KILOBOOKS.COM

1
Li cm n

Trc ht em xin chõn thnh gi li cm n n Phũng bnh hc
phõn t - Vin di truyn nụng nghip cựng cỏc cỏn b cụng nhõn viờn
trong phũng ó to iu kin giỳp em trong sut thi gian thc tp
va qua.
Em cng xin gi li cm n n Vin Cụng ngh Sinh hc Thc
phm - i hc Bỏch Khoa H Ni v cụ giỏo hng dn to iu
kin cho em hon thnh t thc tp k thut.

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

2
Li m u

Vin Di truyn nụng nghip c thnh lp ngy 10/10/1989, tin thõn
ca Vin l Trung tõm Di truyn Nụng nghip (thnh lp nm 1984). Hin nay,
Vin nm trờn a bn huyn T Liờm, H Ni.
Chc nng chớnh ca Vin l :
-Nghiờn cu, ng dỳng cỏc phng phỏp di truyn hc hin i v cụng
ngh sinh hc chn to cỏc ging cõy trng cú nng sut cao, phm cht tt,
chng chu sõu bnh v cỏc iu kin bt li ca mụt trng.
-To cỏc chng vi sinh vt mi phc v bo qun v ch bin lng thc-
thc phm, sn xut cỏc loi ch phm sinh hc phc v nn nụng nghip bn
vng v bo v mụi trng.
-Tng cng hp tỏc quc t v tham gia o to cỏn b v lnh v Di
truyn v Cụng ngh sinh hc.

gi các sn phm ca q trình quang tng hp và to ht hoc các c quan tái
to khc cho kh nng sinh tn và phát trin. Bt c khi nào các t bào ca mt
cây hay mt b phn nào đó ca cây có kh nng thc hin mt hay nhiu chc
nng đc bit b can thip do các vi sinh vt hoc là yu t mơt trng bt li
thì các hot đng ca các t bào b gián đon, b thay đi hay b c ch hoc b
cht và cây trng tr nên b bnh.
u tiên bnh mi ch xy ra  mt vài t bào và vn cha biu hin ra
nhng ch trong mt thi gian ngn, bnh lan rng và các b phn cây b bnh
bt đu thay đi và biu hin ra ngồi các triu chng bnh mà mt thng có
th thy đc. Da vào nhng thay đi mà cây th hin khi phn ng li s xâm
nhim ca vi sinh vt hay nh hng ca các yu t mơi trng bt li mà
chúng ta có th bit đc mc đ bnh ca cây. T đó bnh ca cây có th đc
đnh ngha là : mt chui các phn ng ca các t bào và các mơ thc vt vi
các vi sinh vt gây bnh hoc vi các yu t mơi trng mà ta có th nhìn thy
đc hoc khơng nhìn thy đc, dn đn nhng thay đi bt li theo hình dng,
chc nng, hoc tình trng ngun vn ca cây trng và có th dn đn s suy
yu hoc có th gây cht tồn phn hoc tng phn ca cây.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

4
Cỏc tỏc nhõn gõy bnh vi sinh vt thng gõy bnh bng cỏch can thip
vo quỏ trỡnh trao i cht ca t bo cõy thụng qua cỏc enzyme, cỏc cht c t,
cỏc cht iu ho sinh trng v cỏc loi cht khỏc m chỳng tit ra khi tip xỳc
vi cõy ch, hoc hp th dinh dng ca t bo ch phc v cho mc ớch s
dng ca chỳng. Mt s sinh vt khỏc li gõy bnh bng cỏch sng ký sinh v
phỏt trin, sinh sn trong h thng bú mch mụ g hay bú mch libe v hu qu
tt yu l lm tc nghn ng vn chuyn lờn xung ca nc v ca ng.
Ngoi ra, cỏc yu t mụi trng cng gõy bnh trờn thc vt khi tỏc ng vi

