Lời cảm ơn
Trớc hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học
phân tử - Viện di truyền nông nghiệp cùng các cán bộ công nhân viên
trong phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập vừa
qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực
phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội và cô Nguyễn Xuân Sâm tạo điều
kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật.
1
Lời mở đầu
Viện Di truyền nông nghiệp đợc thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân của
Viện là Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984). Hiện nay, Viện
nằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội.
Chức năng chính của Viện là :
-Nghiên cứu, ứng dúng các phơng pháp di truyền học hiện đại và công
nghệ sinh học để chọn tạo các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt,
chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môt trờng.
-Tạo các chủng vi sinh vật mới phục vụ bảo quản và chế biến lơng thực-
thực phẩm, sản xuất các loại chế phẩm sinh học phục vụ nền nông nghiệp bền
vững và bảo vệ môi trờng.
-Tăng cờng hợp tác quốc tế và tham gia đào tạo cán bộ về lĩnh vự Di
truyền và Công nghệ sinh học.
Để thực hiện đợc các chức năng trên, Viện đã tổ chức thành 10 đơn vị
nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với tổng số cán bộ là 116 ngời trong đó có
3 tiến sĩ , 6 phó giáo s, 16 phó tiến sĩ và 8 thạc sĩ.
Trong những năm qua, Viện đã đạt đợc rất nhiều thành tựu, đã thực hiện
và chủ trì 18 đề tài nhà nớc, 42 đề tài cấp ngành, 8 dự án sản xuất thử, tạo đợc
nhiều giống lúa mới và các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo ra các
quy trình tiến bộ kỹ thuật đợc công nhận. Ngoài ra, Viện còn thực hiện các dự án
hợp tác quốc tế với các tổ chức UNDP, FAO Nhờ các thành tự trên mà Viện đã
nhận đợc nhiều giải thởng có giá trị cả trong và ngoài nớc: Giải thởng quốc tế về

quá trình trao đổi chất của tế bào cây thông qua các enzyme, các chất độc tố, các
chất điều hoà sinh trởng và các loại chất khác mà chúng tiết ra khi tiếp xúc với
cây chủ, hoặc hấp thụ dinh dỡng của tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử dụng
của chúng. Một số sinh vật khác lại gây bệnh bằng cách sống ký sinh và phát
triển, sinh sản trong hệ thống bó mạch mô gỗ hay bó mạch libe và hậu quả tất
yếu là làm tắc nghẽn đờng vận chuyển lên xuống của nớc và của đờng. Ngoài ra,
các yếu tố môi trờng cũng gây bệnh trên thực vật khi tác động với mức ngoài ng-
ỡng chống chịu của cây.
Có rất nhiều loại bệnh hại cây trồng, chúng đợc phân nhóm theo rất nhiều
tiêu chuẩn: theo triệu chứng bệnh, theo bộ phận cây bị bệnh, theo loại cây bị
bệnh Hiện nay, phổ biến nhất là ngời ta phân loại bệnh cây dựa vào loại tác
nhân gây bệnh. Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật đợc chia làm 2 loại: bệnh gây
ra do các yếu tố sinh học và bệnh gây ra bởi các yếu tố không sinh học. Theo
tiêu chuẩn này, ta có thể chỉ ra đợc nguyên nhân gây bệnh, quá trình tiến triển và
cách lan truyền bệnh từ đó suy ra đợc biện pháp phòng trừ bệnh
3
4
Phần i: Nuôi cấy mô tế bào thực vật
I. Khái niệm chung:
Nuôi cấy mô tế bào là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại
nuôi cấy những nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi tr-
ờng dinh dỡng nhân tạo và trong điều kiện vô trùng. Bao gồm:
- Nuôi cấy các cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
- Nuôi cấy các cơ quan, bộ phận tách rời của thực vật nh mẩu lá, mẩu rễ,
một đoạn thân, một bộ phận của hoa, quả
- Nuôi cấy phôi non (phôi cha phân hoá hoàn toàn), phôi trởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus)
- Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bào
trần
Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên tính toàn năng của tế bào

