Viện Công nghệ sinh học
BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NHÁNH
KC10-10/06-10/02

nhiều biểu hiện bệnh lý khác. Việc sử dụng miễn dịch học liệu pháp đặc hiệu
(immunotherapy) bằng dị nguyên D. pteronyssinus và D. farinae trong điều trị, nhằm
mục đích làm giảm thiểu số lượng bệnh nhân mắc các bệnh dị ứng, ngăn ngừa sự gây
m
ẫn cảm ở những bệnh nhân mới, tiến tới ngăn ngừa sự tiến triển xấu đi của các bệnh
dị ứng đang được ứng dụng rộng rãi. Điều kiện mang tính quyết định trong miễn dịch
học liệu pháp đặc hiệu bằng dị nguyên là dị nguyên phải được chiết xuất từ chính các
loài mạt gây dị ứng cho bệnh nhân đã được giám
định loài. Vấn đề này hiện nay chưa
được nghiên cứu giám định một cách chính xác giữa các loài mạt có trong bụi nhà ở
các vùng địa lý khác nhau, trong đó có Việt Nam.
Cho đến nay, việc phân biệt và giám định các loài mạt có trong bụi nhà và
giống nuôi cấy sản xuất dị nguyên, chủ yếu dựa trên phương pháp hình thái học. Tuy
nhiên, phương pháp này không cho phép xác định chính xác sự đa dạng tiến hoá của
các loài mạt và loài chủ yếu gây dị ứng có trong quần thể. Mặt khác, giám định phân
loại các loài mạt bằng kĩ thuật sinh học phân tử vẫn còn rất hạn chế, mặc dù đã được
ứng dụng chẩn đoán, giám định đối với nhiều loài sinh vật như: ký sinh trùng gây
bệnh, vi khuẩn, virus với độ chính xác cao. Việc giám định loài D. pteronyssinus và
D. farinae bằng phương pháp giám định gen (hay còn gọi là giám định phân tử) là
những nội dung mới, quan trọng trong nghiên cứu tạo ra sản phẩm đơn loài hay đa
loài, giúp cho việ
c điều trị các bệnh di ứng bằng miễn dịch học liệu pháp nhằm hạn
chế các bệnh này một cách có hiệu quả.
Trong hơn một thập kỷ qua, phương pháp giám định loài sinh vật dựa trên đặc
điểm phân tử ADN đã phát triển và đang được sử dụng rộng rãi. Thực chất của
phương pháp phân loại này là dựa vào các đặc điểm kiểu gen (genotype) thay vì sử
dụng ki
ểu hình (phenotype) trong phương pháp phân loại hình thái học, với ưu điểm
là cần ít mẫu vật, không phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển cá thể của sinh vật, có
độ chính xác cao rất phù hợp cho việc phát hiện và định loại các loài sinh vật. Hiện

Minh Thục chủ nhiệm (Viện Tai-Mũi-Họng) và Viện Vacxin cơ sở II Đà Lạt chủ trì.
Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài với mục tiêu: Giải mã và so sánh biến đổi
thành phần gen 12S và cox1 của mạt gây dị ứng thuộc giố
ng Dermatophagoides
(Dermatophagoides pteronyssinus và Dermatophagoides farinae, mẫu của Mỹ) và
chẩn đoán giám định loài mạt gây dị ứng tại Việt Nam, từ đó xây dựng qui trình giám
định và qui trình chẩn đoán mạt bụi nhà D. pteronyssinus tại Việt Nam.
Các nội dung đặt ra để thực hiện, như sau:
1 – Giải trình trình tự một đoạn gen 12S, cox1 của mẫu chuẩn D.
pteronyssinus và D. farinae có nguồn gốc từ Mỹ.
2 – Giải trình tự
một đoạn gen 12S, cox1 của các mẫu mạt thu tại Việt Nam để
định loại và xây dựng phương pháp chẩn đoán giám định phân tử.
3 - Phân tích trình tự nucleotide của các gen thu nhận từ các mẫu mạt
Dermatophagoides spp nghiên cứu, so sánh với trình tự tương ứng của các loài mạt
khác nhau trên thế giới.
4 – Khảo sát giá trị ứng dụng chỉ thị phân tử của gen 12S và cox1 trong phân
tích và giám định các loài mạt.
5- Xây dựng qui trình giám đị
nh gen mạt bụi nhà D. pteronyssinus của Việt
Nam có được qui trình và kit xét nghiệm phân tử D. pteronyssinus và D. farinae. 3
6- Xây dựng qui trình chẩn đoán phân tử mạt bụi nhà D. pteronyssinus của
Việt Nam, có được qui trình chi tiết các bước tiến hành thực hiện chẩn đoán phân tử
D. pteronyssinus và D. farinae thực hiện được tại Việt Nam.
7- Trên cơ sở qui trình chẩn đoán, giám định, định kỳ thực hiện kiểm nghiệm
giống mạt theo lô để nuôi cấy tạo nguồn dị nguyên thuần khiết.
8- Góp phần đào tạo nghiên cứ