- Ni cy phơi non (phơi cha phân hố hồn tồn), phơi trng thành.
- Ni cy mơ so (callus)
- Ni cy t bào: T bào thc vt đn (ni cy huyn phù t bào), t bào
trn

Cơng ngh ni cy mơ, t bào thc vt da trên tính tồn nng ca t bào
do Haberlandtf phát biu (1898): Mi t bào ca c th đa bào có kh nng tim
tàng đ phát trin thành mt c th hồn chnh trong điu kin phù hp. C s
vt cht ca tính tồn nng là mi t bào trong c th đa bào đu cha đy đ
vt cht thơng tin di truyn. Khi to đc mơi trng ni cy phù hp, s dng
các cht điu khin sinh trng thc vt, ta có th hot hố gen cn thit đ bt
mt t bào bt k ca c th thc vt phát trin đc thành cây hồn chnh.
Phân hố và phn phân hố ca t bào cng là c s lý thuyt ca cơng
ngh này. Trong đó, s phân hố là vic chuyn nhng t bào phơi sinh tr
thành các t bào chun hố đ thc hin nhng chc nng khác nhau v sinh lý,
sinh hố; còn s phn phân hố là s chuyn các t bào đã chun hố tr li
trng thái phơi sinh, có kh nng phân chia đ cho ra các t bào mi.
iu kin đ t bào th hin tính tồn nng qua con đng phân hố và
phn phân hố là mơi trng ni cy.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

6

II.Mơi trng ni cy mơ t bào thc vt:

Mơi trng ni cy là yu t quan trng, nó quyt đnh cho s thành cơng
ca vic ni cy mơ t bào thc vt tách ri. Thành phn chính bao gm:


trong mơi trng ni cy.


THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

7
*Myo-Inositol là mt hp cht th cp có vòng thm (cha đc xp
vào vitamin), do s tham gia hình thành hp cht pectin to thành t bào,
có tác đng kích thích mnh m s phân chia ca t bào, đc s dng
vi lng ln ~ 100 mg/l.
5. Cht điu khin sinh trng: Là thành phn quan trng nht ca
mơi trng ni cy, giúp điu khin đc q trình phân hố và phn
phân hố t bào, th hin đc tính tồn nng ca t bào trong ni cy
t bào và mơ thc vt tách ri. Ngi ta thng s dng ch yu hai
nhóm cht điu khin sinh trng thc vt sau:

-
Auxin: kích thích q trình tng trng ca t bào, kích thích
s hình thành mơ so và r bt đnh. Các loi thng dùng là
IAA(axit indolaxetic), NAA(axit naphtyl axetic), IBA(axit
indol butyric), 2,4
DAA(axit Diclofenoxy axetic) Hàm lng
dùng nh 10
-5
-10
-7
mol/l.
-
Xytokinin: kích thích s phân chia t bào và to chi bt đnh.

0
C thỡ dng lng cũn khi nhit
nh hn 40
0
C li dng rn(gel). Agar cú kh nng ngm nc cao,
ch cn 6-12 g cú th lm ụng c 1l nc v khi trng thỏi rn thỡ
t bo v mụ thc vt vn d dng hp thu c cỏc cht dinh dng
t mụi trng.III. Nguyờn tc, k thut chung trong nuụi cy mụ t bo:

Ngy nay, hu ht cỏc nh nghiờn cu khoa hc u thng nht rng thnh
cụng ca nuụi cy mụ t bo ch t c khi nú tri qua 5 bc sau:

Bc 0: Bc chun b
Chn lc cõy m t tiờu chun sau:
- Cõy m cú c im di truyn, c im nụng, sinh hc quý ta cn.
- Cú kh nng sinh trng v phỏt trin tt.
- Sch bnh, c bit l sch virus.
- Nu trong t nhiờn khụng cú nhng cõy t tiờu chun trờn, phi trng cỏc
cõy m trong iu kin cỏch ly vi ngun bnh hoc ti u v iu kin
chm súc, dinh dng, bo v thc vt cú cõy m t tiờu chun.