4. Vitamin: Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng
tổng hợp vitamin nhng lợng tổng hợp đợc không đủ nên phải bổ sung
vitamin ngoại sinh vào môi trờng cấy. Vitamin thờng dùng là nhóm B dễ
hoà tan vào trong nớc nh B
1
, B
2
, B
3
, B
5
, B
6
với hàm lợng từ một đến
một vài mg/l. Chúng là thành phần coenzim của hàng loạt enzim xúc
tác cho các phản ứng hoá sinh, vì vậy không thể thiếu trong môi tr-
ờng nuôi cấy.
*Myo-Inositol là một hợp chất thứ cấp có vòng thơm (cha đợc xếp vào
vitamin), do sự tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế bào, có
tác động kích thích mạnh mẽ sự phân chia của tế bào, đợc sử dụng với l-
ợng lớn ~ 100 mg/l.
5. Chất điều khiển sinh trởng: Là thành phần quan trọng nhất của môi
trờng nuôi cấy, giúp điều khiển đợc quá trình phân hoá và phản phân
hoá tế bào, thể hiện đợc tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy tế bào
và mô thực vật tách rời. Ngời ta thờng sử dụng chủ yếu hai nhóm chất
điều khiển sinh trởng thực vật sau:
- Auxin: kích thích quá trình tăng trởng của tế bào, kích thích sự
hình thành mô sẹo và rễ bất định. Các loại thờng dùng là
IAA(axit indolaxetic), NAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit
indol butyric), 2,4DAA(axit Diclofenoxy axetic) Hàm lợng

0
C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ
hơn 40
0
C lại ở dạng rắn(gel). Agar có khả năng ngậm nớc cao, chỉ
cần 6-12 g có thể làm đông đặc 1l nớc và khi ở trạng thái rắn thì tế
bào và mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu đợc các chất dinh dỡng từ
môi trờng.
III. Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào:
Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành
công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt đợc khi nó trải qua 5 bớc sau:
Bớc 0: Bớc chuẩn bị
Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau:
- Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần.
- Có khả năng sinh trởng và phát triển tốt.
- Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus.
- Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các
cây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối u về điều kiện
chăm sóc, dinh dỡng, bảo vệ thực vật để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn.
7
Bớc 1: Nuôi cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy thờng
sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra,
tuỳ thuộc từng đối tợng nuôi cấy ngời ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy
nh mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non.
Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trớc khi tiến hành để đảm bảo mẫu
sạch vi sinh vật nhng tỉ lệ sống cao. Hiện nay sử dụng chủ yếu là phơng pháp sát
trùng bề mặt bằng chất hoá học, thờng là HgCl
2
0,1% sát trùng trong 5-10 phút.

là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy.
8
Tuy nhiên, ở một số loài nh chuối hoặc cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả đạt
đợc trong môi trờng không có chất điều hoà sinh trởng.
Bớc 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên
Giai đoạn đa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bớc cuối cùng của
quy trình nuôi cấy mô tế bào.
Cây lấy ra ống nghiệm phải đợc rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự
xâm nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trình
này sẽ thành công hơn nếu trớc khi đa cây con ra đất ta ơm cây trên cát có độ ẩm
90% từ 10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đợcc sinh ra
và bắt đầu hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình
thờng.
Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế
bào.Đó là:
- Sự bất định di truyền
+ Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy
ra hiện tợng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lí,
sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận đợc ở ngay giai
đoạn invitro hoặc giai đoạn exvitro.
+ Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non ít chuyên hoá để dễ điều
khiển và phát triển hình thái, giảm lợng chất điều khiển sinh trởng
sử dụng, từ đó giảm đợc ảnh hởng của chúng. Đồng thời, phải hạn
chế số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm sự tích
luỹ, gia tăng ảnh hởng của các chát điều khiển sinh trởng.
- Sự nhiễm mẫu cấy
+ Có một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập và tồn tại rất sâu
trong hệ thống mô dẫn của thực vật. Khi tế bào thực vật bắt đầu
phát triển, phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trờng sau 2-3
tuần nuôi cấy.