trình tự, định kỳ kiểm
tra giống
Nguyễn Thị Tuyết
Nhung
ThS, NCV
Phòng Miễn dịch học
Tham gia Tách ADN tổng số;
thực hiện PCR, giải
trình tự
Hoàng Thị Minh Châu ThS, NCV
Phòng Miễn dịch học
Tham gia Thực hiện một số công
đoạn đề tài, quản lý
kinh phí, viết báo cáo
Vũ Thị Tiến CN, NCV
Phòng Miễn dịch học
Tham gia Thực hiện PCR, giải
trình tự, xây dựng kit
sinh học phân tử
Vũ Đức Anh* CN (Trường ĐH KH
Tự nhiên Hà Nội,
cao học năm 2008)
Tham gia Các công đoạn của đề
tài và viết luận văn
Hoàng Văn Mạnh* CN (Trường ĐH KH
Tự nhiên Thái
Nguyên, cao học
năm 2008-2009)
Tham gia Các công đoạn của đề
tài và viết luận văn

có thể chúng cũng là (các) loài gây bệnh dị ứng ở nước ta (Đoàn Thị Thanh Hà, 2002;
Phạm Quang Chinh, 2004). Do đó, việc nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử để ứng
dụng cho giám định chính xác loài mạt D. pteronyssinus, D. farinae, nuôi cấy, tách
chiết và nghiên cứu các đặc tính sinh h
ọc của dị nguyên mạt D. pteronyssinus và D.
farinae, giúp cho việc chẩn đoán và điều trị hiệu quả các bệnh dị ứng là một yêu cầu
cấp thiết và có ý nghĩa khoa học (Vũ Thị Minh Thục, 1995; Phạm Quang Chinh và
cs, 2003).
1.2. Đặc điểm sinh học các loài mạt Dermatophagoides spp
1.2.1. Đặc điểm hình thái học
Mạt D. pteronyssinus và D. farinae có dạng hình oval. Mạt D. pteronyssinus
không phân chia thành các phần đầu, ngực, bụng rõ ràng nh
ư các côn trùng khác mà
đầu - ngực và bụng hợp thành một khối duy nhất gồm: thể hàm, phần thân và các cấu
tạo khác (vỏ, chân, hậu môn và cơ quan sinh sản) (Lyon, 1991) (Hình 1.1). Mạt gây
dị ứng (hen phế quản, viêm mũi dị ứng) có trong bụi nhà và đồ dùng gia đình là một
loại động vật vi chân đốt (microathropods), có kích thước khoảng 250-300 µm, hiện 5
nay được phân loại thuộc ngành Chân khớp (Arthropoda), bộ Acariformes, lớp Nhện
(Arachnida) (Suarez-Martinez và cs, 2005). Mạt thuộc bốn họ (Pyroglyphidae,
Glycyphagoidea, Acaridae, và Echimyopodidae) là thành phần thường xuyên trong
bụi nhà, chăn chiếu, dụng cụ gia đình, có sản phẩm trao đổi chất là dị nguyên gây dị
ứng phổ biến trong xã hội. Mạt nhà, trong đó đặc biệt là hai loài Dermatophagoides
pteronyssinus Trouessart 1897 (Dp) và Dermatophagoides farinae Hughes (Df),
thuộc họ Pyroglyphidae, có vai trò chính gây dị ứng đối với cộng đồ
ng trên toàn thế
giới (Fleming, 1999; Suarez-Martinez và cs, 2005).


Giống Dermatophagoides (Hình 1.2). Nghiên cứu về sự phân bố của các loài mạt có
trong bụi nhà đã phát hiện trên 130 loài mạt thuộc 27 họ, trong đó D. pteronyssinus là
ABAB6
loài mạt phổ biến nhất, chiếm từ 70%- 98% tổng số mạt phát hiện được, phần lớn số
còn lại đều ít gặp (Suarez-Martinez và cs, 2005). Sự phân bố của các loài mạt phụ
thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau: mùa, vị trí địa lí, đặc điểm khí hậu, điều kiện xã
hội và sinh hoạt (Fleming và cs, 1999). Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố cho
thấy, ở các nước châu Âu chủ yếu gặp các loài m
ạt thuộc họ Pyroglyphidae. Đặc biệt,
mạt thuộc họ này được phát hiện trong 100% các mẫu bụi nghiên cứu ở Hà Lan và ở
Italia là 73%. Cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu
được công bố về sự phân loại chính xác của các loài mạt này trong bụi nhà, tuy đã có
một số nghiên cứu nuôi cấy, tách chiết dị nguyên và khảo sát đặc tính sinh hoá học
miễn dịch dị nguyên của loài mạt phân lập tại Việt Nam (Đ
oàn Thị Thanh Hà, 2002;
Phạm Quang Chinh và cs, 2003; Phạm Quang Chinh, 2004).

