Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN PHÚC NGHĨA ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC KÝ ĐIỆN DI MAO
QUẢN PHÂN TÍCH ACESULFAME-K,
SACCHARIN, ASPARTAME TRONG
ĐỒ UỐNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2011
Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng I: TỔNG QUAN 2
1.1.Giới thiệu về đường hóa học 2
1.1.1. Định nghĩa 2
1.1.2. Phân loại 2
1.1.3. Tác hại của đường hóa học 2
1.1.4. Tình hình sử dụng đường hóa học trong thực phẩm, đồ uống hiện nay 2
1.2. Đại cương về chất phân tích 4
1.2.1. Acesulfame-K 4
1.2.2. Aspartam 5
1.2.3. Saccharin 6
1.3. Tổng quan về các phương pháp phân tích Ac-k, Sac, As 7
1.3.1 Các phương pháp và xu hướng nghiên cứu trong nước 7
1.3.2 Các phương pháp trên thế giới 7
1.3.2.1. Phương pháp quang phổ UV – VIS 8
1.3.2.2. Các phương pháp HPLC 10
1.3.2.3. Phương pháp điện di mao quản 12
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1.Đối tượng, nội dung và mục tiêu nghiên cứu 14
2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 14
2.1.2. Nội dung nghiên cứu 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu 15
2.2.1. Phương pháp sử lý mẫu 15
2.2.2. Phương pháp sắc ký điện di mao quản 15
2.2.2.1. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản 15
2.2.2.2. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản 15
3.2 Thẩm định phương pháp 36
3.2.1. Tính chọn lọc Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Các chất cản trở gây ảnh hưởng 38
3.2.2.1. Ảnh hưởng của chất bảo quản 39
3.2.2.2. Ảnh hưởng của các loại đường 40
3.2.2.3. Ảnh hưởng của phẩm màu 42
3.2.3. Khảo sát lập đường chuẩn 44
Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
3.2.4. Giới hạn phát hiện LOD 47
3.2.5.Giới hạn định lượng LOQ 49
3.2.6. Khoảng tuyến tính 50
3.2.7. Đánh giá độ chính xác (độ đúng, độ chụm ) của phương pháp 50
3.2.8. Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 52
3.3. Phân tích mẫu thực tế 54
3.4. Bàn luận về qui trình rửa giải 61
KẾT LUẬN 63
KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65
PHỤ LỤC 69
CIEFC
Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ
6
Cyc
Cyclamate
7
CZE
Điện di mao quản vùng
8
EOF
Dòng điện di thẩm thấu
9
Fruc
Fructose
10
GEL-CEC
Sắc ký điện di mao quản gel (rây phân tử)
11
Glu
Glucose
12
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
13
IC
Sắc ký ion
14
LOD
giới hạn phát hiện
15
UV-VIS
Quang phổ hấp thụ phân tử
Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
MỤC LỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào các loại đệm 28
Bảng 3.2. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích píc của các chất vào giá trị pH 29
Bảng 3.3. Kết quả sự phụ thuộc của thời gian lưu của các chất chuẩn 31
vào nồng độ đệm borat 31
Bảng 3.4. Kết quả thời gian lưu của asp, sac, ace-k ở các nhiệt độ khác nhau 32
Bảng 3.5. Thời gian lưu của asp, sac, ace-k khi thay đổi điện thế 34
Bảng 3.6. Diện tích píc của asp, sac, ace-k ở các bước sóng khác nhau 35
Bảng 3.7. Kết quả thể hiện tính chọn lọc của phương pháp 38
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất bảo quản lên diện tích pic của Ace-K, Sac, Asp. 39
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của đường Glucose, Fructose, Cyclamate và Saccharose 40
lên diện tích pic của Ace-K, Sac, Asp 40
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của phẩm màu Tarta và Brill, Sunset và Qui 42
tới diện tích pic của Asp, Sac, Ace-K 42
Bảng 3.11. Sự phụ thuộc diện tích píc vào nồng độ Asp, Ace-K, Sac 44
