4
1.3 Nội dung nghiên cứu 4
PHẦN II TỔNG QUAN KHOA HỌC 5
2.1 – Tình hình nghiên cứu bệnh đốm đỏ 5
2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5
2.1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 7
2.1.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 8
2.2. Cấu tạo một số cơ quan trong cơ thể cá 10
2.2.1. Mang 10
2.2.2. Gan 11
2.2.3. Thận 13
2.2.4. Lách 15
2.2.5. Mạch và tế bào máu 16
PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
3.1. Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 18
3.1.1. Thời gian 18
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu 18
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu 18
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18
3.2.1. Vật liệu 18
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu 19
3.2.2.1 Thu mẫu 20
3.2.2.2 Cố định và bảo quản mẫu 20
3.2.2.3 Xử lý mẫu 20
3.2.2.4 Đúc Parafin 21
3.2.2.5 Cắt mẫu 22
3.2.2.6 Nhuộm màu 22
3.2.2.7 Đọc kết quả 23

dẫn đến những khó khăn khi nghiên cứu bệnh. Ngoài việc thiếu phương tiện kỹ
thuật thì phương pháp chẩn đoán bệnh chưa hoàn thiện cũng là nguyên nhân
quan trọng dẫn đến tình trạng trên.
Phương pháp mô bệnh học (Histopathological method) có vai trò quan
trọng trong việc tìm hiểu những biến đổi mô học đặc trưng dưới ảnh hưởng của
các tác nhân gây bệnh, từ đó xác định được nguyên nhân gây bệnh (vi khuẩn,
virus, nấm, kí sinh trùng…). Vì vậy tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu mô bệnh
học của cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) bị nhiễm khuẩn” nhằm mô tả
các biến đổi tổ chức mô ở một số cơ quan trên cá bị nhiễm khuẩn, từ đó phân
biệt với những biến đổi do tác nhân khác, góp phần chẩn đoán chính xác triệu
chứng, bệnh tích, nguyên nhân và hoàn thiện quy trình phòng trị bệnh trên cá
trắm cỏ.
1.2 Mục đích nghiên cứu
- Tìm hiểu cấu tạo tổ chức mô một số cơ quan (mang, cơ, gan, thận, lách) của
cá bình thường
- Tìm hiểu sự biến đổi tổ chức mô của các cơ quan trên ở cá trắm cỏ bị nhiễm
khuẩn
- Kết quả thu được góp phần làm tài liệu tham khảo cho những nghiên cứu
sau này
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Làm tiêu bản mô cá trắm cỏ bình thường (có kết quả âm tính khi xét
nghiệm vi khuẩn gây bệnh) và cá trắm cỏ bị nhiễm khuẩn (kết quả dương tính
khi xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh)
- Quan sát và mô tả những biến đổi tìm thấy
- Tập hợp kết quả nghiên cứu thành bộ sưu tập mẫu mô của cá trắm cỏ làm
tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu khác