ARTHROPODA
PROARTHROPODA EUARTHROPODA
TRILOBITIFORMA CHELICERATA MANDIBULATA
Crustaceans Myriapoda Insects
ARACHNIDA
ARANEAE SCORPIONES
ACARINA
GAMASIFORMA SARCOPTIFORMA TROMBIDIFORMA
GAMASOIDAE IXOIDAE ACAROIDAE ORIBATEI TARSONEMOIDAE TROMBIDIOIDAE DEMODICOIDAE
Derman-

(Eucaryota). Ty thể có các đặc điểm cấu tạo đặc trưng, không giống với các bào quan
khác trong tế bào. Bao ngoài ty thể là hai lớp màng, màng ngoài nhẵn, màng trong
gấp nếp. Chúng có ADN hệ gen riêng cấu tạo dạng vòng cùng với đó là bộ máy phiên
mã và dịch mã riêng. Bào quan này nhân lên độc lập không phụ thuộc vào quá trình
phân chia c
ủa tế bào. Các đặc điểm này của ty thể rất giống với đặc điểm cấu tạo của
vi khuẩn và do đó các nhà khoa học cho rằng ty thể là bào quan bắt nguồn từ vi khuẩn
sống cộng sinh nội bào (endosymbiosis) với các tế bào nhân thật xuất hiện sớm nhất
(Saccone và cs, 1999; Kuroiwa và cs, 2006).
Ty thể có hình hạt đậu hoặc ovan, kích
thước từ 0,5-1 µm, được bao bọc bởi hai lớp màng: màng ngoài nhẵn, trên đó có các
protein có chức năng vận chuyển các chất vào và ra khỏi ty thể; màng trong cuộn lại
thành các nếp gấp, là nơi diễn ra quá trình tổng hợp ATP của ty thể. Hai màng ty thể
chia ty thể thành hai khoang khác biệt. Khoang chứa chất đệm cơ bản (matrix) nằm
bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa màng trong và màng ngoài, trong đó
có hệ gen ty thể (Kuroiwa và cs, 2006).

Ở hầu hết các động vật, hệ gen ty thể là các phân tử ADN dạng vòng, kích
thước 13-20 kb, chứa 36 hoặc 37 gen, cùng với một số vùng cần thiết cho quá trình
tái bản và phiên mã (Boore, 1999). Trong số đó, có 12 hoặc 13 gen mã hoá cho các
protein tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử; 2 gen ARN ribosome, 22 gen ARN
vận chuyển acid amin cần thiết cho quá trình tổng hợp protein và một vùng không mã
hóa có kích thước thay đổi tuỳ theo loài động vật (Zhang và Hewitt, 1997; Boore,
1999) (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể động vật
Protein được mã hóa Tên gọi ADN ty thể
động vật
Tên chuẩn hóa
dùng hiện nay
Cytochrome oxidase subunits I, II, III COI, COII, COIII cox1, cox2, cox3

các nhà khoa học cũng đã quan sát thấy có sự sắp xếp trật tự này thành A-C-W-N-Y ở
một số loài thú có túi (Boore, 1999). Hệ gen ty thể của động vật có vú có cấu trúc và
tổ chức hết sức chặt chẽ, các gen không chứa intron, một số trường hợp có hiện tượng
các gen gối lên nhau, giữa các gen không có sự tách biệt rõ ràng, nucleotide cuối
cùng của m
ột gen nằm gần nucleotide đầu tiên của gen tiếp theo và gần như là chỉ cần
một cặp base sau mỗi gen đã có thể xác định ranh giới cho một gen. Ngoại trừ vùng
không mã hoá (non-coding region), vùng này ở hệ gen ty thể của người và động vật
bậc cao còn có tên gọi là ‘D loop’, bắt đầu cho việc sao chép ADN (Lewine, 2008).
Sau động vật có xương sống, động vật chân khớp (Arthropoda) là nhóm có hệ
gen ty thể được nghiên cứu nhiều hơn c
ả. Các trình tự ADN toàn bộ hệ gen ty thể của
Drosophila melanogaster và D. yakuba được xác định có lẽ sớm nhất, không lâu sau
đó hệ gen ty thể ở người cũng đã được xác định. Nói chung, có rất ít sự sắp xếp lại
trật tự ADN ty thể giữa các loài trong cùng giống (genus), thuộc động vật chân khớp.
Nếu có, thì sự sắp xếp lại trong hệ gen ty thể chỉ xảy ra đối với các gen ARN vận
chuyển. S
ự thay đổi phổ biến nhất ở chân khớp thường xảy ra ở các gen nằm gần
vùng không mã hoá (long non-coding region). Sự sắp xếp lại dường như cũng xảy ra
ở các gen mã hóa cho ARN vận chuyển của vùng tương ứng với các acid amin A-R-
N-S
1 (AGN)
-E-F ở Drosophila (Zhang và Hewitt, 1997; Boore, 1999).
1.3.2. Các gen ty thể làm chỉ thị phân tử
Các gen mã hóa cho các protein ở hệ gen ty thể động vật bao gồm: 7 gen mã
hoá cho phức hợp nicotinamide dehydrogenase (nad) đó là nad1-6 và nad4L; 3 gen
mã hóa cho phức hợp cytochrome oxidase (cox) là cox1-3; 1 gen mã hoá cho
cytochrome b (cob) và 2 gen mã hoá cho adenosine triphosphatase (atp) là atp6 và
atp8. Hệ gen ty thể của tất cả sinh vật đa bào đều chứa 13 gen mã hoá protein, trong
đó có gen atp8 (Boore, 1999), kể cả ở loài mạt Dermatophagoides pteronyssinus