Bảng 3.12. Giá trị phương sai và Ftính của Asp, Sac, Ace-K 47
Bảng 3.13. Giới hạn phát hiện (LOD) theo phương pháp lý thuyết tính theo 49
phương trình đường chuẩn 49
Bảng 3.14: Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 49
Bảng 3.15. Khoảng tuyến tính của Asp, Sac, Ace-K 50
Bảng 3.16. Sai số và độ lặp lại của phép đo tại các nồng độ khác nhau 51
Bảng 3.17. Diện tích píc của As, Sac, Ac-k ở các nồng độ khác nhau 53
Bảng 3.18. Kết quả độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 53
Hình 3.7. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện đệm borat 20 mM 31
( pH 9,5 và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, t =25oC, áp suất 50 mbar) 31
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa thời gian lưu 32
của asp, sac, ace-k vào nhiệt độ 32
Hình 3.9. Điện di đồ của hỗn hợp asp, sac, ace-k ở nhiệt độ 25oC trong điều kiện 33
( Đệm borat 20 mM, pH 95, và I=50 mA, V=25kV, L= 65 cm, áp suất 50 mbar) 33
Hình 3.10. Đồ thị biểu diện sự phụ thuộc giữa thời gian lưu 34
của asp, sac, ace-k vào điện thế 34
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích píc 35
của asp, sac, ace-k vào bước sóng 35
Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
Hình 3.12. Sắc đồ các chất chuẩn trong hỗn hợp ở bước sóng 215,5 nm 35
(L=65 cm, V=25kV, I=50mA, đệm borat 20mM, pH=9,5, t = 20oC, áp suất 50 mbar) 35
Hình 3.13. Điện di đồ của hỗn hợp 3 chất trong điều kiện điện di lựa chọn 36
(L=65cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) . 36
Hình 3.14. Điện di đồ về thời gian lưu của chuẩn đơn Aspartame (hình c), 37
Acesulfame-k (hình b), Saccharin( hình a) trong điều kiện (L=65cm, I=50 mA, V=25 kV,
áp suất 50 mbar, t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) 37
Hình 3.15. Điện di đồ khi thêm các yếu tố ảnh hưởng(axit benzoic 43,04 ppm, 43
axit sorbic 46,08 ppm, glucose 46,24 ppm, fructose 43,04 ppm, saccharose 41,80 ppm,
cyclamate 50 ppm, sunset yellow 67,52 ppm , brilliant 18,6 ppm, quilenol 57,12 ppm ,
tartarin 48,64 ppm ) trong điều kiện (L=54cm, I=50 mA, V=25 kV, áp suất 50 mbar, 43
t =25oC, đệm borat 20 mM, pH= 9,5 ) 43
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Asp 45
và đường chuẩn của Aspartame 45
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ Saccharin 45
và đường chuẩn của Saccharin 45
chủ yếu dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Ưu điểm của HPLC là độ
chính xác và độ lặp lại cao nhưng chi phí tốn kém và độc hại do sử dụng dung môi hữu
cơ. Thêm vào đó, các chất được khảo sát là các chất phân cực, nên việc phân tích bằng
HPLC trên thực tế gặp khá nhiều khó khăn.
Do đó, trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi đã chọn phương pháp điện di mao quản
để xác định đồng thời hàm lượng aspartame, acesulfame-k, và saccharin trong các loại đồ
uống. Phương pháp này có ưu điểm là thiết bị tương đối đơn giản, chi phí thấp và đặc biệt
có thể tích hợp với nhiều loại đetectơ khác nhau như đetectơ quang phổ hấp thụ phân tử
(UV-Vis), huỳnh quang, khối phổ, điện hóa (đo dòng, đo thế và đo độ dẫn), nên sẽ cho
khả năng nhận dạng và định lượng các chất một cách khá chọn lọc.
Nghiên cứu được chúng tôi tiến hành nhằm thực hiện 2 mục tiêu:
- Xây dựng, thẩm định phương pháp tách và định lượng đồng thời acesulfame-k,
saccharin, và aspartame - một số chất chất ngọt tổng hợp hay dùng trong đồ uống, nước
giải khát.
- Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để phân tích các chất khảo sát kể trên
trong một số sản phẩm đang lưu hành trên thị trường.
Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
Chƣơng I: TỔNG QUAN
1.1.Giới thiệu về đƣờng hóa học
1.1.1. Định nghĩa
Chất ngọt tổng hợp (hay còn gọi là đường hóa học, chất ngọt nhân tạo) là những
chất không có trong tự nhiên, vị ngọt rất cao so với đường sacarose (gấp khoảng 160-
1300 lần độ ngọt của đường sucrose) và không có giá trị dinh dưỡng, thường được sử
Aspartame khi va
̀
o cơ thê
̉
, bản thân nó không hấp thụ vào máu ma
̀
tan ra trong ruột
thành ba chất: aspartic acid (40%), phenylalanin (50%) và methanol (10%). Đây là cơ sở
của nhiều ý kiến về tác động bất lợi cho sức khỏe con người từ aspartam.
Saccharin khi đi vào cơ thể, nó không bị hấp thụ vào các bộ phận trong cơ thể mà
được thải hồi sau đó qua đường tiểu tiện. Do đó, có thể nói saccharin không tạo ra năng
lượng cho cơ thể và không ảnh hưởng đến lượng đường trong máu. Dùng nhiều lượng
saccharin có thể sinh ra chứng béo phì.
Acesulfame-K có thể gây nên một số biến chứng như : Đi tiểu thường xuyên, tiểu
gắt, nước tiểu đậm màu, ngứa ngáy, khó thở, tức ngực nếu dung hàm lượng nhiều.
Tại Hoa Kỳ, các loại đường aspartame, saccharin, dextrose, maltodextrin,
sucralose…đã được FDA chấp nhận, nhưng vẫn chưa có những kết quả nghiên cứu về
mức an toàn cũng như độ độc hại. Hiện nay tại VN chỉ có các chất tạo ngọt manitol,
acesulfam K, aspartam, isomalt, saccharin (và Na, K, Ca của nó), sorbitol và sirô sorbitol,
sucraloza được Bộ Y tế cho phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới hạn tối đa và
có qui định rõ ràng.
1.1.4. Tình hình sử dụng đƣờng hóa học trong thực phẩm, đồ uống hiện nay
Trong những năm gần đây, nền kinh tế của nước ta chuyển sang cơ chế thị trường.
Các loại thực phẩm sản xuất, chế biến trong nước và nước ngoài nhập vào Việt Nam ngày
càng nhiều chủng loại. Việc sử dụng các chất phụ gia trong sản xuất trở nên phổ biến. Các
loại phẩm màu, đường hóa học đang bị lạm dụng trong pha chế nước giải khác, sản xuất
bánh kẹo, chế biến thức ăn sẵn như thịt quay, giò chả, ô mai … Tình hình sản xuất thức
ăn, đồ uống giả, không đảm bảo chất lượng và không theo đúng thành phần nguyên liệu
cũng như quy trình công nghệ đã đăng ký với cơ quan quản lý đang là nỗi nhức nhối với
toàn xã hội. Chính vì nhờ độ ngọt cao, giá thành lại rẻ nên tại TP HCM, nhất là ở các
4
S
- Công thức cấu tạo:
N SO
2
OO
CH
3
K
- Độ tan ở 20
o
C: Ethanol là 1g/1000 ml ; Nước là 1g/3,7 ml.
- Tỷ trọng: 1,81 g/cm
3
- Nhiệt độ sôi: 225 °C
- Khối lượng mol phân tử: 242 g/mol
- Vị ngọt gấp 150 – 200 lần đường saccharose.
- Tuy nhiên nó có dư vị hơi đắng
Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
- Có dạng tinh thể màu trắng với cấu trúc hóa học tương tự saccharin.
- Ổn định hơn Aspartam ở nhiệt độ cao và môi trường acid.
Vai trò
Được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, dược phẩm nhằm tăng cường
vị và che dấu những vị khó chịu. Thường được dùng phối hợp với các chất ngọt tổng hợp
khác như Aspartam, Cyclamat. Không được chuyển hóa trong cơ thể và nhanh chóng đào
- Tỷ trọng: 1,347 g.cm-3
- Nhiệt độ sôi: 247 °C
- Khối lượng mol phân tử: 294,3 g/mol
- Không để lại dư vị khó chịu, không ổn định ở nhiệt độ và pH cao.