mùa (Rodger và Burke, 1981), và liên quan chặt chẽ tới sự nở hoa của thực vật
phù du [2]. Nhiệt độ nước cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sức đề kháng
và khả năng nhiễm bệnh của cá; đồng thời liên quan trực tiếp đến sự tăng trưởng
và phát triển của A. hydrophila – vi khuẩn được coi là tác nhân chính gây bệnh
đốm đỏ lở loét ở cá. Ngoài ra, pH, hàm lượng chất thải hóa học, thuốc trừ sâu,
nồng độ ion Cl
-
, độ cứng… đều có liên quan đến sự xuất hiện bệnh [2].
Khi nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, Reung Prach và cộng tác viên đã kết
luận rằng không có mối quan hệ trực tiếp nào giữa ký sinh trùng và cá bệnh [2].
Tại các vết loét, Mc Kenzie và Hall (1976) đã phân lập được dạng nấm sợi
không màu, phân đốt. Hai loại nấm Saprolegnia và Achlya sp cũng liên quan đến
hội chứng lở loét ở cá nhưng không phải là tác nhân gây bệnh ban đầu [2].
Người ta còn tìm thấy nấm Alphanomyces piscisida trên cá bị đốm đỏ ở Úc. Đây
cũng chính là tác nhân chính gây ra hội chứng lở loét trên nhiều loài cá ở Thái
Lan, vì thế mà đôi khi bệnh đốm đỏ trên cá trắm cỏ bị nhầm với hội chứng lở
loét EUS, nhưng cá trắm cỏ lại ít nhạy cảm với tác nhân này (Supranee, 1999).
Sau nhiều năm nghiên cứu, các nhà khoa học Trung Quốc đã phát hiện ra
rằng trên cá nước ngọt có hai loại bệnh: bệnh xuất huyết do virus và bệnh đốm
đỏ do vi khuẩn. Tác nhân gây bệnh xuất huyết là Reovirus dạng hạt nhỏ, nhân là
ADN (Zonglin và ctv, 1991) còn ở Thái Lan và Myanma lại phân lập được
Rhapdovirus, thế nhưng các đợt dịch bệnh gần đây không tìm thấy tác nhân này
[2]. Sự có mặt của virus có thể là hoàn toàn ngẫu nhiên và nó không tham gia
vào dịch bệnh [2].
Nguyên nhân gây bệnh đốm đỏ được cho là do vi khuẩn đã được đưa ra từ
đầu thế kỷ XX (Plehn, 1904). Người có nhiều đóng góp và phát triển quan điểm
này là Schaperclaus (1954, 1958, 1964, 1966, 1979); ông đã cho rằng nguyên
nhân gây bệnh đốm đỏ là Pseudomonas spp, A. punctata và có thể có vai trò của
virus trong dịch bệnh này. Trong các trường hợp nhiễm khuẩn, phần lớn cá chết
do một loại vi khuẩn đơn độc gây ra, liên quan đến các vết loét hoại tử và đó là

kết quả thu mẫu trên sông Hồng, sông Đuống ngoài A. hydrophila còn gặp
Pseudomonas spp và nấm thủy mi Saprolegnia sp ký sinh trên các vết loét của cá
bệnh. Kết quả thu mẫu tại Cổ Loa, Toàn Thắng, Gia Lâm cũng tương tự như vậy.
Tiếp tục nghiên cứu sâu về vấn đề này, các nhà nghiên cứu ở Viện NCNTTS I đã
kết luận rằng bệnh xuất huyết là do Reovirus còn bệnh đốm đỏ lở loét là do vi
khuẩn, chủ yếu là A. hydrophila, chỉ có một mẫu phân lập được nấm Saprolegnia
diclina và không tìm thấy mẫu mô cơ cá có nấm Alphanomyces piscisida – tác
nhân chính gây hội chứng lở loét EUS (Phan Thị Vân và ctv, 2006). Như vậy A.
hydrophila là tác nhân gây bệnh đốm đỏ lở loét ở cá trắm cỏ, mặt khác bệnh đốm
đỏ ở cá trắm cỏ không phải là hội chứng lở loét EUS.
2.1.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Ngành Bacteria
Lớp Schizomycetes
Họ Vibrionaceae
Giống Aeromonas
Loài Aeromonas hydrophila
A. hydrophila là vi khuẩn Gram (-), dạng que ngắn, hai đầu hơi tròn, kích
thước 0.5 x 1.0 – 1.5 µm. Vi khuẩn vận động nhờ có một tiêm mao, sống yếm
khí tùy tiện [16].

Hình 1,2. Vi khuẩn A.hydrophila [22]
A. hydrophila sống tự do và có mặt thường xuyên trong nước, đặc biệt có
nhiều trong các thủy vực có mật độ tảo cao (Geldreich, 1974). Giống như một
tác nhân cơ hội, vi khuẩn này gây bệnh cho nhiều loài cá nước ngọt và nước lợ.
A. hydrophila được phân lập trên cá hồi nước ngọt và ếch và là nguyên nhân gây
ra bệnh “chân đỏ” (Reed và Toner, 1942). Khi mức độ stress của môi trường quá
cao (nhiệt độ cao, mật độ quá dày, nước nghèo oxy hòa tan và lượng chất thải
hữu cơ nhiều) làm cho sức đề kháng của cá yếu đi, vi khuẩn sẽ xâm nhập và gây
ra hiện tượng nhiễm trùng máu, chướng bụng, xuất huyết. Vi khuẩn này có thể
kết hợp với các tác nhân khác, thậm chí là với loài Aeromonas khác. Chúng tiết

mạch ly tâm và ngược với hướng dòng nước chảy qua tia mang. Tế bào trụ có khả
năng co lại, thu hẹp đường kính để điều chỉnh lượng máu chảy qua. Thành tơ mang
mỏng với nhiều khe nhỏ giúp cho máu dễ tiếp xúc với môi trường [9].