1.4.1. Xác định chỉ thị hệ gen ty thể trong nghiên cứu giám định loài mạt
Cho đến đầu năm 2009, chưa có các công trình nghiên cứu cơ bản nào về đặc
tính phân tử hệ gen ty thể của các loài mạt gây bệnh dị
ứng ở Việt Nam cũng như trên
thế giới được công bố. Tuy nhiên, trình tự hệ gen ty thể hoàn chỉnh của 28 loài thuộc
ngành Chân khớp Arthropoda đã được xác định. Gần đây, đầu năm 2009, công trình
giải mã toàn bộ hệ ge ty thể của loài mạt D. pteronyssinus đã được hoàn thành
(Dermauw và cs, 2009), hệ gen gồm 14.203 bp (đăng ký Ngân hàng gen số:
EU884425) (Hình 1.4).
Trong hơn một thập kỷ qua, phương pháp giám định loài sinh vật dựa trên đặc
điểm phân tử
ADN đã phát triển và đang được sử dụng rộng rãi. Thực chất của
phương pháp phân loại này là dựa vào các đặc điểm kiểu gen (genotype) thay vì sử
dụng kiểu hình (phenotype) trong phương pháp phân loại hình thái học, ưu điểm là
cần ít mẫu vật, không phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển cá thể của sinh vật, có
độ chính xác cao rất phù hợp cho việc phát hiện và định loại các loài sinh vật. Hiện
nay, nhiề
u chỉ thị phân tử (các gen hay tổ hợp gen) đang được sử dụng trong việc
giám định loài, đây là các gen hay tổ hợp gen có tính bảo tồn cao, và đặc trưng cho
loài sinh vật.
Thông thường, gen cox1, nad1, cob của hệ gen ty thể là những gen có giá trị
được chọn làm chỉ thị trong giám định và định loại các loài có họ hàng gần gũi; các
gen nad3, 16S (rrnL), 12S (rrnS), vùng không mã hoá (NR, non-coding region) được
chọn trong phân loại và so sánh biến đổi gen của các loài h
ọ hàng xa (hình 1.9). Các
gen ty thể là các cấu trúc di truyền đại diện dòng mẹ, do vậy, khi giám định các loài
có khả năng giao phối hay trong vùng tạp lai ngoại loài (inter-specific hybridization),
nhất thiết cần xem xét thêm chỉ thị hệ gen nhân (ví dụ ITS-2). Từ đó, việc phân tích
các loài Metazoan khác (Navajas và cs, 2002).

Hình 1.3. Vị trí các gen của hệ gen ty thể của ngoại ký sinh trùng ong mật Varroa
destructor và vùng gen cox1, 12S (vòng tròn) sử dụng trong giám định chẩn đoán loài mạt
Dermatophagoides spp.

Hệ gen ty thể của D. pteronyssinus: Toàn bộ hệ gen có độ dài 14.203 bp, bao
gồm 13 gen mã hoá cho protein, 2 gen ARN ribosome (rARN) và 22 gen ARN vận
chuyển (tARN). Trật tự sắp xếp của các gen đã có những thay đổi cơ bản so với một
số hệ gen ty thể của các loài mạt tổ tiên như Limulus polyphemus, chỉ có 11/38 gen có 11
độ bảo tồn trật tự sắp xếp (Dermauw và cs, 2009). Định vị trên sợi dương của hệ gen
ty thể có 8 gen, trên sợi âm (sợi bổ sung, comlementary strand) có 5 gen mã hoá cho
protein (Hình 1.4). Tổng toàn bộ thành phần A+T sử dụng kiến tạo hệ gen là 72,6%,
một vùng không mã hoá có độ dài 286 bp, có nhiều cấu trúc lặp, có lẽ đây là phần của
hệ gen chứa vùng điều khiển sự nhân lên của hệ gen ty thể. Phân tích phả hệ sử dụng
nucleotide và amino acid đều cho th
ấy, D. pteronyssinus tập hợp cùng một nhóm gần
gũi với Steganacarus magnus (Dermauw và cs, 2009). Với hiểu biết chi tiết hệ gen ty
thể của D. pteronyssinus việc nghiên cứu giám định và phân tích gen của (các) loài
mạt gây dị ứng tại Việt Nam càn có cơ sở tiến hành chính xác hơn.