- Là một dipeptid, màu trắng, không mùi, vị ngọt mạnh (độ ngọt của nó cũng bằng
khoảng 180-200 lần độ ngọt của sucrose).
- Giống như các dipeptid khác, aspartam có chứa năng lượng khoảng 4 Kcal/g (17
Kj/g). Tuy nhiên, chỉ cần một lượng rất nhỏ aspartam đã tạo ra độ ngọt cần thiết. Do đó
năng lượng chúng ta đưa vào cơ thể sẽ không đáng kể.
Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
- Vị ngọt của nó chúng ta cảm nhận được chậm hơn và kéo dài lâu hơn so với
đường.
- Phân hủy dần trong nước nên nước ngọt có aspartam không giữ được lâu. Cho
trộn aspartam với saccharin hoặc acesulfam K thì hỗn hợp ngọt hơn và ổn định hơn khi
hai chất đứng riêng một mình.
Vai trò
Được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, dược phẩm, bánh kẹo…
nhằm tăng cường vị ngọt và che dấu những vị khó chịu. Thường được dùng phối hợp với
các chất ngọt tổng hợp khác như Acesulfam K, Cyclamat. Là một chất không độc song
các dạng chuyển hóa của nó lại độc như: Axit Aspartic , phenylalanine.
1.2.3. Saccharin
Tính chất
-Tên IUPAC: 1,1-Dioxo-1,2-benzothiazol-3-one
- Công thức hóa học: C
7
H
5
Được sử dụng để tạo vị ngọt hoặc che dấu mùi vị trong thức ăn, đồ uống, kem
đánh răng, nước súc miệng. Nó thường được sử dụng ở nồng độ 0,02-0,5% (KL/KL).
Phản ứng bất lợi do saccharin đã được ghi nhận: mề đay, nhạy cảm với ánh sáng. Hàng
ngày không nên đưa vào cơ thể một lượng Saccharin dưới dạng muối (Natri, kali) lớn hơn
5 mg/kg trọng lượng.
1.3. Tổng quan về các phƣơng pháp phân tích Ac-k, Sac, As
1.3.1 Các phƣơng pháp và xu hƣớng nghiên cứu trong nƣớc
Hiện nay, tùy thuộc vào điều kiện cơ sở vật chất mà các phòng thí nghiệm có thể
tiến hành phân tích đối tượng nghiên cứu theo các phương pháp khác nhau. Một số
phương pháp phổ biến có thể kể đến như quang phổ hấp phụ phân tử UV-VIS, sắc ký
lỏng hiệu năng cao HPLC, điện di mao quản vùng CZE. Trong đó phương pháp quang
phổ UV-VIS tuy có thể dùng để định lượng riêng các chất, nhưng có nhược điểm là khó
phân biệt phổ của chất khi có lẫn các chất cản trở như : chất bảo quản, phẩm màu, các loại
đường…, nên hiện nay ít được sử dụng. HPLC với những ưu điểm của nó như khả năng
tách chất, độ chính xác cao, độ lặp lại tốt thường được sử dụng để phân tích các chất ngọt
tổng hợp nói chung và nhóm chất khảo sát nói riêng.
Sử dụng kỹ thuật điện di mao quản để phân tích các chất ngọt tổng hợp đang có xu
hướng phát triển ở nước ta trong những năm gần đây. Với ưu điểm là tiết kiệm, ít độc hại,
trong khi vẫn đảm bảo được độ chính xác và tính chọn lọc cao, nên nó ngày càng nhận
được sự quan tâm nghiên cứu nhằm thay thế cho HPLC
1.3.2 Các phƣơng pháp trên thế giới
Như đã nói, HPLC và điện di mao quản là hai kỹ thuật phân tích phù hợp cho việc
xác định đồng thời hỗn hợp các đường hóa học kể trên, và đã được sử dụng rộng rãi trên
Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
thế giới. Vậy nên trong mục này, chúng tôi chỉ đề cập tới những công trình nghiên cứu
tiêu biểu đã được triển khai trên các hệ thống này.