Bc 1: Nuụi cy khi ng

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

9

đa thêm vào cht điu khin sinh trng, các cht b sung khác nh nc da,
nc chit nâm men, dch thu phân casein kt hp vi các yu t nhit đ, ánh
sáng nhm đt đc h s nhân chi cao nht mà vn đm bo sc sng, bn
cht di truyn, có th to thành cây hồn chnh, đt tiêu chun cây ging  giai
đon sau . Tuy nhiên, tu tng đi tng ni cy, ngi ta có th đt đc h
s nhân cao bng vic kích thích s hình thành các cm chi hay kích thích s
phát trin ca các chi nách hoc thơng qua vic to cây t phơi vơ tính.

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

10Bc 3: To cây hồn chnh
Khi đt đc mt kích thc nht đnh, các chi đc chuyn t mơi
trng trong bc 2 vào mơi trng to r. Thng sau 2-3 tun, t nhng chi
riêng l này s xut hin r.  giai đon này, ngi ta b sung vào mơi trng
các auxin vì auxin là nhóm hormon thc vt quan trng có chc nng to r ph
t mơ ni cy. Tuy nhiên,  mt s lồi nh chui hoc cây ngái s hình thành
r tt hn c đt đc trong mơi trng khơng có cht điu hồ sinh trng.

Bc 4: Thích ng cây in vitro trong điu kin t nhiên
Giai đon đa cây hồn chnh t ng nghim ra đt là bc cui cùng ca
quy trình ni cy mơ t bào.
Cây ly ra ng nghim phi đc ra sch agar bám trên b mt r đ tránh s
xâm nhp ca cơn trùng và nm mc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy
trình này s thành cơng hn nu trc khi đa cây con ra đt ta m cây trên cát
có đ m 90% t 10 đn 15 ngày. Trong nhng khong thi gian này, r mi
đcc sinh ra và bt đu hình thành lá mi. Sau đó chuyn cây ra đt vi ch đ

+ Khc phc: Chn mu non gim hm lng tanin, polyphenol ;
gõy vt thng c gii ti thiu nht; x lý mu cy bng cỏch
ngõm trong dung dch axit hu c cú tớnh kh mnh: axit ascorbic,
axit xitric; b sung vo mụi trng than hot tớnh hp ph cỏc
cht núi trờn.
- Hin tng thu tinh hoỏ mu cy
+ Khi nuụi cy trong mụi trng lng v bỡnh nuụi b hn ch v
kh nng trao i khớ thỡ t bo v mụ thc vt b mng nc, tr
nờn trong sut, cú hỡnh dng khụng bỡnh thng
+ Khc phc: B sung vo mụi trng cht gõy ỏp sut cao, cht c
ch tng hp etilen, tng cng chiu sỏng v gim nhit
phũng nuụi .

IV. ng dng ca nuụi cy mụ t bo trong cụng tỏc ging cõy trng:


THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

12

Ni cy mơ, t bào thc vt có th phc v rt nhiu lnh vc khác nhau.
Trong cơng tác ging cây trng, ni cy in vitro đc ng dng đ:
- Làm phong phú vt liu di truyn cho cơng tác chn ging.
- Duy trì, bo qun, nhân nhanh các ging và cá th có ý ngha khoa hc, có
giá tr kinh t cao.
- Làm sch virus, phc tráng ging b thối hố vì bnh.
Trong s đó, ng dng đ nhân nhanh ging vơ tính cây trng bng
phng pháp ni cy in vitro đc quan tâm hn c. Ngi ta c tính có
khong 300 loi cây có th đc nhân ging bng phng pháp này. Li ích ca