đó cũng là những cây giống khoẻ mạnh, sạch virus, sinh trởng tốt và cho năng
suất cao; có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ diệt vong; có thể
trao đổi quốc tế nguồn gen và lu giữ, bỏ quản dạng cây in vitro. Chính nhờ kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào, ngời ta có thể tạo ra đợc hệ số nhân giống cao, sớm
phát huy đợc hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc
và dễ dàng khắc phục đợc những điều kiện bất lợi. Phơng pháp này tỏ ra đặc biệt
hiệu quả với những loại cây khó nhân giống bằng con đờng hữu tính, các giống
quý hiếm có số lợng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh.
ở Việt Nam, từ năm 1975, nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nớc đã đợc
thành lập và cho đến nay đã thu đợc một số kết quả đáng kể. Tại viện Sinh vật-
Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia đã hoàn thiện quy trình nhân giống
10
in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu nh lúa, thuốc lá, khoai
lang, dứa sợi Tại trờng Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã hoàn thiện quy trình
nhân giống khoai tây chất lợng cao, bớc đầu đi vào sản xuất.Tại các tỉnh phía
Nam đã xây dựng đợc ngân hàng cà phê với 10 dòng khác nhau, hoàn thiện quy
trình nhân giống cây cao su . Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào
trong cả nớc đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa, cây
ăn quả, cây rừng, cây quý hiếm có giá trị cao.
Tóm lại, nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay đợc đa vào trong các chơng
trình chọn giống và nhân giống hiện đại, nó góp phần tích cực vào lý luận sinh
học cây trồng, vào thực tiễn nông nghiệp, mở ra một hớng đi mới cho nghiên cứu
di truyền học, hoá sinh, sinh lý thực vật , đặc biệt nó đem lại những ứng dụng to
lớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng.
V.Kết quả và thảo luận
Thực hiện nuôi cấy mô đối với loại mẫu là cây hoa cúc lấy từ vờn của viện
Di truyền nông nghiệp.
- Mẫu cây đợc cắt bỏ lá và cắt thành những đoạn dài 5-7 cm.
- Rửa mẫu bằng nớc rửa bát loãng sau đó rửa lại bằng nớc sạch 3 lần.
- Rửa mẫu bằng cồn 70 độ trong 1 phút để sát trùng sơ bộ sau rửa lại bằng nớc

thì năng suất giảm tới 30%. Trong lĩnh vực hoa cây cảnh còn trầm trọng hơn.
Việc áp dụng những thành tựu khoa học kỹ thuật của CNSH, đặc biệt là sinh học
phân tử và Miễn dịch liên kết gắn enzim vào sản xuất là rất cần thiết nhằm tăng
năng suất cây trồng, chẩn đoán nhanh và chính xác tác nhân hại cây trồng, đáp
ứng đợc đòi hỏi cấp bách của KDTV.
Một số tác nhân gây bệnh thờng thấy trên cà chua, khoai tây, thuốc lá.
Virus khảm da chuột Cucumber Mosaic Viruses (CMV)
Loại virus này gây ra các loại khảm và biến dạng lá khác nhau, điển hình
nhất là dạng biến dạng hình kim, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng
trong sản xuất cà chua và thuốc lá. Virus này đợc lan truyền qua Aphis
gossyphii. Nó thuộc nhóm Cucumovirus có cấu trúc ARN mạch đơn. Xuất
hiện dịch bệnh không có quy luật báo trớc.
Virus khảm thuốc lá - Tobacco Mosaic Viruses (TMV)
Loại virus này gây ra các loại khảm và phồng lá khác nhau, điển hình nhất
là dạng khảm san hô gây nên những thiệt hại nghêim trọng trong sản xuất
cà chua, gây ảnh hởng đến chất lợng thuốc lá. Virus này đợc lan truyền
bằng con đờng cơ học, đồng thời đối với cà chua virus này còn lan truyền
qua hạt. Nó thuộc nhóm Tobamovirus có cấu trúc ARN mạch đơn.
Virus Y khoai tây Potato Y Viruses (PVY).
Loại virus này gây ra các loại khảm và các dạng hoại tử ở thịt và gân lá
khác nhau, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng trong sản xuất cà chua và
thuốc lá. Vectơ của virus này là các loại muội khác nhau. Nó thuộc nhóm
polyvirus có cấu trúc ARN mạch đơn.
13
2.Sự lan truyền virus trong tự nhiên