1.3.2.1. Phƣơng pháp quang phổ UV – VIS
Loại bỏ CO
2
của nước giải khát bằng cách lắc liên tục và đổ nhanh từ cốc này sang cốc
khác, lặp đi lặp lại nhiều lần. Chuyển 10 ml mẫu đến bình tách lỏng125 ml có khoá
Teflon. Thêm 15 ml nước và 0,5 ml NaOH 1N. Trích ly với 50ml hỗn hợp benzen
chloroform. Để cho tách lớp và loại bỏ các lớp dung môi (axit benzoic và benzoates
không ảnh hưởng). Kẹo ngọt và chất lỏng cô đặc: Nghiền 10-20 viên kẹo thành bột mịn.
Cân chính xác 0,5 gram bột hoặc hút 10 ml mẫu chất lỏng cô đặc vào bình định mức 500
ml và pha loãng đến vạch định mức bằng nước cất. Lấy 10-15 ml dung dịch đem phân
Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
tích. Nếu chất lỏng cô đặc chứa chất bảo quản parabens, thì axit hóa bằng cách thêm 5 ml
HCl và trích ly với 20 ml CCl
4
. Loại bỏ CCl
4
và tiến hành như trong phần “cách xác định”
bắt đầu từ "trích ly bằng cách lắc 1 phút mỗi lần".
Cách xác định: Chuyển dich lọc của mẫu đã chuẩn bị, dung dịch chuẩn (1-3 mg
saccharin) đã làm ở trên vào bình tách lỏng. Thêm 5 ml HCl và trích ly bằng cách lắc một
phút. Mỗi lần với 50, 30 và 20 ml hỗn hợp dung môi chloroform – benzen (95 +5) hoặc
với ether: benzen (95 +5) theo quy định trong mẫu chuẩn bị. Lọc dung dịch này qua phễu
vào bình định mức 100 ml. Pha loãng đến vạch định mức với hỗn hợp dung môi được sử
dụng ở trên và lắc đều. Sau đó chuyển 20 ml vào bình tam giác 50 ml. Bay hơi dung môi
đến khô trong chậu nước nóng và làm khô hoàn toàn trong lò 100 ºC trong 20 phút. Dùng
pipet hút 1 - 5 ml phenol nóng chảy vào bình tam giác và lắc cho đến khi hỗn hợp sau bay
hơi hòa tan. Thêm 1,2 ml H
2
phương pháp hiệu chuẩn đa biến, có thể được sử dụng để xác định chất ngọt nhân tạo.
Natalia E. Llamas và đồng nghiệp [31], đã sử dụng phương pháp này để xác định
saccharin và acesulfame-K. Giới hạn phát hiện là 2-15 mg.L-1 đối với saccharin,
acesulfame-K là 2-20 mg.L-1 và 2-25 mg.L-1 đối với aspartame. Hiện nay aspartame
thường có mặt ở trong mẫu thực phẩm. Vì vậy phương pháp này đã được áp dụng thành
công để xác định đồng thời saccharin và acesulfame-K trong các chất ngọt và nước trái
cây mà không cần các bước loại bỏ aspartame.
Một phương pháp mới để xác định hỗn hợp của hai chất làm ngọt thương mại là
aspartam và acesulfame-K, phương pháp đã kết hợp các tiêu chuẩn đã được sử dụng để
hiệu chỉnh trong ma trận tập trung. Axit salicylic đã được sử dụng như là chuẩn nội để
đánh giá việc điều chỉnh các mẫu thực sự trong mô hình PLS-2. Mô hình này thu được từ
việc đo độ hấp thụ quang của chất trong vùng tử ngoại, nồng độ các chất phân tích trong
các mẫu thương mại được phát hiện thông qua detecter huỳnh quang. Phương pháp PLS-2
đã được đánh giá và kiểm định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng (HPLC), sai số
tương đối giữa PLS-2 và các phương pháp HPLC ít hơn 10%. Hiệu suất thu hồi trong các
mẫu thực tế là 99,2%, độ lệch chuẩn là 3,2%. Phương pháp đã được áp dụng để xác định
hỗn hợp aspartam và acesulfame-K trong các chất làm ngọt nhân tạo.[12]
1.3.2.2. Các phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Ở các nước có nền khoa học kỹ thuật phát triển thì việc áp dụng HPLC để định
lượng các chất ngọt tổng hợp (trong đó có nhóm chất khảo sát) đã được tiến hành từ lâu.
