Lu
Nguyn Th Lan 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Thị Lan NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN QUAN ĐẾN
KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU NHIỆT ĐỘ VÀ ẨM ĐỘ CAO CỦA
TẰM DÂU BOMBYX MORI L.
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2013 Lu
Lời cảm ơn



















 , 







Nguyn Th Lan

Lu
Nguyn Th Lan 4

MỤC LUC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13
1.1. Một số nét khái quát về tằm dâu 13
1.1.1. Vị trí phân loại 13
1.1.2. Nguồn gốc 13
1.1.3. Một số đặc điểm sinh học 14
1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới năng suất và khả năng chống chịu nóng ẩm của
tằm dâu 19
1.2. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa kinh tế của tằm dâu 21
1.2.1. Ý nghĩa khoa học 21
1.2.2. Ý nghĩa kinh tế 21
1.3. Phương pháp truyền thống đánh giá sức sống, năng suất chất lượng tơ kén
của giống tằm 23
1.4. Một số kỹ thuật phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa hình 23
1.4.1. Kỹ thuật PCR 24
1.4.2. Kỹ thuật RAPD 25
1.4.3. Kỹ thuật RFLP 26
1.4.4. Kỹ thuật AFLP 27
1.4.5. Kỹ thuật SSR 29

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55
3.1. Phân tích đa hình phân tử 55
3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 55
3.1.2. Phân tích đa hình phân tử của các giống tằm 57 Lu
Nguyn Th Lan 6

3.1.3. Phân tích quan hệ di truyền giữa các giống tằm 59
3.1.4. Xây dựng sơ đồ quan hệ di truyền giữa các giống tằm 60
3.2. Nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt
độ và ẩm độ cao của giống 61
3.2.1. Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ
cao 61
3.2.2. Khuếch đại và dòng hóa phân đoạn liên quan đến khả năng chịu nhiệt độ
và độ ẩm cao 62
3.2.3. Xác định trình tự liên quan tới khả năng chịu nhiệt độ và ẩm độ cao 65
3.2.4. So sánh trên ngân hàng gen và bản đồ genome tằm 66
3.2.5. Thiết kế mồi, tối ưu điều kiện khuếch đại phân đoạn liên quan đến khả
năng chịu nóng ẩm cao của tằm 70
3.2.6. So sánh tần số khuếch đại và khảo sát mồi đặc hiệu 73
KẾT LUẬN 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 77
PHỤ LỤC
Bảng 4
t b  dng c s dng
32
5
Bảng 5

33
6
Bảng 6
 ISSR
37
7
Bảng 7
-ISSR
38
8
Bảng 8
Phn ng gn sn ph
40
9
Bảng 9
Phn ng ct hn ch plasmid  hp
42
10
Bảng 10
N  sch DNA cu
46
11
Bảng 11
S n, t l  s PIC


Lu
Nguyn Th Lan 8

DANH MỤC HÌNH ẢNH

STT
Hình
Chú thích
Trang
1
Hình 1
Trng tm
5
2
Hình 2
T
6
3
Hình 3
Nhng tm
6
4
Hình 4

7
5
Hình 5
 phn ng ISSR
20

Hình 13
 quan h di truyn ging tm
51
14
Hình 14
n di sn phm PCR
52
15
Hình 15


53
16
Hình 16
n di sn pht DNA plasmid
53
17
Hình 17
n di kim tra kt qu bin np
54 Lu
Nguyn Th Lan 9

18
Hình 18
n di kt qu tinh sch Plsamid
55
19

Lu
Nguyn Th Lan 10

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
(Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành)
Từ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
AFLP
Amplified Fragment Length
Polymorphism DNA
Đa hình chiều dài các đoạn DNA được
khuyếch đại
Bp
Base pair
Cặp bazo
CTPT


ngẫu nhiên
RFLP
Restriction Fragment Length
Polymorphism DNA
Đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt
ngẫu nhiên bởi các enzym giới hạn
RNA
Ribonucleic acid
Axit ribonucleic
SSRs
Simple Sequence Repeats
Khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản
TLĐH