1.5. Hệ gen nhân và các chỉ thị phân tử được sử dụng
Trong tế bào của cơ thể, song song tồn tại 2 hệ gen bao gồm hệ gen nhân tế
bào (nuclear genome) và hệ gen ty thể (mitochondrial genome, đối với động vật) hoặc
lạp thể (chloroplast, đối với thực vật). Hai hệ gen này đều có sản phẩm riêng, hoạt
động có tính chất vừa độc lập, vừa tương tác, và dĩ nhiên hệ gen ty thể chịu ảnh
hưở
ng điều hòa của hệ gen nhân tế bào.
Hệ gen nhân tế bào có hệ số đột biến thấp hơn hệ gen ty thể. Tuy nhiên, bất kỳ
sự thay đổi nào của các gen quan trọng cũng dẫn đến sự biến đổi hệ gen có tính chất
đặc trưng của loài. Xét về phương diện phân loại học, nếu chỉ chọn một hay vài gen
để phân tích, sẽ không cho kết quả của tiến trình tiến hoá, vì trong một loài các gen
cơ bản có chiều hướng bảo tồn rất cao. Do vậy phân tích gen bảo tồn trong hệ gen của
nhân chỉ có giá trị trong giám định, mà ít có giá trị trong phân loại (Lê Thanh Hòa,
2007). Mặt khác, các vùng có cấu trúc lặp, hay những vùng có hệ số biến thái cao
trong hệ gen nhân là đối tượng phân tích để phân loại (Blair, 2005). Hình 1.5. Chỉ thị phân tử ADN hệ gen nhân tế bào. (Ghi chú: A. Minh hoạ các chỉ thị phân tử hệ
gen ty thể thường sử dụng (vạch bên dưới các gen) đại diện là sán lá gan Fasciola hepatica; B sơ đồ
cấu trúc tổ hợp ADN ribosome của hệ gen nhân cung cấp chỉ thị 18S và ITS-2 với các mồi thực hiện
PCR (Lê Thanh Hòa và cs, 2007).

Chỉ thị phân tử ở hệ gen nhân tế bào thường được sử dụng là ADN ribosome
(nuclear ribosomal operon) và vùng giao gen ITS (Internal Transcribed Spacer) tiểu

BD2R
28S 18S 5.8S 28S 18S
12
Intergenic spacer (IGS)
Internal transcribed spacer
(ITS)
External transcribed spacer (ETS)
18S
5.8S
1 18S
ITS-2
5.8S 28S
ITS-2
3SF
BD2R
28S 18S 5.8S 28S 18S
12
Intergenic spacer (IGS)
Internal transcribed spacer
(ITS)
External transcribed spacer (ETS)
18S
5.8S
1 18S
ITS-2
ITS-113
gen ETS (External Transcribed Spacer) (Blair, 2005). Giữa gen 18S và 5,8S là vùng

Vũ Thị Minh Thục cung cấp (b
ảng 2.1), trong đó có nhiều mẫu của một cá thể nhằm
xác định độ sạch loài hiện có (mỗi mẫu một con); cũng như nhiều lô mẫu nuôi thuần
khiết (mỗi lô khoảng 10-20 con) (Bảng 2.1).
3. Tất cả mạt do Viên TMH cung cấp đều đã được chuyên gia xác định hình
thái học. Các mẫu mạt hoặc lô mạt sau khi tiếp nhận bắt buộc phải thẩm định bằng
phương pháp sinh học phân tử b
ằng cách so sánh đối chiếu chuỗi gen với mẫu mạt
chuẩn thuộc hai loài D. pteronyssinus và D. farinae của Mỹ.

Bảng 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
STT Mẫu Nguồn gốc Ký hiệu Ghi chú
1
D. pteronyssinus Mỹ DpA-US
Mẫu chuẩn được cung cấp
dưới dạng ADN tổng số
2
D. farinae Mỹ DfA-US
Mẫu chuẩn được cung cấp
dưới dạng ADN tổng số
3
Các lô mẫu mạt nuôi
tại Viện Tai-Mũi-Họng
Việt Nam
DpT(1-2-3-
4)-VN
Mẫu nghiên cứu được cung
cấp dưới dạng mạt đông lạnh
(từng cá thể hoặc từng nhóm)
theo các lô khác nhau để giám