Có thể kể đến một số công trình tiêu biểu của các tác giả sau:
Xác định đồng thời 9 chất ngọt nhân tạo có nồng độ cao trong thực phẩm
(acesulfame-K, alitame, aspartame, axit cyclamic, dulcin, neotame, neohesperidine
dihydrochalcone, saccharin và sucralose) bằng HPLC của các tác giả Andrzej Wasik,
Josephine McCourt, Manuela Buchgraber. Phương pháp có độ chính xác khá tốt với hiệu
suất thu hồi trong khoảng 93 ÷ 109%, LOD dưới 15μg.g
−1
và giá trị LOQ dưới 30 μg.g
−1
,
Hiệu suất thu hồi trong khoảng 97,96 ÷ 105,42%.
Ji C. và các đồng nghiệp của ông đã dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu suất
(UPLC) để tách và xác định đồng thời bốn chất ngọt tổng hợp (natri saccharin, aspartame,
acesulfame và neotame) trong một loại thuốc tiêm [24]. Quá trình tách được thực hiện
trên cột ACQUITY UPLC C18 (Beh) với chương trình gradient cho pha động và phát
hiện ở bước sóng chung là 220 nm. Hiệu suất thu hồi trung bình trong các mẫu là 80,5% -
95,2%, với độ lệch chuẩn tương đối RSD là trong khoảng 0,50% - 8,7%. Phương pháp
này cũng đã được áp dụng trong việc xác định các chất ngọt nhân tạo trong đồ uống và
sữa bột.
Xác định đồng thời chất ngọt phi dinh dưỡng trong thực phẩm bằng phương pháp
HPLC / ESI-MS (công trình nghiên cứu do Da-jin Yang và Bo Chen thuộc Phòng thí
Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
nghiệm Hóa chất Sinh học và Nghiên cứu Y học cổ truyền Trung Quốc công bố năm
2008) [20]. Chất ngọt phi dinh dưỡng là các chất có calo thấp, được sử dụng để thay thế
đường và những chất khác. Xác định các chất ngọt trong thực phẩm là rất quan trọng để
đảm bảo chất lượng sản phẩm. Trong nghiên cứu này, bảy loại đường nhân tạo là
(aspartame, saccharin, acesulfame-K, neotame, sucralose, đường hoá học, và alitame) và
một chất ngọt tự nhiên (steviosid) đã được xác định đồng thời trong các loại thực phẩm
khác nhau bằng cách sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với (ESI-MS).
Các hợp chất cần xác định đã được định lượng bằng cách sử dụng một bộ phận ghi nhận
phát hiện các mảnh ion hóa có chọn lọc (SIR) tại m / z = 178; 397; 377; 293; 641; 312,
162 và 182, với natri warfarin (SIR m / z = 307) được sử dụng làm chất chuẩn nội. Các hệ
số tương quan của đường cong hiệu chuẩn tốt hơn so với r =0,998 (n = 6), trong khoảng
0,05-5 μg / ml cho đường hoá học, 0,3-30 μg / ml cho sucralose, 0,1-10 μg / ml cho
neotame, 0,2 đến 20 μg / ml cho aspartame, 0,5-15 μg / ml cho steviosid, 0,08-8 μg / ml
cho alitame, 0,1-15 μg / ml cho acesulfame-K, và 0,05-5 μg / ml cho saccharin. Giới hạn
phát hiện (LOD) thu được dưới 0,1 μg / ml, trong khi giới hạn định lượng (LOQ) là dưới
cùng với các chất bảo quản (propyl-, ethyl, và methyl), sorbic acid và acid benzoic. Điều
kiện điện di được thực hiện ở 25°c,bằng cách sử dụng dung dịch đệm natri tetraborat 20
mM ở pH 9,4 với thể 20 KV. Độ lặp lại về nồng độ với tất cả các chất cho RSD < 0,15%
và thời gian lưu cho RSD từ 1 đến 7 % (9% đối với phenylalanine).[32]
Phương pháp xác định đồng thời các chất làm ngọt, chất bảo quản trong trái cây
bằng sắc ký điện động học Micellar (MEKC) của các tác giả Lin, Yu Chou, Shin S, Sheu,
