ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
ĐẠI HỌC Y KHOA PHAM NGỌC THẠCH
Bộ môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân Tử
THỰC TẬP

(Tài liệu lưu hành nội bộ)

Năm học: 2014 - 2015
Bộ Môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân tử Thực tập Sinh Học Phân tử
1
CHẨN ĐOÁN HEMOCHROMATOSIS BẰNG
RFLP


- Gen HFE nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 giải mã ra protein
HFE tham gia vào quá trình điều hòa việc hấp thu sắt của cơ thể. Protein
HFE - 348 acid amin gồm 3 phần chính: 3 thành phần 1, 2, 3, phần xuyên
màng tế bào và phần bên trong màng tế bào (Hình 1).
- Chức năng protein HFE: tác động tương hổ với một số trên bề mặt tế bào
để xác đònh lượng sắt trong cơ thể; điều hòa hepacidin (peptide hormone) được
HOOC
HOOC
NH
2
NH
2

Ngoại
bào
Tế bào chất
His 63 → Asp
Cys 282 → Tyr
Màng tế
bào
Hình 1: Cấu trúc và cơ chế xuyên màng của Protein
HFE
Bộ Môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân tử Thực tập Sinh Học Phân tử
2
tiết từ gan để điều hòa lượng sắt hấp thu từ thực phẩm và phóng thích sắt dự
trữ; tác động tương hổ với transferrin receptor để điều hòa sắt nhưng cơ chế
chưa biết rõ ràng.

Đột biến C282Y:
Đây là đột biến hay gặp nhất (Zhang và cộng sự, 2003). Cystein ở vò trí 282 bò

II. PHƯƠNG PHÁP RFLP CHUẨN ĐOÁN Hemochromatosis
NGUYÊN PHÁT:
- Trong vùng gần C282, DNA bình thường có một điểm bò cắt bởi enzym
Rsa1 (Rhodopseudomonas sphaeroides), đột biến C282Y tạo 1 điểm cắt thứ
hai.
- Dùng 2 đoạn mồi khuyếch đại đoạn DNA chứa C282 gồm 390 đôi base.
Sau đó đem ủ với enzym Rsa1.
- Có 3 trường hợp xảy ra khi điện di trên gel agarose (hình 2):
 Người bình thường: có 2 đoạn 250 và 140 đôi base.
 Dò hợp tử: có 4 đoạn là 140ø, 250, 111 và 29 đôi base.
 Đồng hợp tử: có 3 đoạn là 250, 111 và 29 đôi base. RSa1

C282
140 250

RSa1 RSa1

C282Y
29 111 250
1. Khuyết đại vùng C282 bằng PCR
 Tube eppendorf chạy PCR do bộ môn cung cấp cho mỗi nhóm chứa 5 µl
DNA để trong đá.
 Thêm vào tube 20 µl mix đã pha sẵn
 Thành phần của mix trong 20 µl:
 2,5 µl Tampon Taq 10x (Tris – HCl, pH 8,5)
 2 µl MgCl
2
(25 mM)
 2,5 µl Primers G176 A/B (50 ng/µl)
 0,5 µl dNTP’s (10 mM)
 0,1 µl Taq polymerase (5 U/µl)
 12,4 µl H
2
O cất vô trùng
 Vortex tube eppendorf trong 5 giây để bảo đảm sự trộn đều các thành
phần trong dung dòch.
 Quay ly tâm tube eppendorf trong 10 giây ở máy ly tâm nhỏ
(microfuge). Lưu ý sự cân bằng các tube khi quay ly tâm.
 Đặt tube eppendorf vào máy PCR và sử dụng chương trình sau đây:

94
o
C 3 phút

94
o
C 30 giây (Denaturation) (tách rời hai chuỗi )
55
o

cách hút pipette lên xuống nhiều lần) và ly tâm trong 10 giây
 Lấy 20 µl dung dòch trên cho vào giếng trên thạch agarose
 Lấy 20 µl dung dòch thang đo 100bp (ladder) cho vào giếng tiếp
theo
 Chạy điện di ở dòng điện một chiều, 100 Volt trong 30 phút.
 Xem kết quả thạch agarose dưới ánh sáng đèn UV, chụp hình thạch
agarose và ghi chú trên hình những băng DNA được quan sát.
 Biện luận kết quả.