Tỷ lệ đa hình
TSPĐ

Tổng số PĐ được nhân lên với mồi đó
TAE

Tris - Acetic acid - Ethylen
Diamin Tetra Acetic Lu
Nguyn Th Lan 11

Lu
Nguyn Th Lan 12

Ở một số nước có ngành dâu tằm phát triển như Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn
Độ, Liên Xô cũ, Hàn Quốc đã có những công trình nghiên cứu về đa dạng di
truyền phân tử giống tằm. Các thông tin di truyền phân tử đã trợ giúp cho công tác
giống để phát triển tập đoàn dòng thuần, tìm hiểu ưu thế lai, xác định các cặp lai ưu
tú [52]. Sử dụng chỉ thị phân tử để phân loại, nhận dạng và chọn lọc giống theo các
tính trạng kinh tế. Bản đồ gen tằm đã được các nhà khoa học Nhật Bản, Trung
Quốc… xây dựng và một số gen liên quan đến năng suất, chất lượng tơ kén đã được
nghiên cứu. Bên cạnh đó, các nghiên cứu còn hướng vào việc tìm kiếm các chỉ thị
phân tử liên kết với các tính trạng kinh tế của giống để phát triển thành markers
phân tử đánh giá giống. Những công trình này đã góp phần đáng kể cho công tác
tạo giống tằm và có những thành công hơn so với các phương pháp truyền thống.
Ở nước ta, trong thời gian qua hướng nghiên cứu này đang ở giai đoạn khởi
đầu và là vấn đề cấp thiết. Các công bố hiện tập trung vào nghiên cứu đa dạng phân
tử giống tằm Việt Nam, xác định quan hệ di truyền, tìm hiểu ưu thế lai. Việc phát
triển chỉ thị phân tử liên quan đến việc đánh giá giống nhằm nâng cao hiệu quả
chọn tạo giống tằm cao sản và có khả năng chịu nóng ẩm cao đang mang tính thời
sự. Từ tình hình thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
phát triển chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm
độ cao của tằm dâu Bombyx mori L.”. Công trình được thực hiện tại phòng Thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học.
Mục tiêu:
Tìm kiếm chỉ thị phân tử liên quan đến khả năng chống chịu nhiệt độ và ẩm
độ cao của tằm dâu Bombyx mori L.
Nội dung nghiên cứu:
 Nghiên cứu đa hình phân tử của các giống tằm.

̀
thuần hoa
́
tư
̀
rất sơ
́
m . Theo những nghiên cứu phát sinh
chủng loại dựa trên cơ sở sự lai khác loài và so sánh cấu trúc gen đã cho thấy tằm
nhà ngày nay có quan hệ gần gũi với tằm dại (Bombyx mandarina). Nghiên cứu tế
bào học trên những con lai khác loài giữa Bombyx mandarina và Bombyx mori L thì
thấy sự hình thành thể tam trị, điều này chỉ ra rằng có thể 1 nhiễm sắc thể của
Bombyx mandarina đã bị tách làm đôi trong quá trình thuần hoá tằm dại thành tằm
nhà với nhiều đặc tính tốt hơn, quý hơn đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con
người về năng suất và chất lượng tơ kén [44]. Lu
Nguyn Th Lan 14

1.1.3. Một số đặc điểm sinh học
Vòng đời của tằm dâu: Tằm dâu là loài côn trùng biến thái hoàn toàn, vòng
đời trải qua 4 giai đoạn phát dục: Trứng, tằm, nhộng, ngài [12]. Vòng đời có thể
biến động dài, ngắn phụ thuộc vào điều kiện sống và kỹ thuật chăm sóc. Thời gian
của một vòn dâu như sau [21]:
Các thời kỳ
Giống lưng hệ (ngày)
Giống đa hệ (ngày)
Trứng
10-11

Lu
Nguyn Th Lan 15

vùng ôn đới. Sau 4-5 tháng lạnh của mùa đông thì trạng thái ngủ nghỉ (hay còn
được gọi là hưu miên) bị phá v và trứng được nở ra tằm con. Người ta đã lợi dụng
đặc tính này của trứng tằm để bảo quản trứng lâu dài, đi với nó là các phương pháp
đánh thức ngủ nghỉ bằng các biện pháp nhân tạo [12]. Giai đoạn tằm:
Là giai đoạn sinh trưởng dinh dưng, con tằm ăn lá dâu và lớn lên với tốc độ
nhanh, tằm sắp chín (đủ dinh dưng) lớn gấp 8.000-10.000 lần so với tằm mới nở
[21].
Tằm mới nở có màu nâu đậm hoặc màu đen, toàn thân phủ một lớp lông gai
nhỏ và mịn. Sau lần lột xác thứ nhất, lớp lông gai được trút bỏ, từ tuổi 2 da tằm trở
nên trơn và màu sắc nhạt dần (Hình 2).
Toàn bộ cơ thể tằm có hình trụ thuôn dài, chia làm 3 phần: Đầu, ngực và
bụng. Phần ngực với 3 đốt ngực và 3 đôi chân ngực, phần bụng gồm 10 đốt với 4 đôi
chân bụng và 1 đôi chân đuôi. Dọc 2 bên sườn của các đốt bụng và ngực, mỗi đốt có
một đôi lỗ thở [12].
ng tm
Lu
Nguyn Th Lan 16
Giai đoạn nhộng:

nhau để giao phối. Sau khi kết đôi, ngài cái sẽ đẻ khoảng 300 – 700 trứng tuỳ thuộc
vào giống tằm. Ngài là giai đoạn kết thúc một thế hệ tằm dâu. Hệ tính và tính ngủ
Hai đặc tính này thể hiện rõ sự thích nghi của tằm đối với môi trường.
* Hệ tính (voltinism): Là khái niệm chỉ số thế hệ trải qua trong một năm của
một giống tằm. Hệ tính phụ thuộc vào giống tằm và các điều kiện môi trường như
ánh sáng, độ ẩm, độ thoáng khí… đặc biệt là nhiệt độ [12]. Theo cách phân loại này
người ta chia tằm dâu ra làm 3 loại: Tằm độc hệ, tằm lưng hệ, tằm đa hệ.
+ Giống tằm độc hệ (univoltine): Là những giống tằm chỉ sinh ra một thế hệ
trong một năm. Trứng thường nở vào mùa xuân. Sau khi nuôi tằm kết thúc đời thứ
nhất, sinh ra trứng đời 2 thì trứng này đi vào nghỉ đông đến mùa xuân năm sau mới
. 
Lu
Nguyn Th Lan 18

nở [12]. Giống tằm na
̀
y đư ợc nuôi phô
̉
biến ơ
̉
vu
̀
ng ôn đơ
́

tằm trải qua một số lần lột xác. Ở mỗi tuổi tằm, sau khi đã đồng hoá thức ăn và đạt
được sự tăng trưởng tối đa của tuổi đó, lúc này da tằm đã căng hết c và không còn
khả năng lớn thêm về thể tích, tằm mất dần sự thèm ăn, lượng dâu ăn ít dần rồi tiến
đến ngừng ăn, chuẩn bị cho quá trình lột xác gọi là tằm ngủ. Tằm thường trải qua 4
lần ngủ ứng với 5 tuổi. Nhưng cũng có một số giống ngủ 3 lần và một số giống ngủ
5 lần [12]. Tằm chuẩn bị ngủ, da dần căng bóng, ăn ít lá dâu. Tằm ngủ, ngừng ăn, ít
động đậy, đầu ngẩng cao, sau 20-24 giờ tuỳ theo mùa, tằm lột xác chuyển sang tuổi
sau gọi là tằm dậy. Thời gian ngủ ở các tuổi từ 15-30 giờ tuỳ theo giống tằm và điều
kiện sinh thái. Thời gian ngủ tuổi 2 là ngắn nhất sau đó đến tuổi 1, tuổi 3 và tuổi 4
[12]. Lu
Nguyn Th Lan 19

Tằm chín: Ở tuổi 5, khi tằm đạt được sự tăng trưởng tối đa, trọng lượng cơ
thể tằm tăng 9000-10.000 lần so với lúc tằm mới nở. Tằm ngừng ăn dâu và chuẩn bị
cho quá trình nhả tơ kết kén gọi là tằm chín. Thời gian tuổi 5 kéo dài 5-6 ngày đối
với giống đa hệ và 7-9 ngày đối với giống lưng hệ và độc hệ. Biểu hiện của tằm
chín là: Tằm ngừng ăn lá dâu, thải phân mềm, ướt, thân tằm căng bóng (như lúc ngủ
ở các tuổi trước) và trở nên trong suốt, có màu trắng trong đối với giống kén trắng
và màu vàng ươm đối với giống kén vàng. Đầu tằm ngẩng cao, lắc qua lắc lại bên
phải bên trái theo động tác nhả tơ, tằm thường có xu hướng bò tản ra xung quanh để
tìm vị trí nhả tơ [12].
Thức ăn của tằm dâu
Thức ăn chủ yếu của tằm dâu là lá dâu có tên khoa học là Morus alba. Tuy
nhiên chúng cũng có thể ăn lá của bất kỳ cây nào thuộc chi dâu tằm (như Morus
rubra hay Morus negra) [12], [8].
Protein trong lá dâu là nguồn vật chất để con tằm tổng hợp nên sợi tơ, gần
70% protein trong thành phần sợi tơ được tổng hợp trực tiếp từ protein trong lá dâu

