MỞ ĐẦU
Từ lâu, bưởi Thanh trà là một trong số các trái cây đặc sản có giá trị của Thừa
Thiên Huế, nổi tiếng với hương vị thơm ngon đặc biệt của chúng. Tuy nhiên, ngay tại
đây, bưởi Thanh trà được trồng ở các vùng khác nhau cũng có chất lượng khác nhau.
Đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu trên đối tượng Thanh trà nhưng chủ yếu
tập trung điều tra về phân bố [1], [2]; đánh giá thực trạng sản xuất [7]; các quá trình
dinh dưỡng khoáng cũng như sử dụng phân bón cho Thanh trà [19], [29], [30];
nghiên cứu các tác nhân gây bệnh [14], [21]; nghiên cứu nhân giống [5] chứ chưa
có những nghiên cứu về mối quan hệ cũng như sự đa dạng về mặt di truyền của quần
thể bưởi Thanh trà.
Bưởi Thanh trà ở Thừa Thiên Huế nói chung và Huế nói riêng là loại trái cây
đặc sản được người tiêu dùng nhiều nơi trong nước ưa chuộng, nhưng hiện nay sản
lượng Thanh trà vẫn còn thấp. Do trồng trọt lâu đời, do các đột biến tự nhiên và các
quá trình lai tạo diễn ra trong một thời gian dài nên độ đồng nhất của giống cũng
giảm đi, có nhiều dạng kiểu hình mới xuất hiện. Nghiên cứu về sự đa dạng di truyền
của quần thể bưởi Thanh trà ở đây là cơ sở để chọn lọc và bảo quản các giống gốc,
tạo tiền đề cho việc nhân giống với số lượng lớn sau này.
Các kỹ thuật sinh học phân tử là công cụ hữu hiệu, đã được ứng dụng rất
rộng rãi để phân tích tính đa dạng di truyền cũng như xác định mối quan hệ họ hàng
giữa các loài với nhau.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu
tính đa dạng di truyền của quần thể bưởi Thanh trà (Citrus grandis (L.)
Osbeck) ở thành phố Huế" làm cơ sở cho việc chọn giống Thanh trà sau này.
1
Chương 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây bưởi và cây bưởi Thanh trà
1.1.1. Cây bưởi
Những ghi nhận lịch sử và phân tích di truyền có thể kết luận chỉ có 3 loài
thực sự trong chi Citrus (thanh yên, quýt và bưởi) và nhiều dạng sinh học dưới loài.
Cam, chanh, chanh cốm, bưởi chùm mặc dù được thừa nhận rộng rãi nhưng chúng
tại phổ biến nữa. Nếu có một số loài mọc hoang gần gũi với chi Citrus thì chúng
cũng không có quan hệ trực tiếp về mặt di truyền với những loài đang được trồng.
Bưởi được trồng trên khắp thế giới, ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, những
nơi mà mùa đông có nhiệt độ ôn hòa, cây có thể sống sót và có đủ nước để sinh
trưởng, phát triển (Gmitter và cs, 1992). Chất lượng quả bưởi tốt nhất là ở các vùng
cận nhiệt đới. Các vùng trồng Citrus phổ biến nhất là châu Mỹ (Brazil, Mỹ,
Argentina và Mexico), lưu vực Địa Trung Hải (Nam Âu, Tây Nam Á, Bắc Phi),
châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản) và Nam Phi. Theo FAO, sản lượng bưởi
và bưởi chùm trên thế giới là 4 triệu tấn, được trồng ở 74 quốc gia với diện tích là
264.000 ha. Mỹ là nước có sản lượng bưởi và bưởi chùm lớn nhất thế giới. Vùng
Đông Nam Á, đặc biệt là Đông Ấn Độ, Bắc Burma và Tây Nam Trung Quốc được
xem là trung tâm phát sinh và đa dạng của chi Citrus và những chi có quan hệ gần
gũi với nó. Tổng sản lượng quả của chi Citrus toàn cầu trong thời gian 2004-2005 là
105,5 triệu tấn [8], [46].