Hình 3. Tia mang (Formalin, H&E, Bar = 16.7 µm) [9].
1. tia mang; 2. tơ mang; 3. tế bào biểu mô; 4. tế bào tiết nhầy; 5. tế bào trụ; 6. kẽ
(khoang mao mạch); 7. tế bào hồng cầu trong khoang mao mạch; 8. tế bào gốc
chưa biệt hóa; 9. khoang tĩnh mạch trung tâm.
Các loại tế bào tìm thấy trên tia mang và tơ mang bao gồm tế bào sắc tố, tế
bào bạch huyết, tế bào màng trong, tế bào chloride, đại thực bào, tế bào hình gậy,
tế bào tiết nhầy. Tế bào tiết nhầy nằm trên tơ mang, tạo nên lớp phủ ngoài làm
giảm ma sát, ngăn cản sự nhiễm khuẩn, làm tăng tính thẩm thấu thụ động và gia
tăng lưu lượng nước qua mang. Sự thải nhiều urine loãng do việc đào thải nước
qua mức làm gia tăng khả năng mất ion. Tế bào chloride cung cấp vật liệu để
duy trì trạng thái cân bằng ion nội bào tự nhiên. Chức năng của mang là trao đổi
khí, cân bằng acid – base, điều chỉnh ion, thải hợp chất nitro thông qua lớp biểu
mô mang [9].
2.2.2. Gan
Gan là nội quan lớn nhất, bắt nguồn từ các tế bào ruột trong giai đoạn
phôi; nằm ở bụng trước, kéo dài từ phía sau và tạo thành các thùy nhờ những
vòng ruột và bao quanh các nội quan tạo nên hệ thống gan tụy. Màu sắc thay đổi
từ nâu tối đến màu kem, thậm chí là màu vàng tùy vào lượng lipit trong gan và
trạng thái cơ thể. Chức năng của gan bao gồm tiêu hóa dinh dưỡng, sản xuất mật,
giải độc, tạo máu và phá hủy tế bào máu già yếu [9].
Các thùy con hay nhu mô bao gồm các nút tế bào gan bao quanh bởi 3
mạch nối động mạch, tĩnh mạch và ống mật. Khi thu nhỏ bớt mạch máu, chúng
tạo thành các sinusoids – tế bào gan dạng đa diện có nhân ở trung tâm –và các
ống mật tạo thành trung tâm thùy con. Các loại tế bào khác tìm thấy trong nhu
mô gan là mô tạo máu, trung tâm đại thực bào, tế bào biểu mô, tế bào mỡ, tế bào
Kupffer và nguyên bào sợi. Tế bào máu có mặt trong mạch máu và một số bạch

Thận là cơ quan bài tiết nước ở động vật có xương sống, bao gồm các
nguyên thận và ống cung cấp máu. Nước trong cơ thể cá nước ngọt tập trung
nhiều ion hơn nước môi trường xung quanh, điều này dẫn đến sự gia tăng tính
thẩm thấu. Ion bị cô đặc và giữ lại trước khi bài tiết nước đã thanh lọc. Việc này
được thực hiện bằng cách lọc nước qua cầu thận, mỗi cầu thận gồm quản cầu
Malpighi và ống thận. Lớp biểu mô bên trong và ngoài thành cầu thận tạo thành
khoang Bowman’s – cách ly với cầu thận. Thận cũng giữ chức năng thông tin về
các tế bào máu ở động vật gồm cả cá xương.

Hình 5: Cầu thận (Formalin, H&E, Bar = 10.7 µm) [9].
1. khoang Bowman’s; 2. tế bào nội mô; 3. tế bào đảo máu; 4. biểu bì bên trong của
vỏ cầu thận; 5. biểu bì vách của vỏ ống thận; 6. hồng cầu trong mạch máu. Hình 6. Ống thận, cắt ngang (Formalin, H&E, Bar = 16.7 µm) [9].
1. vùng ống đầu tiên; 2. vùng ống thứ 2; 3. vùng ống giữa; 4. ồng ngoại biên; 5. ống tập
trung; 6. viền chổi; 7. tế bào biểu bì gián phân; 8. đại thực bào sắc tố; 9. tế bào hồng cầu.