Virus thực vật không thể tự lây nhiễm vào các mô, tế bào của vật chủ mà
chúng chỉ thâm nhập vào khi các tế bào hoặc các mô của vật chủ bị tổn thơng.
Trong tự nhiên quá trình này đợc thực hiện thông qua các vi sinh vật khác,
những sinh vật mang virus từ cây này truyền cho cây khác gọi là vectơ truyền

truyền bệnh sau đó vài giờ và truyền bệnh liên tục trong một vài tuần, gọi là
truyền bệnh vĩnh viễn tuần hoàn (persistent circulative).
- Côn trùng sau 15 phút lây virus có thể truyền bệnh liên tục suốt cả chu
kỳ sống và cả thế hệ sau đó vẫn còn nguyên khả năng truyền bệnh, gọi là
truyền bệnh vĩnh viễn lan truyền (persistent psopagative).
3. Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym
( ELISA enzym linked immuno _sorbent assay)
Phơng pháp thử miễn dịch dựa trên phản ứng giữa một kháng nguyên và
một kháng thể là những protein có trọng lợng phân tử lớn thu đợc do tạo miễn
dịch ở máu nóng của động vật có vú ( chuột, thỏ, ngựa, dê ) bằng những phân tử
gây miễn dịch ( protein, polysaccharides, ARN 2 mạch bổ xung , ).Trong trờng
hợp này kháng thể đợc gọi là kháng thể đa dòng (polyclonaux) vì chúng đợc tạo
ra từ các dạng hoạt hoá của một quần thể dị chất của những tế bào limpho B
trong máu động vật. Chúng là một hỗn hợp của các kháng thể khác nhau phản
ứng với nhiều điểm cuối của kháng nguyên hoạc những đỉnh của phân tử gây
miễn dịch. Phản ứng kháng thể kháng nguyên là một công cụ rất hiệu nghiệm
để chuẩn đoán bệnh virut, vi khuẩn, nấm, mycoplasma, tuyến trùng và các véc tơ
truyền bệnh. Hiện nay kỹ thuật ELISA còn giúp chúng ta xác định đợc hàm lợng
thuốc trừ sâu (pesticide) tồn d trong đất. Các phân tử đánh dấu cũng là một phức
hợp kháng thể kháng nguyên đã đợc sử dụng từ lâu để chuẩn đoán bệnh cho
phép nhận thấy kết quả bằng mắt thờng. Hiện nay việc sử dụng các phân tử
phóng xạ để đánh dấu đã bị hạn chế .Bên cạnh đó, ngời ta thờng dùng enzym
(Alkaline phosphatasa), peroxidaza, chất floresence và Avidin Biotin để tăng
độ nhạy của phép chuẩn đoán ta cũng có thể sử dụng các chất huỳnh quang,
phosphattase alkaline
Phơng pháp miễn dịch liên kết enzym đợc nhiều tác giả hoàn thiện vào năm
1971 (Avrameanvà Cs; Van Weemen và Cs; Engvall và Cs ). Nhóm cuối cùng đã
sử dụng thuật ngữ ELISA (Enzym linked immuno sorbent assay) lần đầu tiên
vào năm 1971 để áp dụng vào phơng pháp định lợng một vài kháng thể đặc hiệu.
Đây là phơng pháp đợc phát triển bởi rất nhiều tác giả và là một phơng pháp

bệnh
- Thu đợc các nguyên liệu thực vật sạch bệnh bằng quy trình chọn giống sạch
bệnh ở những giai đoạn nhân giống khác nhau.
- Kiểm tra nguyên liệu thực vật nhập nội và ngăn ngừa sự xâm nhập của các
bệnh lạ vào lãnh thổ.
- Theo dõi thờng xuyên các loại vi sinh vật, phát hiện và diệt trừ ổ dịch có thể
là các kho chứa các vật truyền bệnh (côn trùng, tuyến trùng, nấm)
II.Vật liệu và nghiên cứu
1.Vật liệu nghiên cứu.
1.1 Vật liệu thực vật.
Các mẫu cà chua thu thập tại vờn thí nghiệm của viện di truyền nông
nghiệp.
1.2 Vật liệu vi sinh
Loại bệnh đợc nghiên cứu là : Potato virus Y, Tobaco etch virus.
1.3 Các dung dịch đệm dung trong DAS-ELISA.
16
- Dung dịch Coating pH=9,6
NaCO
3
1,59g NaN
3
0,20g
NaHCO
3
2,93g Nớc cất 2 lần 1000ml
- Dung dịch PBS pH7,4
NaCl 8,00g KCl 0,20g
KH
2
PO

