LỜI CẢM ƠN
Trước hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học
phân tử - Viện di truyền nông nghiệp cùng các cán bộ công nhân viên
trong phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập
vừa qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực
phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội và cô Nguyễn Xuân Sâm tạo điều
kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật.
1
LỜI MỞ ĐẦU
Viện Di truyền nông nghiệp được thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân
của Viện là Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984). Hiện nay,
Viện nằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội.
Chức năng chính của Viện là :
-Nghiên cứu, ứng dúng các phương pháp di truyền học hiện đại và công
nghệ sinh học để chọn tạo các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt,
chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môt trường.
-Tạo các chủng vi sinh vật mới phục vụ bảo quản và chế biến lương thực-
thực phẩm, sản xuất các loại chế phẩm sinh học phục vụ nền nông nghiệp bền
vững và bảo vệ môi trường.
-Tăng cường hợp tác quốc tế và tham gia đào tạo cán bộ về lĩnh vự Di
truyền và Công nghệ sinh học.
Để thực hiện được các chức năng trên, Viện đã tổ chức thành 10 đơn vị
nghiên cứu và chuyển giao công nghệ với tổng số cán bộ là 116 người trong đó
có 3 tiến sĩ , 6 phó giáo sư, 16 phó tiến sĩ và 8 thạc sĩ.
Trong những năm qua, Viện đã đạt được rất nhiều thành tựu, đã thực hiện
và chủ trì 18 đề tài nhà nước, 42 đề tài cấp ngành, 8 dự án sản xuất thử, tạo được
nhiều giống lúa mới và các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo ra các
quy trình tiến bộ kỹ thuật được công nhận. Ngoài ra, Viện còn thực hiện các dự
án hợp tác quốc tế với các tổ chức UNDP, FAO... Nhờ các thành tự trên mà
Viện đã nhận được nhiều giải thưởng có giá trị cả trong và ngoài nước: Giải

3
Các tác nhân gây bệnh vi sinh vật thường gây bệnh bằng cách can thiệp
vào quá trình trao đổi chất của tế bào cây thông qua các enzyme, các chất độc tố,
các chất điều hoà sinh trưởng và các loại chất khác mà chúng tiết ra khi tiếp xúc
với cây chủ, hoặc hấp thụ dinh dưỡng của tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử
dụng của chúng. Một số sinh vật khác lại gây bệnh bằng cách sống ký sinh và
phát triển, sinh sản trong hệ thống bó mạch mô gỗ hay bó mạch libe và hậu quả
tất yếu là làm tắc nghẽn đường vận chuyển lên xuống của nước và của đường.
Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng gây bệnh trên thực vật khi tác động với
mức ngoài ngưỡng chống chịu của cây.
Có rất nhiều loại bệnh hại cây trồng, chúng được phân nhóm theo rất
nhiều tiêu chuẩn: theo triệu chứng bệnh, theo bộ phận cây bị bệnh, theo loại cây
bị bệnh ... Hiện nay, phổ biến nhất là người ta phân loại bệnh cây dựa vào loại
tác nhân gây bệnh. Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật được chia làm 2 loại:
bệnh gây ra do các yếu tố sinh học và bệnh gây ra bởi các yếu tố không sinh
học. Theo tiêu chuẩn này, ta có thể chỉ ra được nguyên nhân gây bệnh, quá trình
tiến triển và cách lan truyền bệnh từ đó suy ra được biện pháp phòng trừ bệnh
4
PHẦN I: NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
I. Khái niệm chung:
Nuôi cấy mô tế bào là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại
nuôi cấy những nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi
trường dinh dưỡng nhân tạo và trong điều kiện vô trùng. Bao gồm:
- Nuôi cấy các cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
- Nuôi cấy các cơ quan, bộ phận tách rời của thực vật như mẩu lá, mẩu rễ,
một đoạn thân, một bộ phận của hoa, quả...
- Nuôi cấy phôi non (phôi chưa phân hoá hoàn toàn), phôi trưởng thành.
- Nuôi cấy mô sẹo (callus)
- Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bào
trần....

Ngoài ra, manitol, sorbitol được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền
phù và tế bào trần với chức năng ổn định áp suất thẩm thấu.
4. Vitamin: Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng
tổng hợp vitamin nhưng lượng tổng hợp được không đủ nên phải bổ sung
vitamin ngoại sinh vào môi trường cấy. Vitamin thường dùng là nhóm B
dễ hoà tan vào trong nước như B
1
, B
2
, B
3
, B
5
, B
6
....với hàm lượng từ
một đến một vài mg/l. Chúng là thành phần coenzim của hàng loạt
enzim xúc tác cho các phản ứng hoá sinh, vì vậy không thể thiếu
trong môi trường nuôi cấy.
6
*Myo-Inositol là một hợp chất thứ cấp có vòng thơm (chưa được xếp
vào vitamin), do sự tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế
bào, có tác động kích thích mạnh mẽ sự phân chia của tế bào, được sử
dụng với lượng lớn ~ 100 mg/l.
5. Chất điều khiển sinh trưởng: Là thành phần quan trọng nhất của
môi trường nuôi cấy, giúp điều khiển được quá trình phân hoá và phản
phân hoá tế bào, thể hiện được tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy
tế bào và mô thực vật tách rời. Người ta thường sử dụng chủ yếu hai
nhóm chất điều khiển sinh trưởng thực vật sau:
- Auxin: kích thích quá trình tăng trưởng của tế bào, kích thích