Trong khi cầu thận nhỏ và không có mạch thì các ống thận lại có cấu trúc
hoàn chỉnh gồm 6 vùng tế bào có thể nhìn thấy được. Ở lớp biểu mô ống thận
thường thấy tế bào hình gậy và tế bào kẽ (hình 6).
2.2.4. Lách

Hình 7. Lách – tủy trắng (white pulp) và tủy đỏ (red pulp) [9].

Lách là cơ quan có màu đỏ nhạt hoặc màu đen, nằm gần chỗ uốn cong của
dạ dày trong màng treo ruột. Lách giống như hạch bạch huyết của động vật có
xương sống, thường có cấu trúc đơn nhưng ở cá trắm cỏ thì chia làm 2 thùy. Cấu
tạo của lách gồm 3 thành phần chính là tủy trắng, tủy đỏ và mạng lưới các
khoang hình bầu dục (ellipsoids). Tủy trắng chứa mầm gốc để tạo ra bạch cầu và

và CO
2
gắn với sắc tố hemoglobin. Còn
bạch cầu (chiếm khoảng 2 – 4% tổng số tế bào máu) là những tế bào bảo vệ, bao
gồm 4 loại chính: bạch cầu hạt (Granulocytes), tế bào bạch huyết
(Lymphocytes), bạch cầu đơn nhân to (Monocytes) và tiểu cầu (Thrombocytes).
Bạch cầu hạt gồm bạch cầu trung tính – là tế bào phòng vệ nhanh chóng di
chuyển tới những vết thương cấp tính, bạch cầu ái toan – tiêu hóa vi khuẩn và
vật chất của tế bào chết đồng thời cũng tiêu hóa sắc tố chứa lipid như melanin,
lipofuscin, ceroid và một dạng ít gặp hơn là bạch cầu ưa bazơ. Bạch cầu hạt liên
quan đến cơ chế miễn dịch không đặc hiệu, chúng phản ứng với sự có mặt của vật
chất lạ trong cơ thể nhưng không phải là kháng nguyên đặc hiệu. Chúng di chuyển
đến những vùng bị xâm nhập và tiêu diệt chất lạ bằng cách thực bào hoặc trực tiếp
giết chết tế bào nhiễm độc tố đã biết. Bạch cầu hạt chiếm khoảng 4 – 60% tổng số
bạch cầu ở cá, và không có sự khác biệt đáng kể về số lượng giữa các loài.
Bạch cầu đơn nhân to là tiền thân của đại thực bào. Đại thực bào là tế bào
có khả năng ăn vi khuẩn, các tác nhân bên ngoài và những tế bào khác; bao gồm
hai loại: tiểu thực bào (bạch cầu trung tính) linh động và đại thực bào không linh
động (tế bào màng trong, bạch cầu đơn nhân to và tế bào lưới nội mô). Đại thực
bào thường xuất hiện ở những nơi có vết thương mãn tính và trong mô các cơ
quan như gan, thận, lách. Chúng thường kết hợp với sắc tố để tạo thành MMC.
Tế bào bạch huyết là những tế bào có chức năng quan trọng trong những
phản ứng miễn dịch. Trong điều kiện bệnh lý, tế bào bạch huyết giảm số lượng khi
bị tổn thương cấp tính và gia tăng trong trường hợp tổn thương mãn tính [21].

Hình 8. Mô máu; Bạch cầu trung tính (phải), 2. bạch cầu ái toan (trái) [22]
PHẦN III
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Thời gian

7.0g
HCl 8.5ml
Acid formic 5.0ml
Nước cất 87ml
* Dung dịch nhuộm màu Haematoxylin
Haematoxylin crystals C
16
H
14
O
6
.6H
2
O 4.0g
Sodium iodinate NaIO
3
0.8g
Postassium aluminum sulfate KAl(SO
4
)
2
100g
Ctric acid C
6
H
8
O
7
4.0g
Chloralhydrate C

tắt bằng sơ đồ sau:

Cắt mẫu
Đúc mẫu
Nhuộm màu
Đọc mẫu
Thu mẫu
Cố định
Xử lý
3.2.2.1 Thu mẫu
- Các cá thể được chọn để thu mẫu mô phải còn sống
- Thu mẫu bệnh: chọn mẫu có triệu chứng bệnh tích điển hình và có kết
quả dương tính khi xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh.
- Thu mẫu đối chứng: chọn mẫu mô của cá thể khỏe mạnh bình thường và
kết quả xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh âm tính.
-Tất cả các mẫu phải còn sống trước khi đưa vào cố định.
- Đưa hóa chất và dụng cụ đến tại bờ ao để cố định, nếu không địa điểm thu
mẫu xa phải nhanh chóng đưa cá còn sống đến nơi thuận tiện để cố định mẫu.
3.2.2.2 Cố định và bảo quản mẫu
- Dùng dao mổ sạch cắt các mô cần nghiên cứu (mang, cơ, thận, gan, lách)
thành những miếng nhỏ, thể tích miếng mô nhỏ hơn 1cm
3
.
- Cho miếng mô vào dung dịch cố định Buffered formalin 10% trong 24h.
Thể tích dung dịch cố định gấp 10 lần thể tích miếng mô.
- Với mẫu cá nhỏ, đặt nguyên cả con vào dung dịch cố định nhưng phải
mổ bụng để hở nội tạng đảm bảo dung dịch cố định ngấm đều.
- Nếu lấy mẫu vết thương hở, chỉ lấy miếng mô ở gần chỗ bị thương tổn.
- Các thao tác phải nhanh, tránh để mẫu quá lâu trong không khí. Ghi đầy
đủ lý lịch và dán nhãn cho từng mẫu.

Cồn 95% lần I
30- 60′
4
Cồn 95% lần II
30- 60′
5
Cồn 95% lần III
30- 60′
6
Cồn 100% lần I
30- 60′
7
Cồn 100% lần II
30- 60′
8
Cồn 100% lần III
30- 60′
9
Xylen 100% lần I
60- 90′
10
Xylen 100% lần II
60- 90′
11
Parafin lần I
90′
12
Parafin lần II
120′


Xylen 100% lần II
2- 3´
3
Cồn 100% lần I
2- 3´
4
Cồn 100% lần II
2- 3´
5
Cồn 95%
2- 3´
6
Cồn 70%
2- 3´
7
Rửa qua vòi nước chảy nhẹ
4- 6'
8
Hematoxylin
4- 8´
9
Rửa qua nước chảy nhẹ
4- 6´
10
EOSIN
5- 10´
11
Cồn 75%
2- 3´
12 PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả kiểm tra mẫu
Các mẫu được thu đều là những mẫu có triệu chứng bệnh tích điển hình
của bệnh đốm đỏ. Cá thường bỏ ăn, tách đàn và bơi lờ đờ trên mặt nước. Biểu
hiện bên ngoài là da sẫm màu, vảy mất ánh bạc do mất nhớt, tuột vảy; đôi khi da
có màu hồng đỏ, toàn thân phù nề. Vây đuôi mòn cụt, một số mẫu có biểu hiện
loét vây đuôi; vây lưng và vây bụng có thể có biểu hiện xuất huyết. Ở những mẫu cá
lớn (trên 1 năm tuổi), thường thấy những vết loét lan rộng trên bề mặt da với viền đen
và mép màu trắng bao quanh. Phần lớn cá chết rải rác nhưng nếu kết hợp với stress
môi trường thì có thể chết nhiều và chết nhanh trong vài ngày (Hình 9, 10).
Mang cá thường bị mòn, tia mang xơ cụt phần đầu. Đa số có biểu hiện
thối mang, loét mang hoặc bám nhiều cặn bẩn làm cản trở quá trình hô hấp
(Hình 11, 12).
Với những mẫu có hiện tượng phù nề, khi giải phẫu nội quan cho thấy gan
sưng to, nhạt màu, đôi khi xuất huyết. Lách cũng sưng to, màu đen và xuất
huyết. Đặc biệt ruột không có thức ăn và chứa rất nhiều dịch. Thận nát vỡ, gia
tăng kích thước so với bình thường. Còn những mẫu loét da, cơ thể không phù nề
thì điểm nổi bật là ruột không có thức ăn và nhiều dịch tiết, thận cùng các nội
quan khác nát nhũn (Hình 13).