ng dng to ln trong cơng tác lai to và nhân nhanh ging cây trng. V.Kt qu và tho lun
Thc hin ni cy mơ đi vi loi mu là cây hoa cúc ly t vn ca
vin Di truyn nơng nghip.
- Mu cây đc ct b lá và ct thành nhng đon dài 5-7 cm.
- Ra mu bng nc ra bát lỗng sau đó ra li bng nc sch 3 ln.
- Ra mu bng cn 70 đ trong 1 phút đ sát trùng s b sau ra li bng
nc sch 3 ln.
- Kh trùng mu bng hydroperoxide trrong 10-15 phút sau đó tráng sch bng
nc ct.
- Ct cành thành tng đon ngn, mi đon có ít nht mt mt ng.
- Cy mu vào mơi trng ni cy có nng đ aucin-cytokinin thích hp, sau
3 tun các mt ng s phát trin thành chi.
- Thng sau q trình này câty đc ni cy bng phng pháp ct lát mng
đ có đc h s nhân nhanh ln.
-Sau khi đã có đc chi tin hành x lý ra r bàng cách ct chi cy vào mơi
trng thích hp,sau khong 2 tun s có r.
- Khi cây đã có r có th tin hành vic thích nghi cây vi điu kin sng t
nhiên trong vn m :có gi th thng là đt trn tru hun có b sung các
ngun cht dinh owng trong điu kin chiu sáng 50%.
- Mt thi gian sau,nu t l cây sng đt hn 85% có th đem cây con trng
trong điu kin bình thng.


THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

14

Loi virus ny gõy ra cỏc loi khm v bin dng lỏ khỏc nhau, in hỡnh
nht l dng bin dng hỡnh kim, gõy nờn nhng thit hi nghiờm trng
trong sn xut c chua v thuc lỏ. Virus ny c lan truyn qua Aphis
gossyphii. Nú thuc nhúm Cucumovirus cú cu trỳc ARN mch n. Xut
hin dch bnh khụng cú quy lut bỏo trc.
Virus khm thuc lỏ - Tobacco Mosaic Viruses (TMV)
Loi virus ny gõy ra cỏc loi khm v phng lỏ khỏc nhau, in hỡnh nht
l dng khm san hụ gõy nờn nhng thit hi nghờim trng trong sn xut

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

16

cà chua, gây nh hng đn cht lng thuc lá. Virus này đc lan truyn
bng con đng c hc, đng thi đi vi cà chua virus này còn lan truyn
qua ht. Nó thuc nhóm Tobamovirus có cu trúc ARN mch đn.
Virus Y khoai tây – Potato Y Viruses (PVY).
Loi virus này gây ra các loi khm và các dng hoi t  tht và gân lá
khác nhau, gây nên nhng thit hi nghiêm trng trong sn xut cà chua và
thuc lá. Vect ca virus này là các loi mui khác nhau. Nó thuc nhóm
polyvirus có cu trúc ARN mch đn.

2.S lan truyn virus trong t nhiên

Virus thc vt không th t lây nhim vào các mô, t bào ca vt ch mà
chúng ch thâm nhp vào khi các t bào hoc các mô ca vt ch b tn thng.
Trong t nhiên quá trình này đc thc hin thông qua các vi sinh vt khác,
nhng sinh vt mang virus t cây này truyn cho cây khác gi là vect truyn
bnh. Ngày nay nhng phng thc truyn bnh ca virus đã đc xác đnh,

c gi l tn ti khụng vnh vin (Non persistent).
- Cụn trựng sau vi gi mang virus t cõy bnh mi cú kh nng truyn
bnh sang cõy khỏc. Kh nng ny ch tn ti trong vi ngy liờn tc,
trng hp ny gi l bỏn vnh vin (semi-persistent).
- Cụn trựng ch cn 15 phỳt lõy nhim virus t cõy bnh nhng ch cú th
truyn bnh sau ú vi gi v truyn bnh liờn tc trong mt vi tun, gi l
truyn bnh vnh vin tun hon (persistent circulative).
- Cụn trựng sau 15 phỳt lõy virus cú th truyn bnh liờn tc sut c chu
k sng v c th h sau ú vn cũn nguyờn kh nng truyn bnh, gi l
truyn bnh vnh vin lan truyn (persistent psopagative).
3. K thut min dch liờn kt enzym
( ELISA enzym linked immuno _sorbent assay)
Phng phỏp th min dch da trờn phn ng gia mt khỏng nguyờn v
mt khỏng th l nhng protein cú trng lng phõn t ln thu c do to
min dch mỏu núng ca ng vt cú vỳ ( chut, th, nga, dờ ) bng nhng
phõn t gõy min dch ( protein, polysaccharides, ARN 2 mch b xung
, ).Trong trng hp ny khỏng th c gi l khỏng th a dũng