sắc tố diệp lục của cây. (Để loại trừ diệp lục trong dịch chiết mẫu ở
nồng độ hoà loãng thấp ta tiến hành ly tâm ở 7000 rpm trong 5 phút)
2.2 Phơng pháp DAS-ELISA, các bớc tiến hành
*Nguyên lý của phơng pháp DAS-ELISA
Dùng kháng thể đa dòng bao phủ bề mặt giếng để bắt giữ kháng nguyên thích
hợp
17
Cho kháng nguyên vào
Kháng thể gắn enzyme đợc sử dụng để phát hiện
Cuối cùng là sự nhân biết các mẫu bằng phản ứng tơng tác với chất hiện màu.
18
Hình 1. Nguyên lý của phơng pháp ELISA Sandwich kẹp kháng thể 2 lần
Phơng pháp trực tiếp.
Các bớc tiến hành
1. Đặt kháng thể đặc hiệu đã đợc hoà loãng trong dung dịch đệm coating vào
giếng của đĩa plaque (100àl/giếng).
o ủ trong 2h ở 37
0
C
o Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS T.
2. Cho dịch cây nghiên cứu đã đợc hoà loãng trong dung dịch đệm PNS T
+ PVP vào giếng của đĩa plaque (100àl/giếng).
o ủ ở 37
0
C trong 2h hoặc 1 đêm ở 4
0
C.
o Rửa đĩa plaque 3 lần bằng dung dịch PBS T.
19
Enzyme

o ủ ở 37
0
C trong 30 phút đến 2h. Khi muốn dừng phản ứng thì dùng
50àl dung dịch NaOH 3M để dừng phản ứng.
5. Đọc kết quả bằng máy so màu quang học ở bớc sóng 405nm. Chỉ số
quang học D.O thể hiện kết quả của phản ứng O.D lớn gấp 2 lần O.D đối
chứng sạch bệnh là cây đã bị nhiễm virus (Theo Sanofi-Pasteur).
Iii: Kết quả và thảo luận
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Mẫu đối chứng đối với 10 giếng đầu tiên là TEV: kiểm tra mẫu cà chua.
Mẫu đối chứng đối với 10 giếng tiếp theo là TSV: kiểm tra mẫu cà chua.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B TP 1 4 7 10
- 3 6 9
C TP 1 4 7 10
- 3 6 9
D + 2 5 8
TP 1 4 7 10
E + 2 5 8
TP 1 4 7 10
F - 3 6 9
+ 2 5 8
G - 3 6 9
+ 2 5 8
H
Bảng tổng hợp kết quả đo O.D
20
Tên virus
Mẫu

-20 và -84
0
C cho những giá trị OD khác nhau rõ rệt. Từ số liệu thu đợc cho thấy
-84
0
C cho giá trị cao nhất.
2. ảnh hởng của thời gian bảo quản mẫu tới kết quả thí nghiệm:
- Mẫu tiến hành thí nghiệm ngay sau khi đợc tách chiết cho kết quả chính xác
nhất. Nghĩa là nêu skhông bắt buộc phải bảo quản mẫu trong -84
0
C cho kết quả
chính xác và nhạy nhất. Nếu sử dụng mẫu qua bảo quản kết quả sẽ cho độ nhạy
kém hơn và chỉ nên dùng một lần không nên lặp lại.
3. ảnh hởng của thời gian bảo quản đĩa tới kết quả thí nghiệm sau khi cho kháng
thể hút bám bề mặt các giếng:
- Khi so sánh giá trị OD đối với đối chứng bệnh và đối chứng sạch của thí
nghệim ở tại các thời điểm sau khi cho kháng thể hút bám bề mặt giếng cho thấy
thời gian bảo quản đĩa khác nhau không ảnh hởng tới giá trị OD.
21
4. ảnh hởng của bọt khí khi cho dung dịch chất hiện màu vào trong mỗi giếng
trớc khi đọc kết quả:
Giá trị OD thay đổi rất lớn trong cùng một mẫu khi có bọt khí và không có bọt
khí trong các giếng, thậm chí trong một số trờng hợp đối chứng sạch bệnh cho
kết quả dơng tính (bị bệnh). Vì vậy hết sức tránh có bọt khí khi đặt kháng
nguyên, kháng thể và chất nền để kết quả đợc chính xác hơn.
Phần III : Một số kỹ thuật phân lập nấm bệnh và
nấm đối kháng.
I.Tổng quan
Mỗi loại cây đều có một hệ vi sinh vật đặc trng cho cây đó. Nghiên cứu về
hệ vi sinh vật tham gia vào sự sinh trởng, phát triển cũng nh duy trì nòi giống ở