Fuu Shyu, Yuan T [26]. Các chất ngọt nhân tạo dulcin, aspartam, saccharin, và
acesulfame-K và các chất bảo quản axit sorbic, axit benzoic, dehydroacetate natri và
methyl-, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, và isobutyl-p-hydroxybenzoate trong trái cây đã
được phân tách bằng phương pháp điện động học Micellar. Quá trình tách được thực hiện
bằng cách sử dụng cột mao quản silica 57 cm với một bộ đệm bao gồm dung dịch
deoxycholate 0.05M, đệm borate, phosphate 0.02M (pH 8,6), và acetonitrile 5%, bước
sóng chung để phát hiện là 214 nm. Hiệu suất thu hồi trung bình cho tất cả các chất ngọt
và chất bảo quản khoảng 90% với độ lặp lại tốt, và các giới hạn phát hiện khoảng từ 10
đến 25 mg/g. Năm mươi mẫu trái cây bảo quản đã được sử dụng cho mục đích phân tích.
Các chất ngọt nhân tạo và chất bảo quản được tìm thấy trong 28 mẫu là aspartame (0,17-
11,59 g / kg) hoặc saccharin (0,09-5,64 g / kg), benzoic acid (0,02-1,72 g / kg) và axit
sorbic (0,27-1,15 g / kg). Luận văn thạc sỹ Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Trần Phúc Nghĩa Trường ĐHKH Tự nhiên
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Đối tƣợng, nội dung và mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp sử lý mẫu
Đối với mẫu phân tích trong luận văn này là các loại đồ uống ở dạng lỏng, có nền
mẫu không phức tạp lắm do đó phương pháp xử lý mẫu tương đối đơn giản. Các mẫu có
cặn như nước cam, nước yến… đem ly tâm lọai bỏ cặn. Với các mẫu có ga tiến hành loại
bỏ hết bọt khí nhiều lần sau đó tiến hành rung siêu âm khoảng 30 phút đối với các mẫu và
lọc bằng màng lọc 0,2μm trước khi tiến hành chạy điện di.
2.2.2. Phƣơng pháp sắc ký điện di mao quản
2.2.2.1. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản
Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất Dựa trên sự di chuyển khác
nhau của các phần tử chất tan trong mao quản (đường kính 25-100μm) trên nền của dung
dịch chất điện giải có pH thích hợp, dưới tác dụng của điện trường nhất định được cung
cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (15-40 kV) đặt vào hai đầu mao quản.[7]
2.2.2.2. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản
Sơ đồ hệ thống điện di được trình bày ở hình 2.1
Quá trình điện di được thực hiện trên mao quản silica dài 25-100cm, đường kính
trong 25 – 100 µm, đường kính ngoài 300 – 400 µm. Sử dụng áp suất để đưa dung dịch
mẫu và dung dịch đệm lên mao quản, điện thế một chiều đặt vào hai đầu mao quản tạo ra
quá trình tách: các chất phân tích được phát hiện nhờ một detector thích hợp khi di
chuyển về một đầu mao quản.[6]
Detector hay dùng nhất là detector UV hay detector mảng diot DAD. Vị trí phát
hiện nằm ngay trên mao quản gọi là “cửa sổ”.
cực/không phân cực hạt mixen trong dung dịch và linh độ của chất.
4. Sắc ký điện di mao quản gel (rây phân tử), (Capillary Gel Electrophoresis
Chromatography: Gel-CEC), cơ chế tách là dựa vào linh độ của chất và tương tác các loại
cỡ hạt với hạt gel.
5. Sắc ký điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing
Chromatography: CIEFC).
6. Sắc ký điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis
Chromatography: CITPC).
Copyright: Tài liệu đại học ©