THệ VIEN ẹIEN Tệ TRệẽC TUYEN
KILOBOOKS.COM

18

(polyclonaux) vì chúng đc to ra t các dng hot hố ca mt qun th d
cht ca nhng t bào limpho B trong máu đng vt. Chúng là mt hn hp ca
các kháng th khác nhau phn ng vi nhiu đim cui ca kháng ngun hoc
nhng đnh ca phân t gây min dch. Phn ng kháng th – kháng ngun là
mt cơng c rt hiu nghim đ chun đốn bnh virut, vi khun, nm,
mycoplasma, tuyn trùng và các véc t truyn bnh. Hin nay k thut ELISA
còn giúp chúng ta xác đnh đc hàm lng thuc tr sâu (pesticide) tn d

19

đnh bng mt kháng th đc hiu hp th trên b mt vt cng ti các going ca
mt vi chun đ ( plaque de microtitration ) cu to bng polyvinyl hoc
polystyrene. Nhng phn ng khác nhau xy ra liên tip và nhng phân t t do
đc loi tr bng các ln ra. Phn ng ca virus cng tp trung và đc tng
cng bng mt pha đa thêm vào mt kháng th đc hiu có gn mt enzym
đánh du, có phn ng hồn tồn vi virus và đc tìm ra bng nhum màu
trong din bin gim dn ca enzym  cht nn thích hp. S thu phân din ra
qua mt phn ng màu quan sát đc bng mt hoc đo bng dng c quang
hc. Trong trng hp khơng có virus trong mu kim tra, enzym gn vi kháng
th khơng gi li đc gi li và s khơng có mu.
Phng pháp ELISA khơng nhng đáp ng đc nhng tiêu chí phc tp mà
còn d dàng t đng hố và d dàng tìm kim nhng cht phn ng trên th
trng .
'ng dng ca ELISA trong vic phòng chng và phát hin bnh:
- Nhn bit các tác nhân gây bnh ch yu, đa ra nhng d liu v bnh dch
hc, xác đnh đc mc đ nhim đ qun lý đánh giá các ging kháng
bnh…
- Thu đc các ngun liu thc vt sch bnh bng quy trình chn ging
sch bnh  nhng giai đon nhân ging khác nhau.
- Kim tra ngun liu thc vt nhp ni và ngn nga s xâm nhp ca các
bnh l vào lãnh th.
- Theo dõi thng xun các loi vi sinh vt, phát hin và dit tr  dch có
th là các kho cha các vt truyn bnh (cơn trùng, tuyn trùng, nm…)

II.Vt liu và nghiên cu
1.Vt liu nghiên cu.
1.1 Vt liu thc vt.
Các mu cà chua thu thp ti vn thí nghim ca vin di truyn nơng

PO
4
42,9g Nc ct 2 ln 1000ml
- Dung dch PBS – T: PBS + 0,5ml Tween 20.
- Dung dch PBS – T – PVP
PBS – T + 2% PVP (polyvinyl pyrolidone)
- Dung dch hin màu (Substrate) pH9,8
Diethanolamine 97,00ml
NaN
3
0,20g
Nc ct 2 ln 900ml