ở điều kiện ẩm độ cao, thông gió cần nhiệt độ thấp hơn [12].
 Độ ẩm
Độ ẩm tác động tới sinh trưởng, phát dục của tằm thông qua tác động trực
tiếp và tác động gián tiếp [12].
- Tác động trực tiếp: Ẩm độ ảnh hưởng tới mọi hoạt động sinh lý của tằm
như tiêu hoá, tuần hoàn, trao đổi chất … [12]
- Tác động gián tiếp: Ẩm độ quá cao là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn
phát triển, tăng nguy cơ phát sinh bệnh cho tằm. Ẩm độ quá thấp sẽ làm lá dâu
chóng héo, tằm ăn đói, cơ thể thoát hơi nước nhiều dẫn đến chóng suy nhược là môi
trường thuận lợi cho bệnh vi khuẩn phát triển [21].
 Không khí
Cũng như các động vật khác, tằm cần có không khí trong lành để thực hiện
các chức năng sinh lý. Trong phòng nuôi tằm, ngoài các thành phần khí O
2
và CO
2

còn tồn tại thêm một số loại khí khác như CO, NH
3
, SO
2
… sản sinh ra do quá trình
đốt than tăng nhiệt trong phòng tằm hay do sự lên men của phân tằm Những khí
này không có lợi cho quá trình sinh trưởng phát dục của tằm. Do vậy yêu cầu không
khí trong phòng tằm thường phải đảm bảo: CO
2
≤1,5%; CO ≤0,5%; SO
2
≤0,02%
[12].

trọng, nhất là ở các vùng nông thôn. Trồng dâu nuôi tằm đem lại hiệu quả kinh
tế cao hơn nhiều so với các cây trồng khác vì sản phẩm dâu tằm có giá trị cao, vòng
quay lứa tằm ngắn chỉ có khoảng 20 ngày. Đồng thời, cây dâu có thể trồng được ở
những vùng có điều kiện đất đai xấu và khí hậu khắc nghiệt mà vẫn sinh trưởng
phát triển tốt, cho sản lượng lá dâu cao và thu nhập từ cây dâu để nuôi tằm đem lại
thường cao hơn các cây trồng khác. Ở vùng nhiệt đới, trồng dâu nuôi tằm không chỉ Lu
Nguyn Th Lan 22

tạo ra thu nhập quanh năm mà nó còn giải quyết nhiều lao động nhàn dỗi tại nông
thôn. Mặt khác, trồng cây dâu còn làm tăng độ che phủ xanh trên các bãi đất trống
(đất hoang), tham gia vào điều hòa tiểu khí hậu môi trường vùng đó [21].
Hiện nay, trong nền sản xuất hàng hoá đang phát triển ở nước ta, trồng dâu
nuôi tằm không tồn tại độc lập mà liên kết với rất nhiều ngành kinh tế khác: Nông
nghiệp, công nghiệp, thương mại …đã đem lại nguồn thu ngân sách nhà nước lớn.
Sợi tơ tằm được tôn vinh là "Nữ hoàng" của ngành dệt may. Mặc dù, sản
lượng sợi tơ sản xuất ra thấp hơn nhiều so với các loại sợi khác như: bông, đay, gai,
sợi tổng hợp nhưng vẫn chiếm vị trí quan trọng trong ngành dệt. Lụa tơ tằm được
nhiều người ưa chuộng. Sợi tơ tằm có những đặc tính nổi trội: độ bóng, độ bền, độ
đàn hồi cao, quần áo chất liệu lụa tơ tằm vừa nhẹ lại vừa bền đẹp, mặc mùa đông thì
ấm áp, mặc mùa hè thì mát mẻ, thoải mái [20]. Ngoài ra, sợi tơ tằm ngày càng
khẳng định được vị thế của mình trên thị trường khi những ứng dụng của nó được
mở rộng trên nhiều lĩnh vực như làm chỉ dù, đồ trang sức.
Nhộng tằm chứa nhiều loại axit amin, trong đó có nhiều loại axit amin không
thay thế như valine, methionine, phenylalanine [20]. Nhộng tằm là một món ăn
ngon, giàu chất đạm, giá trị dinh dưng gấp 2 lần thịt, 4 lần so với trứng, 10 lần so
với sữa…do vậy giúp bồi bổ cơ thể. Trong ngài tằm đực có chứa hoocmon sinh dục
nam là methyltestosteron và có tác dụng ích tinh, bổ thận tráng dương nên là món