- Các mồi cho phản ứng PCR đặt của hãng Bioneer (Hàn Quốc), các loại
enzym giới hạn: EcoRI, BamHI, NotI (New England BioLabs - Mỹ).
2.3. Phương pháp
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu phân tích gen 12S và cox1 từ hai mẫu mạt
chuẩn D. pteronyssinus và D. farinae của Mỹ và mẫu nghiên cứu nguồn gốc Việt
Nam, trên hai lĩnh vực kĩ thuật chính:
- Kĩ thuật sinh học phân tử (molecular cloning): phân lập gen 12S và cox1 từ
hai mẫu mạt chuẩn.
- Các chương trình tin-sinh họ
c (bioinformatics): thu nhận và phân tích các đặc
tính sinh học (thành phần nucleotide, acid amine, các khác biệt về thành phần
nucleotide cũng như acid amin). Xác định mối quan hệ phả hệ của các loài mạt dựa
trên trình tự gen 12S. Sơ đồ quy trình nghiên cứu gen 12S và cox1 hệ gen ty thể mạt
bụi nhà được trình bày trên Hình 2.1.
2.3.1. Tách chiết ADN tổng số
- Mục đích: i) Mẫu mạt chuẩn D. pteronyssinus và D. farinae của Mỹ được
cung cấp dưới dạng ADN tổng số có lý lị
ch kèm theo (Dr Slater JE, Biopol, USA); ii)
Thu nhận ADN tổng số của các cá thể hoặc các lô mạt Việt Nam với hàm lượng cao,
và đảm bảo độ tinh khiết làm khuôn cho PCR.
- Tiến hành: i) Các mẫu mạt chuẩn (USA) sử dụng trong nghiên cứu của chúng
tôi được cung cấp dưới dạng ADN tổng số; ii) Các cá thể hoặc từng lô mạt được tách
chiết ADN tổng số sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN). Do đó, sau khi
thu nhận ADN mẫu chuẩn hay tách chiết ADN từ m
ẫu nghiên cứu, chúng tôi tiến
hành điện di trên thạch agarose 1% để kiểm tra ADN tổng số trước khi sử dụng làm
khuôn cho phản ứng PCR.
- Các chương trình tin-sinh học (bioinformatics): thu nhận và phân tích các đặc
tính sinh học (thành phần nucleotide, acid amin, các khác biệt về thành phần
nucleotide cũng như acid amin). Xác định mối quan hệ phả hệ của các loài mạt dựa


Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát và xây dựng qui trình giám định và chẩn đoán

2.3.2. Thực hiện phản ứng PCR
- Mục đích: Thu nhận một lượng lớn các phân tử ADN của gen 12S và cox1,
sản phẩm được nhân lên nhờ chuỗi phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, làm nguyên
liệu cho quá trình tách dòng.
MẪU MẠT THEO LÔ (1 HOẶC 10 CON)
TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ
KIỂM TRA ADN TỔNG SỐ
THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR
(sử dụng kit PCR do Promega cung cấp)
TÁCH DÒNG SẢN PHẨM PCR
(dòng hoá vào vector pCR2.1TOPO)
GIẢI TRÌNH TỰ
(ADN plasmid tái tổ hợp)
XỬ LÝ CHUỖI GEN
(thành phần nucleotide và amino acid)
NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ PHÂN TỬ/SO SÁNH
(phân tích nucleotide, amino acid, xác định phả hệ)
XÂY DỰNG QUI TRÌNH
GIÁM ĐỊNH
XÂY DỰNG QUI TRÌNH
CHẨN ĐOÁN
ĐỊNH KỲ
KIỂM NGHIỆM GIỐNG
MẪU MẠT THEO LÔ (1 HOẶC 10 CON)
TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ
KIỂM TRA ADN TỔNG SỐ
THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR

Trình tự
Độ dài
(mer)
Độ dài của sản
phẩm thu được
Dp12F 5’ AAACTAGGATTAGATACCCTAG 3’ 22
Dp12R 5’ TACTATGTTACGACTTATCTATC 3’ 23
395 bp (toàn bộ
gen 12S)*
DpF 5’ GTTTTGGGATTATCTCTCATA 3’ 21
DpR 5’ GAGCAACAACATAATAAGTATC 3’ 22
378 bp (toàn bộ
gen cox1)
*Đặc hiệu chỉ riêng cho D. pteronyssinus để chẩn đoán.
- Tiến hành: i) Chúng tôi thực hiện phản ứng PCR sử dụng ADN tổng số thu
nhận làm khuôn, cặp mồi Dp12F-Dp12R để nhân đoạn gen 12S, cặp mồi DpF-DpR
để nhân đoạn gen cox1, trên khuôn ADN của hai mẫu chuẩn; sử dụng bộ kit PCR
(Promega), thực hiện trên máy PCR (PTC-100).
Các thành phần cho một phản ứng như sau:
Tên hóa chất Thể tích (µl)
PCR Master mix 25
Mồi xuôi 3
Mồi ngược 3
ADN tổng số 2
Nước khử ion 17
Tổng thể tích 50
Chu trình nhiệt của phản ứng:

95
o

2.3.3. Điện di
- Mục đích: Kiểm tra sự có mặt của ADN tổng số cũng như ADN sản phẩm
PCR.
- Tiến hành: Chúng tôi thực hiện điện di kiểm tra ADN t
ổng số, ADN sản
phẩm PCR và ADN plasmid tái tổ hợp trên thạch agarose 1%, bằng bộ điện di ADN
(Bio-Rad), đọc kết quả trên máy soi gen chụp hình Dolphin-DOC với phần mềm
Wealtec Dolphin 1.1.
2.3.4. Dòng hóa ADN sản phẩm PCR
- Mục đích: Thu nhận một số lượng lớn bản sao ADN sản phẩm PCR một cách
chính xác, làm nguyên liệu cho giải trình trình tự.
- Tiến hành: Chúng tôi sử dụng plasmid mang (còn gọi là vector dẫn truyền)
pCR
®
2.1-TOPO
®
với bộ Kit TOPO-TA cloning (Invitrogen) (hình 2.2).
Đây là loại vector được thiết kế có đầu lồi T (Thymine) phù hợp gắn với các
ADN có đầu lồi A (Adenin) sản phẩm của PCR sử dụng enzym Taq-polymerase, theo
nguyên tắc bổ xung tạo nên plasmid tái tổ hợp mang đoạn ADN ngoại lai. Sản phẩm
sau phản ứng được chuyển nạp vào các tế bào khả biến E. coli DH5α-T1 (Invitrogen),
và được nuôi cấy để chọn lọc các dòng tế bào tái tổ hợ
p nhằm thu nhận mốt số lượng
lớn plasmid tái tổ hợp chính xác. Các bước như sau:
* Thực hiện phản ứng nối ADN ngoại lai - sản phẩm của PCR
Thành phần phản ứng nối:
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Nước khử ion 2,5
Vector pCR
®

* Cắt kiểm tra: ADN plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI.
Do vector pCR
®
2.1TOPO
®
được thiết kế có điểm cắt của enzym giới hạn
EcoRI tại hai đầu của vùng tiếp nhận ADN ngoại lai, nên khi được cắt bằng EcoRI,
ADN plasmid tái tổ hợp được cắt thành hai đoạn hoặc nhiều đoạn (nếu trong ADN
ngoại lai có chứa điểm cắt của EcoRI). Một đoạn có kích thước 3,9 kb của vector
pCR
®
2.1TOPO
®
, và 1 (hoặc 2) đoạn có kích thước tương đương với đoạn ADN sản
phẩm của PCR được gài vào vùng nhân dòng của vector.
Thành phần phản ứng cắt ADN plasmid tái tổ hợp bằng enzym giới hạn
EcoRI.
Tên hóa chất Thể tích (µl)
Nước khử ion 16
Buffer cho EcoRI 2
Enzym EcoRI 1
ADN plasmid 1
Tổng thể tích 20
Sản phẩm sau cắt được điện di kiểm tra trên thạch agarose 1%, nếu sản phẩm
cắt cho kết quả tương ứng với kích thước ADN sản phẩm PCR, thì ADN plasmid tái
tổ hợp được thu nhận và được giải trình trình tự. Soi gen và chụp hình kết quả điện di
trên máy Dolphin-DOC, phần mềm Wealtec Dolphin 1.1.
2.3.5. Giải trình trình tự, thu nhận, xử lí và phân tích chuỗi gen 12S và cox1
Quá trình giải trình trình tự đoạn ADN sản phẩm thu nhận sau tách dòng được
ti


4
o
C - ON
Thu nhận sản phẩm.
* Tinh sạch sản phẩm của phản ứng giải trình trình tự: được tinh sạch bằng bộ
hoá chất Dye-Ex 2.0 Spin Kit (QIAGEN).
Sản phẩm sau khi tinh sạch, được đông khô và đọc trình tự trên máy tự động
ABI-3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
Trình tự chuỗi nucleotide thu nhận được xử lí, phân tích và so sánh với các
chuỗi gen 12S và cox1 thu nhận được so sánh với các chuỗi gen t
ương ứng của cùng
loài mạt D. pteronyssinus, D. farinae và các loài mạt khác đăng kí trong Ngân hàng
gen (Bảng 2.3).
Bảng 2.3. Danh sách các mẫu mạt sử dụng để so sánh, phân tích gen 12S và cox1
Kí hiệu mẫu Tên loài Nguồn gốc
Số đăng kí ngân
hàng gen
Gen 12S (rrnS)
1. DpA-US(60-1)12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus USA Đang đăng kí
2. DpA-US(61-3)12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus USA Đang đăng kí
3. Dp(strA)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AF529911
4. Dp(strB)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AF529912
5. Dp(strC)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AF529913
6. Dp(strD)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AF529914
7. Dp(strE)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết AF529915
8. Dp(cl2)-12S(395bp) Dermatophagoides pteronyssinus Không biết DQ402424
9. A. ovatus-12S(395bp) Aleuroglyphus ovatus Không biết AF529909
10. A. ovatus-12S(396bp) Aleuroglyphus ovatus Không biết AF529910

D. farinae có nguồn gốc từ Mỹ làm chỉ thị phân tử chuẩn để so sánh.
Nhóm kết quả II: Giám định gen mạt của Việt Nam (lô DpT4) ứng dụng ch
ỉ thị
phân tử 12S trong phân tích và so sánh với các chủng của Mỹ và thế giới.
Nhóm kết quả III: Kết quả định kỳ thực hiện kiểm nghiệm giống mạt theo lô (lô
DpT1, DpT2, DpT3) để nuôi cấy tạo nguồn dị nguyên thuần khiết.
Nhóm kết quả IV: Xây dựng qui trình giám định phân tử và qui trình chẩn đoán
phân tử mạt bụi nhà D. pteronyssinus của Việ
t Nam để thực hiện tại Việt Nam.
Nhóm kết quả V: Công bố bài báo khoa học và đào tạo.