Bưởi là loài cây ăn quả đặc sản của nước ta, được trồng phổ biến từ Bắc đến
Nam, từ đồng bằng, trung du đến miền núi. Ở nước ta từ lâu đã hình thành những
vùng trồng bưởi và những giống bưởi nổi tiếng như bưởi Đoan Hùng (Phú Thọ),
bưởi đường Hương Sơn (Hương Sơn, Hà Tĩnh), bưởi Phúc Trạch (Hương Khê, Hà
Tĩnh), bưởi Thanh trà (Thừa Thiên Huế), bưởi Biên Hòa (Đồng Nai), bưởi Năm roi,
bưởi Da xanh (Vĩnh Long) [2].
3
Bưởi có nhiều giá trị về mặt y học đồng thời là thực phẩm ăn kiêng tốt cho
nhiều loại bệnh. Bưởi có thể được sử dụng trực tiếp hay chế biến thành nhiều món ăn
khác nhau như các loại mứt, bánh kẹo, gỏi và nước uống. Về thành phần dinh dưỡng,
trong 100 g phần ăn được của bưởi chứa 90,3 g nước; 0,3 g chất khoáng; 38 kcal; 0,5 g
protein; 0,3 g chất béo; 8,5 g carbohydrate; 37 mg calcium; 0,2 mg sắt; 120 μg
carotene; 0,06 mg vitamin B1; 0,04 mg vitamin B2 và 105 mg vitamin C [36]. Tuy
nhiên, các thành phần dinh dưỡng của bưởi theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ có hơi khác
(Bảng 1.1).
Thành phần chủ yếu của tinh dầu lá bưởi là dipenten, linalola và citrala.
Magnesium 6 mg
Phosphorus 17 mg
Potassium 216 mg
Sodium 1 mg
Kẽm 0,08 mg
Đồng 0,048 mg
Mangan 0,017 mg
Vitamin
Vitamin C 61,0 mg
Thiamin 0,034 mg
Riboflavin 0,027 mg
Niacin 0,220 mg
Vitamin B-6 0,036 mg
Vitamin A, IU 8 IU
Cholesterol 0 mg
Thành phần khác
β-Carotene 0 µg
α-Carotene 0 µg
β-Cryptoxanthin 10 µg
Nguồn: United States Department of Agriculture(USDA), 2004
1.1.2. Cây bưởi Thanh trà
Bưởi Thanh trà (Citrus grandis (L.) Osbeck) là loài cây ăn quả đặc sản, có
giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao của Thừa Thiên Huế. Bưởi Thanh trà đã được
trồng ở Huế từ rất lâu. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa khẳng định được cây bưởi
Thanh trà được trồng ở Huế khi nào. Theo thông tin điều tra được từ người dân thì
bưởi Thanh trà được trồng ở đây ít nhất cũng đã gần hai trăm năm. Đây là loại
bưởi thơm ngon, có hương vị và phẩm vị đặc biệt nên được người tiêu dùng rất ưa
5
chuộng, trước đây được trồng để phục vụ riêng cho giới quý tộc trong thời phong
kiến. Ngày nay, đã được trồng khá phổ biến để phục vụ người dân và khách du
Hương Vân (Hương Trà), Quảng Thọ, Quảng Phú (Quảng Điền), Phong Sơn, Phong
An (Phong Điền) với diện tích 174 ha, chiếm khoảng 28% tổng diện tích. Ven sông
Ô Lâu như ở Phong Thu, Phong Hòa, thị trấn Phong Điền, Phong Mỹ (Phong Điền)
có diện tích 112 ha, chiếm khoảng 18%. Phần còn lại, Thanh trà được trồng ven
sông Truồi ở Lộc Điền và Lộc Hòa (Phú Lộc) với diện tích khoảng 16,5 ha (2,6%).
Ngoài ra, Thanh trà còn được trồng rải rác ở một số nơi khác như Lộc An, Lộc
Thủy (Phú Lộc) và Hương Hòa (Nam Đông) [2].
Bưởi Thanh trà là loại trái cây cao cấp được người tiêu dùng nhiều nơi trong
nước ưa chuộng, nhưng hiện nay sản lượng vẫn còn thấp. Việc phát triển mở rộng
diện tích trồng bưởi Thanh trà thành vùng sản xuất hàng hóa lớn theo định hướng
của tỉnh còn gặp nhiều khó khăn, tốc độ phát triển hàng năm chậm. Nguyên nhân
của vấn đề này là do các hộ nông dân còn thiếu vốn đầu tư để mở rộng diện tích,
bên cạnh đó do không được đầu tư đúng mức, do ảnh hưởng nặng nề của thiên tai,
dịch hại nên giống bưởi này đã có biểu hiện thoái hóa, năng suất và phẩm chất
giảm sút [7]. Ngoài ra, do trồng trọt lâu đời, do các đột biến tự nhiên và các quá
trình lai tạo diễn ra trong một khoảng thời gian dài nên độ đồng nhất của giống
giảm, có nhiều dạng kiểu hình mới xuất hiện, tạo cho bưởi Thanh trà trồng ở các
vùng khác nhau có những đặc điểm không giống nhau.