thể trong quần thể. Nghiên cứu đa hình phân tử dựa trên cơ sở các chỉ thị phân tử
(CTPT), so với các quan sát, nghiên cứu truyền thống - chủ yếu là các chỉ tiêu về
hình thái và một số chỉ tiêu sinh hoá, các CTPT có một số ưu điểm vượt trội:
- CTPT phản ánh mức độ biến động rất cao trong phân tử DNA, chính vì thế
nghiên cứu đa hình phân tử không cần phải gây đột biến.
- CTPT phản ánh trực tiếp kiểu gen, nó không phụ thuộc vào yếu tố môi
trường, mô và giai đoạn phát triển. Do vậy, các kỹ thuật phân tử chỉ cần lượng nhỏ
của bất kỳ loại mô nào, bất kỳ trạng thái, giai đoạn phát triển nào miễn là từ đó có
thể tách được một lượng nhỏ DNA đủ cho phân tích [1], [9].
Dưới đây là một số kỹ thuật phân tử thường được sử dụng trong nghiên cứu
đa hình: Lu
Nguyn Th Lan 24

1.4.1. Kỹ thuật PCR
Phương pháp PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và tiếp tục
được hoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất enzyme tổng hợp
DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus, cùng với đó là sự thiết kế thành
công các máy chu kỳ nhiệt cho phép nhanh chóng và chính xác nhiệt độ cho từng
giai đoạn phản ứng. Cho đến nay kỹ thuật PCR được xem như là một trong những
phương pháp nền quan trọng của công nghệ sinh học hiện đại [13].
 Các thành phần của phản ứng PCR bao gồm [13]:
- Enzyme chịu nhiệt, thường sử dụng là DNA Taq polymerase. Enzyme này có
hoạt tính tối đa ở 72
0
C và bền được với nhiệt độ.
- 4 loại dNTP là: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine (dATP, dTTP, dGTP,
dCTP).

C là nhiệt độ cho hoạt tính của enzyme
DNA Taq polymerase nhằm kéo dài các dNTP về phía đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt
cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt đầu cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai
bản sao và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA
đích đã nhân bản thành 2
30
đến 2
40
bản sao.
 Ƣu và nhƣợc điểm của phƣơng pháp PCR
- Ưu điểm: Thời gian thực hiện nhanh, sau 3 giờ có thể khuếch đại được một
trình tự đoạn gen đang quan tâm, thực hiện đơn giản và ít tốn kém, độ tinh sạch của
mẫu không cần cao,…
- Nhược điểm: Phải có mồi đặc hiệu cho đoạn DNA cần khuếch đại, xuất
hiện các băng phụ làm kết quả thiếu chính xác…
 Ứng dụng của kỹ thuật PCR
PCR có phạm vi ứng dụng rất rộng trong công nghệ sinh học hiện đại [13]:
- Trong nghiên cứu genome: Nhân bản phân tử bằng PCR, PCR tái tổ hợp,
kỹ thuật fingerprinting DNase I, multiplex PCR…
- Trong y học: Phát hiện tế bào T/virus gây ung thư máu, phát hiện virus
viêm gan B, phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết, phát hiện vi khuẩn
lao
1.4.2. Kỹ thuật RAPD
RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) – Là phương pháp phân
tích đa dạng DNA khuyếch đại ngẫu nhiên, kỹ thuật này được phát hiện vào năm
1990 (Welsh và McClelland; William và cs). Phương pháp RAPD thực chất là quá
trình nhân bản các đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi thiết kế ngẫu
nhiên (khoảng 10 nucleotide). Các mồi này sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên với
DNA khuôn ở vị trí bất kỳ nào mà tại đó có trình tự bổ sung với nó [17]. Các sản