2 Phng pháp nghiên cu

2.1 Phng pháp chun b mu.
- 0,5 gam mu đc ly  các v trí khác nhau (Virus đ chn đốn bnh ta ly
mu  lá, mt s mu ly  ngn ) và đc nghin trong dung dch chit.
- Mu đc nghin trong dung dch dch chit vi t l 1/10 (1mg/ 10ml dung
dch đm). Sau đó dch nghin đc lc qua bơng thu tinh đ gi li nhng
phn thc vt khơng b nghin nát đ thu đc mt dch đng nht. Dch này
đc pha lỗng vi các t l khác nhau đ:
o Xác đnh ngng gii hn ca phép th (Gii hn đ hồ lỗng kháng
ngun).

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

21


Các bc tin hành
1. t kháng th đc hiu đã đc hồ lỗng trong dung dch đm coating
vào ging ca đa plaque (100l/ging).
Enzyme

Th฀ c฀ng
h฀p
฀
฀
t kháng th
฀฀฀c hi฀u
Kháng th

฀
n c
฀
a ph
฀
n
฀ng
Ch
฀
t n
฀
n cho
ph฀n ฀ng
nhu฀m màu

THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

23

o  trong 2h  37
0
C
o Ra đa plaque 3 ln bng dung dch PBS – T.
2. Cho dch cây nghiên cu đã đc hồ lỗng trong dung dch đm PNS –
T + PVP vào ging ca đa plaque (100l/ging).
o   37
0
C trong 2h hoc 1 đêm  4
0


THƯ VIỆN ĐIỆN TỬ TRỰC TUYẾN
KILOBOOKS.COM

24
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B TP 1 4 7 10 - 3 6 9
C TP 1 4 7 10 - 3 6 9
D + 2 5 8 TP 1 4 7 10
E + 2 5 8 TP 1 4 7 10
F - 3 6 9 + 2 5 8
G - 3 6 9 + 2 5 8
H


kt qu gn tng t nh mu i chng sch, thm chớ cú mu cũn cho
kt qu nh hn, iờự ny cho phộp ta kt lun mu c chua em phõn tớch
hon ton khụng b nhim TEV.
Vi bnh do virus TSV gõy ra, hu ht cỏc mu phõn tớch u cho kt qu O.D
nh hn mu i chng sch, ch cú mu s 2 l cho kt qu ln hn nhng li
ch ln hn cú 1.037 ln. Mu s 10 cú ch s O.D ln hn c ch s mu i
chng dng. Nh vy kt qu mu phõn tớch cho ta thy cõy ờm phõn tớch
bc u nhim virus TSV.
Cỏc yu t nh hng n kt qu ca DAS-ELISA:
1. nh hng ca nhit bo qun:
- Mu sau khi tỏch chit c chia ra bo qun cỏc nhit khỏc nhau 20, -4,
-20 v -84
0
C cho nhng giỏ tr OD khỏc nhau rừ rt. T s liu thu c cho
thy -84
0
C cho giỏ tr cao nht.
2. nh hng ca thi gian bo qun mu ti kt qu thớ nghim:
- Mu tin hnh thớ nghim ngay sau khi c tỏch chit cho kt qu chớnh xỏc
nht. Ngha l nờu skhụng bt buc phi bo qun mu trong -84
0
C cho kt qu
chớnh xỏc v nhy nht. Nu s dng mu qua bo qun kt qu s cho nhy
kộm hn v ch nờn dựng mt ln khụng nờn lp li.
3. nh hng ca thi gian bo qun a ti kt qu thớ nghim sau khi cho
khỏng th hỳt bỏm b mt cỏc ging:
- Khi so sỏnh giỏ tr OD i vi i chng bnh v i chng sch ca thớ
nghim ti cỏc thi im sau khi cho khỏng th hỳt bỏm b mt ging cho thy
thi gian bo qun a khỏc nhau khụng nh hng ti giỏ tr OD.
4. nh hng ca bt khớ khi cho dung dch cht hin mu vo trong mi ging