1.2. Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di
truyền chi Citrus
Trong xu hướng hiện nay, để chọn giống cây trồng hay xác định nguồn gốc
của các loài cây trồng người ta thường sử dụng các chỉ thị phân tử (molecular
marker). Việc sử dụng các chỉ thị phân tử sẽ cho kết quả có độ chính xác cao, tiết
kiệm thời gian do các đặc điểm phân tử thường độc lập với các đặc điểm hình thái,
không chịu tác động của môi trường. Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử là
một công cụ đắc lực để phân tích tính đa dạng di truyền của rất nhiều loài.
7
Gần đây, các phân tích phân tử như trình tự các đoạn nucleotide lặp lại ngắn
(microsatellite), các đoạn lặp lại đơn giản (SSR), kết hợp SSR và microsatellite
(ISSR), đa hình chiều dài các đoạn cắt hạn chế (RFLP), đa hình các đoạn khuếch
o
) và kiểu gen (H
EP
) nhưng sự khác biệt giữa các nhóm không có ý nghĩa
thống kê. Việc nhận dạng bằng 3 loại chỉ thị phân tử dễ dàng đối với nhóm hạt mài,
chưa khác biệt rõ giữa nhóm hạt to và nhóm không hạt [25].
Vũ Thị Nhuận và cs (2005) đã nghiên cứu đa dạng di truyền của 146 cây
bưởi Năm roi ở xã Mỹ Hòa, Bình Minh, Vĩnh Long bằng phương pháp RAPD. Kết
quả nghiên cứu cho thấy 4 trong 7 primer được chọn để phát hiện các chỉ thị phân
tử cho kết quả tốt ở tất cả các cây trên. Tập đoàn bưởi ở đây được chia làm 6 nhóm,
trong đó có 5 nhóm giống nhau nhiều và 1 nhóm khác hẳn. Khoảng cách di truyền
của tập đoàn này thay đổi từ 0 đến 36%. Trong tổng số 56 chỉ thị RAPD có 8 chỉ thị
hiện diện ở tất cả các cây, 1 chỉ thị có tần số thấp nhất (chỉ có 3 cây) và 3 chỉ thị
hiện diện ở 4 cây. Kết quả nghiên cứu này cho thấy tập đoàn bưởi ở Mỹ Hòa rất đa
dạng về mặt di truyền mặc dù chúng có sự tương đồng cao về mặt hình thái và sinh
trưởng [20].
Để đánh giá nguồn vật liệu di truyền, Nguyen Thanh Nhan và cs (2003) đã
phát triển kỹ thuật RAPD nhằm xác định đặc tính và phát hiện đa hình của các
giống quýt và cam thương mại và truyền thống ở Việt Nam, cũng như đã điều tra
mối quan hệ di truyền ở 37 giống của các loài khác nhau trong chi Citrus. Tác giả
đã sử dụng 150 primer để kiểm tra, trong đó có 15 primer tạo sản phẩm khuếch đại
có độ đa hình cao ở 15 giống quýt và 11 thể lai được chọn lọc. Sử dụng chỉ thị
RAPD trong xác định các loài cam chanh giúp hiểu biết tốt hơn về các biến dị di
truyền, đánh giá biến dị di truyền của chúng so với các loài khác, ứng dụng các
loài cam chanh và các thể lai có liên quan trong nhân giống các cây giống hay
giống gốc [57].
Tính đa dạng sinh học của các loài cây có múi ở Gò Quao (Kiên Giang) đã
được Nguyễn Hữu Hiệp và cs (2004) nghiên cứu dựa vào các đặc điểm hình thái và
phân tử. Các đặc điểm về hình thái học cho thấy cây có múi tại Gò Quao, Kiên
9
nghiên cứu (Ellisiario và cs, 1999; Federici và cs, 1998; Hussein và cs, 2004; Hao
và cs, 2004; Yahata và cs, 2005 ) [43], [44], [49], [50], [63].