1. NHÓM KẾT QUẢ I: GIẢI TRÌNH TỰ GEN 12S VÀ COX1 CỦA MẪU
CHUẨN D. PTERONYSSINUS VÀ D. FARINAE CÓ NGUỒN GỐC TỪ MỸ
LÀM CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHUẨN ĐỂ SO SÁNH
3.1.1. Đặt vấn đề
Dị nguyên là sản phẩm trao đổi chất của Dermatophagoides pteronyssinus
Trouessart (Dp) và D. farinae Hughes (Df) thườ
ng có mặt trong bụi nhà, gây nên các
triệu chứng bệnh lý dị ứng: hen phế quản, viêm mũi dị ứng, viêm kết mạc ở người
(Tilak và Jogdand, 1989). Giảm thiểu và điều trị dị ứng mạt bụi nhà là cách sử dụng
miễn dịch học liệu pháp đặc hiệu bằng dị nguyên Dp và/hoặc Df (Đoàn Thị Thanh
Hà, 2002; Fleming, 1999; Vũ Thị Minh Thục, 1995). Điều kiện mang tính quyết định
là dị nguyên phả
i được chiết xuất từ chính các loài mạt gây bệnh cho bệnh nhân, mà
giám định chủ yếu hiện nay là hình thái học, nhiều khi nhầm lẫn (Cevit và cs, 2007).
Do vậy, nghiên cứu giám định sinh học một cách chính xác để có loài thuần khiết
nuôi sản xuất dị nguyên là cần thiết. Muốn vậy, cần phải xác định chỉ thị phân tử
chuẩn từ (các) loài mạt chuẩn sinh học để có dữ liệu so sánh đối chiếu trong giám
định phân loạ
i (Lê Thanh Hoà, 2007). Chúng tôi đã tiếp nhận ADN của 2 loài mạt Dp

thạch agarose 1% (Hình 3.1A). Kết quả trình bày ở Hình 3.1 cho thấy, ở cả hai giếng
tra mẫu ADN tổng số của mẫu D. pteronyssinus (ký hiệu: DpA-US) và D. farinae (ký
hiệu: DfA-US),
đều cho kết quả là một băng sáng, rõ nét, chứng tỏ ADN tổng số
được tách chiết có chất lượng tốt, từ đó được sử dụng làm khuôn cho PCR, nhằm thu
nhận phân đoạn gen 12S và cox1.
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra ADN tổng số của các mẫu chuẩn (A); gen 12S của D. pteronyssinus (B)
và gen cox1 của D. pteronyssinus và D. farinae (C).

Với cặp mồi Dp12F-Dp12R, đoạn ADN của gen 12S có độ dài 395 bp trên
khuôn D. pteronyssinus và với cặp mồi DpF-DpR, gen cox1 có độ dài 378 bp trên
khuôn cả hai loài D. pteronyssinus và D. farinae thu được bằng phản ứng PCR được
trình bày ở Hình 3.1B và 3.1C. Kết quả kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 1%
cho thấy độ dài của các đoạn ADN là hoàn toàn tương ứng và đặc hiệu.
M
1
2
2kb

24

Hình 3.2. Kết quả kiểm tra ADN gen 12S và cox1 từ plasmid tái tổ hợp. Ghi chú: A. 3 clone tế bào
chứa plasmid tái tổ hợp mang gen 12S của mẫu D. pteronyssinus; B. Giếng 1, 2, 3: các clone tế bào
chứa plasmid tái tổ hợp mang gen cox1 của D. pteronyssinus; giếng 4, 5: các clone tế bào chứa
plasmid tái tổ hợp mang gen cox1 của D. farinae.

Các gen 12S và cox1 sản phẩm PCR của hai mẫu chuẩn D. pteronyssinus và D.
farinae được dòng hoá và cắt kiểm tra bằng enzyme EcoRI, sau đó được điện di trên
thạch argarose 1% (Hình 3.2). Kết quả trên Hình 2 cho thấy, ADN tái tổ hợp đã chứa
đúng các đoạn gen đích làm nguyên liệu cho giải trình tự. Như vậy, các sản phẩm gen
12S và cox1 thu nhận được từ các loài Dp và Df đã được dòng hoá vào plasmid thành
công để giải trình tự.
3.1.3. Kết quả
so sánh, phân tích trình tự chuỗi gen thu nhận từ mẫu mạt chuẩn
của Mỹ
Tỷ lệ tương đồng về thành phần nucleotide trình tự gen 12S của D.
pteronyssinus mẫu của Mỹ hoàn toàn cao đạt đến 99% so với gen 12S cũng của các

4
5
378bp
B
M
123
2kb
500bp
3,9kb
395bp
A
M
123
2kb
500bp
3,9kb
395bp
A
M
123
2kb
500bp
3,9kb
4
5
378bp
B
M
123
2kb