phát triển của mẫu cấy.
6. Chất làm đông cứng môi trường: Là giá thể cho mẫu cấy. Thường
dùng nhất là Agar agar. Đây là polysaccarit của tảo biển, hoà tan với
nước khi ở nhiệt độ lớn hơn 80
0
C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ
nhỏ hơn 40
0
C lại ở dạng rắn(gel). Agar có khả năng ngậm nước cao,
chỉ cần 6-12 g có thể làm đông đặc 1l nước và khi ở trạng thái rắn thì
tế bào và mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu được các chất dinh dưỡng
từ môi trường.
III. Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào:
Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành
công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt được khi nó trải qua 5 bước sau:
Bước 0: Bước chuẩn bị
Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau:
- Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần.
- Có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt.
- Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus.
- Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng các
cây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối ưu về điều kiện
chăm sóc, dinh dưỡng, bảo vệ thực vật… để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn.
8
Bước 1: Nuôi cấy khởi động
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy. Mẫu nuôi cấy thường
sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ. Ngoài ra,
tuỳ thuộc từng đối tượng nuôi cấy người ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy
như mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non.
Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trước khi tiến hành để đảm bảo mẫu

số nhân cao bằng việc kích thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự
phát triển của các chồi nách hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
Bước 3: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt được một kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi
trường trong bước 2 vào môi trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi
riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ. ở giai đoạn này, người ta bổ sung vào môi trường
các auxin vì auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ
từ mô nuôi cấy. Tuy nhiên, ở một số loài như chuối hoặc cây ngái sự hình thành
rễ tốt hơn cả đạt được trong môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng.
Bước 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên
Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của
quy trình nuôi cấy mô tế bào.
Cây lấy ra ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự
xâm nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy
trình này sẽ thành công hơn nếu trước khi đưa cây con ra đất ta ươm cây trên cát
có độ ẩm 90% từ 10 đến 15 ngày. Trong những khoảng thời gian này, rễ mới
đượcc sinh ra và bắt đầu hình thành lá mới. Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ
chăm sóc bình thường.
Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tế
bào.Đó là:
- Sự bất định di truyền
+ Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy
ra hiện tượng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh
lí, sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận được ở ngay giai
đoạn invitro hoặc giai đoạn exvitro.
+ Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non ít chuyên hoá để dễ điều
khiển và phát triển hình thái, giảm lượng chất điều khiển sinh
10
trưởng sử dụng, từ đó giảm được ảnh hưởng của chúng. Đồng thời,
phải hạn chế số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm

giá trị kinh tế cao.
- Làm sạch virus, phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh.
Trong số đó, ứng dụng để nhân nhanh giống vô tính cây trồng bằng
phương pháp nuôi cấy in vitro được quan tâm hơn cả. Người ta ước tính có
khoảng 300 loại cây có thể được nhân giống bằng phương pháp này. Lợi ích của
nó là ở chỗ: có thể tạo ra một quần thể cây con với số lượng lớn mà vẫn giữ
nguyên đặc tính cây mẹ, đó cũng là những cây giống khoẻ mạnh, sạch virus,
sinh trưởng tốt và cho năng suất cao; có thể phục tráng một quần thể thực vật có
nguy cơ diệt vong; có thể trao đổi quốc tế nguồn gen và lưu giữ, bỏ quản dạng
cây in vitro. Chính nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, người ta có thể tạo ra được
hệ số nhân giống cao, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích
cho nhân giống, dễ chăm sóc và dễ dàng khắc phục được những điều kiện bất
lợi. Phương pháp này tỏ ra đặc biệt hiệu quả với những loại cây khó nhân giống
bằng con đường hữu tính, các giống quý hiếm có số lượng giống ban đầu hạn
chế mà lại cần nhân nhanh.
Ở Việt Nam, từ năm 1975, nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nước đã
được thành lập và cho đến nay đã thu được một số kết quả đáng kể. Tại viện
Sinh vật-Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia đã hoàn thiện quy trình
nhân giống in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu như lúa,
thuốc lá, khoai lang, dứa sợi... Tại trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã
hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây chất lượng cao, bước đầu đi vào sản
xuất.Tại các tỉnh phía Nam đã xây dựng được ngân hàng cà phê với 10 dòng
khác nhau, hoàn thiện quy trình nhân giống cây cao su . Ngoài ra, các phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô tế bào trong cả nước đã nghiên cứu thành công nhiều quy
trình nhân giống cây hoa, cây ăn quả, cây rừng, cây quý hiếm...có giá trị cao.
12
Tóm lại, nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay được đưa vào trong các
chương trình chọn giống và nhân giống hiện đại, nó góp phần tích cực vào lý
luận sinh học cây trồng, vào thực tiễn nông nghiệp, mở ra một hướng đi mới cho
nghiên cứu di truyền học, hoá sinh, sinh lý thực vật..., đặc biệt nó đem lại những