Bản đồ di truyền dựa trên các chỉ thị RAPD của chi Citrus đã được Cai và cs
thực hiện năm 1994. Sự đa hình của các đoạn DNA khuếch đại được quan sát thấy ở
gần một nữa trong tổng số 140 primer ngẫu nhiên được sử dụng, thể hiện cho 266
locus khác nhau. Việc xác định các nhóm liên kết được thực hiện trên 60 cây của
quần thể BC
1
có nguồn gốc từ lai tự nhiên C. grandis (L.) Osb.×[C. grandis (L.)
Osb.×Poncirus trifoliata (L.) Raf.] (Durham và cs, 1992). Phần lõi của bản đồ liên
kết được xây dựng bao gồm 9 nhóm liên kết chứa 109 chỉ thị RAPD cùng với 51 chỉ
thị AFLP và isozyme từ các công trình nghiên cứu trước đó. Bảy mươi chín chỉ thị
khác không được sắp xếp một cách rõ ràng vì các allele của chúng có liên quan đến
các nhóm liên kết cụ thể và có mối quan hệ đến phần lõi. Phần lõi của bản đồ có
tổng chiều dài là 1,192 cM với khoảng cách trung bình giữa các locus là 7,5 cM và
chiếm khoảng 70-80% của genome [38].
Machado và cs (1996) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá sự đa hình và
độ tương đồng di truyền cho 39 kiểu gen của quýt Địa Trung Hải. Kết quả khuếch
đại bằng 21 primer ngẫu nhiên thu được 111 băng, trung bình xuất hiện 2,2 chỉ thị
RAPD cho mỗi primer, tương đương với 42% số băng xuất hiện. Các chỉ thị đặc
hiệu kiểu gen cũng được tìm thấy, chủ yếu cho các dạng lai đã biết. Phân tích cây
phả hệ UPGMA cho thấy ít có sự khác nhau về mặt di truyền giữa các mẫu quýt Địa
Trung Hải, trong khi đó sự khác nhau giữa các dạng lai với các loài trong chi Citrus
nhiều hơn. Hai mươi mẫu quýt cho năng suất như nhau, sự đa hình về mặt di truyền
xác định bằng kỹ thuật RAPD cho thấy sự khác nhau giữa các mẫu là khá thấp, như
vậy có thể chúng là một dòng đơn. Với số lượng dạng lai lớn cùng với sự đa hình
giữa các mẫu thấp có thể khẳng định giả thuyết rằng tất cả quýt Địa Trung Hải là
dạng lai của loài quýt phổ biến Citrus reticulata Blanco [55].
Để nghiên cứu sự tương đồng di truyền trên 35 mẫu quýt, bao gồm 10 loài và
7 dạng lai, Filho và cs (1998) đã sử dụng 23 primer (22 primer chứa 10 nucleotide
4 giống cam ngọt (C. sinensis Osbeck), 4 giống quýt (C. reticulata Blanco, C.
nobilis Loureiro, C. sunki Loureiro và C. deliciosa Tenore), cam chua (C.
aurantium L.), bưởi chùm (C. paradisi Marcf.), bưởi (C. grandis Osbeck), thanh
yên (C. medica L.), chanh cốm (C. latifolia) và 2 dạng lai [C. clementina T.×(C.
tangerina T.×C. paradisi Macf.)]. Sự tương đồng di truyền của 15 giống này được
12
quan sát từ 12 primer ngẫu nhiên, độ tương đồng di truyền giữa các giống quýt thấp
nhất là 0,81. Độ tương đồng thấp hơn thấy ở các loài ít quan hệ là C. medica, C.
grandis và C. latifolia. Bốn giống cam ngọt (C. sinensis Osbeck) không có sự khác
nhau dựa vào chỉ thị RAPD, chúng có độ tương đồng cao nhất [36].
Đa dạng di truyền của 38 mẫu bưởi chùm (Citrus paradisi Macf.) và 3 mẫu
bưởi (C. maxima (Burm.) Merr.) đã được Corazza-Nunes và cs (2002) thực hiện
dựa trên kỹ thuật SSR và RAPD. Khoảng 49% trong tổng số 198 chỉ thị RAPD thể
hiện sự đa hình và 4,6 allele/SSR locus đã được xác định. Giá trị hàm lượng thông
tin đa dạng (PIC-polymorphism information content) thay đổi từ 0,093 đến 0,450.