đối kháng, thuốc trừ sâu sinh học, chuyển gen chống chịu vào cây trồng
đang đợc nghiên cứu và áp dụng ngày càng nhiều nhờ những u điểm của
chúng.
Một trong những biện pháp sinh học có khả năng đem lại hiệu quả cao trong
bảo vệ cây trồng là sử dụng vi sinh vật chống lại các vi sinh vật hại cây hay
nói cách khác là tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cho cây nhờ các vi sinh vật đối
kháng với chúng.
Hiện nay, ngời ta đã tìm ra các cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh dựa
vào các chủng vi sinh vật đối kháng nh:
+ Sự cạnh tranh về dinh dỡng. Các chủng vi sinh vật đối kháng thờng phát
triển nhanh làm biến đổi dinh dỡng và không gian sống của vi sinh vật gây
bệnh.
+ Sinh chất kháng nấm
+ Tăng sức đề kháng ở vật chủ: Một số chủng vi sinh vật có khả năng kích
thích sự tạo thành các chất chống chịu ở vật chủ.
+ Tác động trực tiếp vào tác nhân gây bệnh: một số chủng vi sinh vật có khả
năng sinh ra enzim thuỷ phân ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác,
phân giải thành thành tế bào hay tạo ra các lỗ rò dẫn tới sự rò rỉ tế bào
Nghiên cứu các vi sinh vật đối kháng thì nấm đối kháng là một nội dung mới mẻ
và quan trọng, đang đợc đầu t ở Việt Nam.
II.Phơng pháp nghiên cứu
- Trong nội dung báo cáo này đề cập đến một số kỹ thuật phân lập nấm
bệnh và nấm đối kháng phục vụ cho nghiên cứu ảnh hởng của nấm đến
cây trồng cũng nh sản xuất ra các chế phẩm sinh học nhờ những nghiên
cứu ấy.
23
1.Kỹ thuật mồi nấm gây bệnh
* Nguyên tắc:
- Sử dụng mô của cây chủ sạch bệnh để bắt các vi sinh vật gây bệnh cho
cây cùng loại. Vi sinh vật có trong đất sẽ bị thu hút bởi mô thực vật mà nó

24
- Cắt mảnh lá rộng 1-2mm
2
chứa một nửa mô sạch và một nửa mô bệnh,
sau đó ngâm trong Clorox 10% trong 5 phút
- Cấy mô đã khử trùng bề mặt trên môi trờng WA, và giữ ở nhiệt độ
phòng.
- Quan sát khuẩn lạc của nấm mốc mọc lên trong môi trờng đó và cấy
chuyển nhiều lần sang môi trờng WA hoặc PDA cho đến khi tạo đợc canh
trờng thuần khiết.
- Các bớc trên thực hiện trong box cấy vô trùng
Sơ đồ tiến hành: H2
* Phạm vi ứng dụng:
- Phân lập đợc các chủng nấm gây bệnh trực tiếp từ mô thực vật.
3.Phơng pháp pha loãng
* Nguyên tắc:
- Nuôi cấy dung dịch loãng chứa VSV ở các nồng độ khác nhau trên môi
trờng phù hợp để tạo thành các khuẩn lạc. Nuôi cấy tách riêng các khuẩn
lạc đó để thu đợc các chủng nấm riêng biệt.
* Cách tiến hành
- Cho 1g đất mẫu vào trong ống nghiệm đã khử trùng
- Thêm 10ml nớc cất khử trùng để hoà tan đất sau đó lắc đều trong 20-30
phút.
- Pha loãng mẫu đất đã hoà tan trong nớc cất khử trùng và cấy lên môi tr-
ờng thạch thích hợp, mỗi độ pha loãng lấy 0.1ml.
- Giữ ở nhiệt độ 24-30
o
C trong vài ngày và đếm khuẩn lạc.
- Cấy chuyển nhiều lần trên môi trờng thích hợp để tạo ra khuẩn lạc thuần
khiết