Cây phả hệ UPGMA được xây dựng và hai nhóm bưởi chùm chính cũng đã được
xác định. Mẫu bưởi “do Cabo” và “Siamesa-Filipinas” có mối quan hệ rất gần với
bưởi ở nhóm A. Nhóm B có 3 phân nhóm, chứa hầu hết các mẫu bưởi chùm còn lại.
Các mẫu bưởi chùm chính có sự tương đồng di truyền cao chứng tỏ sự đa dạng về
kiểu hình quan sát được trong nhóm phải có nguồn gốc từ các đột biến soma và
không xác định được bằng các chỉ thị phân tử [41].
De Oliveira và cs (2003) đánh giá quá trình chọn lọc trong quần thể lai
Citrus bằng phân tích RAPD. Sự phân ly của 123 chỉ thị phân tử giữa quýt Cravo
(Citrus reticulata Blanco) và cam Pêra (C. sinensis (L.) Osbeck) được phân tích từ
94 con lai F1. Thành phần di truyền, sự đa dạng, tính dị hợp tử, sự khác nhau trong
cấu trúc nhiễm sắc thể và sự hiện diện của các gen lặn có hại được xác định dựa trên
tỷ lệ phân ly khi quan sát. Một tỷ lệ lớn chỉ thị phân tử có sự sai khác so với tỷ lệ
phân ly 1:1. Nhiều chỉ thị cho kết quả phân ly theo tỷ lệ 3:1 ở cả 2 giống và 1:3 ở
cam Pêra, có lẽ là do quá trình chọn lọc trực tiếp [42].
Cevík và cs (2006) đã xây dựng bản đồ di truyền liên kết của chi Citrus bằng kỹ
primer RAPD sử dụng, chỉ có 3 primer (chiếm 15%) là các primer cho các băng đa
hình. Ba primer OPA10, P615 và P650 đã tạo ra tổng số 123 băng DNA với trung
bình đạt 0,8; 1,7 và 3,8 băng DNA trên mỗi mẫu nghiên cứu. Mức độ đa hình khác
nhau được thể hiện bởi 3 primer này cũng đã quan sát được ở các nhóm Lilium khác
nhau. Số băng DNA đa hình cao nhất (61 băng) thu được ở các giống Lily thuộc nhóm
Oriental chiếm 49,59%, tiếp sau đó là nhóm L. longiflorum và các con lai của chúng
14
đạt 33,3%, nhóm các loài Lily hoang dại thu thập từ Nhật Bản đạt 8,13%; các giống
Lily thuộc nhóm Asiatic đạt 7,32% và nhóm các loài Lily bản địa của Việt Nam đạt
1,63%. Phân tích RAPD cùng với việc thiết lập cây phân loại di truyền đã cho thấy sự
đa dạng và mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen Lilium đã thu thập [26].
Nguyễn Thị Thanh Bình và cs (2004) đã dùng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu
tính đa hình của 8 giống tằm đang được nuôi tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam: TTB,
TML, VC, ĐS1, ĐS2, BM, THT, VYD, trong đó có 4 giống được sử dụng nhiều
trong vài năm gần đây, đó là hai giống địa phương thuộc tập đoàn gốc đa hệ: vàng
chấm (VC) và Đồ Sơn (ĐS) hai giống tằm lưỡng hệ trắng Thái Bình (TTB) và trắng
Mai Lĩnh (TML). Trong tổng số 67 băng nhận được có 26 băng đơn hình (chiếm
38,81%) và 41 băng đa hình (chiếm 66,19%), kích cỡ của các băng từ 100 bp đến
3500 bp. Trong 8 giống tằm nghiên cứu có 2 giống lưỡng hệ tương đối xa nhau về
quan hệ di truyền, còn 6 giống đa hệ địa phương có họ hàng khá gần gũi với nhau.
Các băng đa hình là cơ sở phân biệt giữa các giống với nhau, có băng đa hình chỉ
xuất hiện ở một giống mà không xuất hiện ở các giống khác như băng OPO19-1200
bp và OPO19-1000 bp chỉ thấy ở giống TML, băng OPO19-800 bp ở giống TTB và
trong nhóm đa hệ chỉ xuất hiện ở giống BM. Với primer OPO16, băng 300 bp quan
sát thấy ở giống TTB, còn băng 400 bp có ở giống TML và duy nhất ở VC trong
nhóm đa hệ. Hiện tượng này còn thấy ở primer OPO13, băng 550 bp ở giống THT,
băng 100 bp xuất hiện trong giống TML, còn băng 1600 bp chỉ thấy ở TTB. Primer
101, riêng giống TTB có băng 100 bp và VC duy nhất mang băng 400 bp trong
nhóm đa hệ. Băng A7-1300 bp, 900 bp và 300 bp không có ở 7 giống khác mà hiện
diện ở TTB. Giống ĐS1 và ĐS2 cho các băng hệt như nhau ở 4 primer nghiên cứu,
tích RAPD, 17 primer được chọn có tổng số băng khuếch đại là 152, trong đó có 63
băng đa hình, chiếm 41,4%. Hệ số Shanon (H
o
) khác nhau ở các quần thể, từ 0,555-
1,121, với giá trị trung bình là 0,955. Sự đa dạng ở cấp độ loài H
sp
=1,217 [54].
Chuối được xem là một loài cây ăn quả có giá trị kinh tế và là một loại thực
phẩm ăn kiêng rất tốt. Jain và cs (2007) đã phân tích mối quan hệ di truyền của 4
giống chuối khác nhau được trồng ở miền Nam Ấn Độ (Grand Naine, Red Banana,
Nendran và Rasthali) bằng kỹ thuật RAPD với 3 primer (OPA-19, OPB-18, OPD-
16
16). Kết quả có 43,47% sản phẩm khuếch đại là băng đơn hình, chung cho tất cả các
kiểu gen, trong khi đó có 30,43% là băng duy nhất, nhưng chỉ có 26,08% thể hiện
mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gen này. Trong số các primer đã chọn, primer
OPB-18 tạo ra số lượng băng đa hình cao nhất (4 băng), tiếp theo là primer OPA-19
và primer OPD-16. Các ma trận khác nhau đã được tính toán bằng cách sử dụng chỉ
số SED (Squard Euclidean Distance) để ước đoán sự khác nhau của tất cả các cặp
trong sản phẩm khuếch đại, chương trình được xây dựng bởi phương pháp của
Ward sử dụng thuật toán phương sai nhỏ nhất. Sự phân tích cụm biểu hiện 4 kiểu
gen được xác định bằng chương trình của Grandnaine và Rasthali. Giá trị sai khác
về mặt di truyền là từ 2,82%-3,6%, sự sai khác lớn nhất là 3,6% được phát hiện
giữa hai giống Red Banana và Rasthali, và thấp nhất là ở hai giống Nendran và
Rashali (2,23%) [51].
Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) là một trong những loại rau quả
quan trọng nhất ở Ấn Độ, với sản lượng hàng năm lên đến 4,5 triệu tấn. Archak và
cs (2002) đã nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa 27 giống cà chua ở Ấn Độ dựa
vào kỹ thuật RAPD, 42 primer được chọn đã khuếch đại tạo ra 174 băng với các
kích thước khác nhau ở 27 giống. Số lượng băng trên primer nhiều nhất là 8 băng,
trung bình là 4,1 băng cho mỗi primer. Số băng đa hình trên mỗi primer là từ 0 đến
kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn
khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác. RFLP
là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. RFLP có ưu điểm là chỉ thị đồng
trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp, do kích thước DNA khảo
sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng các chỉ thị tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu
nghiên cứu. Phân tích PCR-RFLP đã được sử dụng thành công khi nghiên cứu đa
dạng di truyền ở rất nhiều loài cây ăn quả như Prunus (Badenes và Parfitt, 1995),
Diospyros (Yonemori và cs, 1998) và Mangifera (Eiadthong và cs, 1999) [32].
Abkenar và cs (2004) đã phân tích PCR-RFLP trên DNA lục lạp (cpDNA) để
xác định mối quan hệ phát sinh chủng loại của 30 mẫu “cây ăn quả Citrus thật” (“true
18
citrus fruit trees”) thuộc dưới tộc Citrinae, họ Rutaceae gồm 6 loài Fortunella spp., 1
loài Eremocitrus sp., 2 dạng Poncirus sp., 1 loài
Clymenia sp., 5 loài Microcitrus spp. và 16 loài Citrus spp. Bốn vùng khuếch
đại trên cpDNA là rbcL-ORF106, psaA-trnS, trnH-trnK và trnD-trnT được phân tích
với 15 enzyme cắt giới hạn khác nhau. Trong số 140 đoạn cắt thu được có 108 đoạn
đa hình và tác giả đã dựa vào kết quả này để xây dựng cây phát sinh của chúng. Kết
quả cho thấy tất cả các loài Microcitrus đều có sự phân hóa với nhau và với các loài
khác. Eremocitrusi nằm trong nhóm với Microcitrus nhưng có kiểu cpDNA khác với
các loài Microcitrus. Trong khi đó Clymenia, Fortunella và Poncirus theo thứ tự tạo
thành các nhóm độc lập, ba chi này gần với Citrus hơn Microcitrus và Eremocitrus.
Các loài Citrus được phân thành 3 nhóm chính và nguồn gốc của các loài Citrus đã
được đề cập đến [32].
SSR là kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận
dạng các trình tự lặp lại đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận
dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế primer. Các trình tự gần
kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. SSR primer sau đó được sử dụng tương tự
như các RAPD primer. SSR là một chỉ thị đồng trội, có tính đa hình cao và đáng tin
cậy vì vậy đã được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng cây
trồng như cam chanh (Nunes và cs, 2002; Golein và cs, 2005), táo (Guilford và cs,
(Kantety và cs, 1995; Charters và cs, 1996), và đã được dùng để phân biệt giữa các
giống cây Citrus khó thực hiện bởi các chỉ thị phân tử khác (Fang và Rose, 1997).
Mối quan hệ di truyền giữa các giống chanh thương mại (Citrus limon) đã được
Capparelli và cs (2004) phân tích bằng kỹ thuật ISSR và phân tích dòng chuỗi (flow
cytometry). Hai giống với các đặc điểm khá giống nhau đã được phân biệt bằng
cách sàng lọc với 10 SSR primer
và xác định hàm lượng DNA trong nhân trước khi nhuộm [39].
AFLP-sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp
giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng
20
những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể
dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen.
AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ
gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích
và độ lặp lại phản ứng cao, các primer sử dụng không cần đặc hiệu loài và các
primer thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài. Có nhiều tác giả đã sử dụng kỹ
thuật này để phân tích đa dạng di truyền trên nhiều đối tượng như bưởi chùm
(Cervera và cs, 1998), dừa (Pepera và cs, 1998), đu đủ (Kim và cs, 2002), Carya
illinoinensis (Beedanagari và cs, 2005) [37].
Quả không hạt là một tính trạng mong muốn ở những cây thuộc chi Citrus và
là mục tiêu quan trọng trong nhân giống. JinPing và cs (2009) đã sử dụng kỹ thuật
AFLP để tìm ra các chỉ thị phân tử cho quýt không hạt Ponkan (Citrus reticulata
Blanco). Tác giả đã chọn ra được 5 cặp primer có liên quan trực tiếp đến tính trạng
mong muốn sau khi sàng lọc 72 cặp primer, sự bắt cặp này đã được kiểm tra bằng
phân tích AFLP từ các nhóm cá thể. Năm đoạn khuếch đại đã được tạo dòng, phân
tích trình tự và so sánh tương đồng, kết quả cho thấy 4 chỉ thị có sự tương đồng cao
với các gen chức năng, điều này có thể giúp hiểu được cơ chế phân tử của tính trạng
không hạt ở chi Citrus. Dựa trên các thông tin về trình tự, 8 primer đặc hiệu đã được
thiết kế và 2 đoạn AFLP-2 và AFLP-5 đã được chuyển đổi thành công sang dạng
chỉ thị SCAR. Vì vậy, có thể đẩy nhanh các chương trình chọn giống bằng cách
- Số lượng múi trên quả.
22
- Số lượng hạt trên múi.
2.2.2. Phương pháp RAPD
DNA được tách chiết từ lá bưởi Thanh trà theo phương pháp của Ahmed và
cs (2009) có cải tiến: cắt lá bưởi Thanh trà (200 mg) thành từng mảnh nhỏ; đồng
hóa mẫu với 500 µL đệm chiết DNA (100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250mM
NaCl). Sau đó thêm 50 µL SDS 20%, ủ ở 65
o
C trong 50 phút. Mẫu được chiết 2 lần
với cùng thể tích của hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để
loại bỏ protein và lấy dịch trong chứa DNA hòa tan ở pha trên. Loại polysaccharide
bằng ether hydrate hóa. Kết tủa DNA bằng ethanol 100% lạnh trong 30 phút ở
-20
o
C. Thu kết tủa DNA bằng ly tâm 11.000 vòng/phút, ở 25
o
C trong 12 phút. Rửa
tiểu thể DNA bằng ethanol 70%. Hòa tan tiểu thể bằng nước cất vô trùng, thêm 1
µL RNase, bảo quản ở -20
o
C dùng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR-RAPD [33].
Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số được xác định bằng phương pháp quang
phổ trên máy NanoDrop ND-1000 (Thermo, Mỹ).
Chín primer ngẫu nhiên (theo Operon Technologies, CA) đã được sử dụng để
khuếch đại DNA các mẫu lá bưởi Thanh trà (tên và trình tự từng primer được trình
bày ở bảng 2.1) theo phương pháp của Rao và cs (2007): hỗn hợp phản ứng gồm 0,8
pmol mỗi loại primer ngẫu nhiên; 4 mM MgCl
2
, 0,4 mM dNTP mỗi loại, 0,05
Xây dựng giản đồ phả hệ và phân tích cụm theo thuật toán UPGMA bằng
phần mềm NTSYS 2.0 (Exeter Software, Mỹ) dựa vào sự xuất hiện hay không xuất
hiện của các băng trên phổ điện di sản phẩm PCR-RAPD của các mẫu với các
primer theo nguyên tắc đánh số "1" nếu có xuất hiện băng và số "0" nếu không xuất
hiện băng.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý để thu giá trị trung bình và phân tích Duncan’s test với mức
ý nghĩa p<0,05 bằng chương trình SAS.
Chương 3.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm hình thái của quần thể bưởi Thanh trà ở thành phố Huế
Chúng tôi tiến hành điều tra và thu thập mẫu lá Thanh trà ở 3 vùng trên địa
bàn thành phố Huế: Kim Long, Hương Long, Thủy Biều (Trung Thượng, Lương
Quán). Kết quả phân tích các đặc điểm về kích thước lá và quả được trình bày ở
bảng 3.1.
24
Bảng 3.1. Một số đặc điểm hình thái của quần thể bưởi Thanh trà ở thành phố Huế
TT Chỉ tiêu
Địa điểm
Lương
Quán
Trung
Thượng
Kim Long Hương Long
1 Tuổi cây (năm) 5 - 40 3 - 25 3 - 6 4 - 17
2 Dài lá (cm) 11,88
ba
10,81
b
12,98
a
33,33
b
72,82
ba
7 Chiều cao quả (cm) 11,77
a
11,28
a
11,47
a
11,29
a
8 ĐK quả (cm) 11,76
a
11,28
a
11,47
a
11,29
a
9 KL quả (g) 715,00
a
592,70
a
690,00
a
670,80
a
10 KL phần ăn được (g) 452,60
a
Chú thích: các chữ cái khác nhau trong cùng một hàng thể hiện sự sai khác có ý nghĩa
thống kê của các trung bình mẫu với mức ý nghĩa p<0,05 (Duncan’s test).
Nhìn chung, các cây bưởi Thanh trà được trồng từ nhiều vùng khác nhau ở
thành phố Huế có đặc tính hình thái ít sai khác nhau, bưởi Thanh trà có các đặc
điểm chính là: cây cao trung bình từ 5-8 m, cao nhất có thể lên đến 15 m. Lá có
hình oval, màu xanh đậm, kích thước lá trung bình từ 5-15×2-6 cm; cá biệt có
những cây có lá rất to như 2HL kích thước lá lên đến 19×9 cm, tuy nhiên cũng có
những cây có kích thước lá khá nhỏ như 3LQ (7×2 cm). Quả Thanh trà có kích
thước tương đối nhỏ hơn so với các loại bưởi khác và rất nhiều hạt; trung bình mỗi
quả có từ 119-140 hạt, đây chính là nhược điểm rất lớn làm giảm giá trị của bưởi
Thanh trà.
Qua bảng 3.1, chúng tôi nhận thấy đặc tính hình thái của quả ở các xã thuộc
thành phố Huế không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê. Điều này có thể do các
đặc điểm hình thái của quả ít chịu sự tác động của nền đất. Trong khi đó, kích thước
lá lại có sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các vùng với nhau, ở vùng Lương
25
Copyright: Tài liệu đại học ©