PHẦN MỞ ĐẦU
Biện pháp sinh học sử dụng các sinh vật, vi sinh vật đối kháng hay sản
phẩm của chúng trong kiểm soát sinh học, nhằm ngăn chặn, diệt trừ các sinh
vật, vi sinh vật gây bệnh có nhiều ưu điểm to lớn. Nó không những phòng,
trị sâu bệnh hại có hiệu quả mà còn khắc phục được những nhược điểm của
biện pháp sử dụng các chất hoá học bảo vệ thực vật. Biện pháp sinh học
không hoặc rất ít gây ô nhiễm môi trường, góp phần vào việc giữ cân bằng
sinh thái, không độc hại với người sử dụng, các nông phẩm tạo ra có chất
lượng cao, sạch an toàn với sức khoẻ con người và vật nuôi. Vì vậy biện
pháp sinh học được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nước phát triển và hiện
đang từng bước được mở rộng, khuyến khích sử dụng ở hầu hết các nước
trên thế giới và có nhiều triển vọng phát triển mạnh trong tương lai.
Ở Việt Nam, trong những năm trở lại đây cũng đang có nhiều nghiên
cứu hướng vào khả năng đối kháng và tạo chế phẩm phân bón hay thuốc bảo
vệ thực vật có nguồn gốc từ những loài Trichoderma đặc biệt là ở thành phố
Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, những nghiên cứu về Trichoderma từ RNM là
hoàn toàn mới mẻ và mới chỉ được sơ bộ đánh giá từ năm 2008 tại Bộ môn
CNSH-VS, trường ĐHSP Hà Nội.
Chúng ta đang phải đối mặt và giải quyết hậu quả gây ra từ việc sử
dụng tràn lan, không có khoa học thuốc hoá học bảo vệ thực vật. Hậu quả đó
không những làm ô nhiễm nghiêm trọng môi trường đất, nước, không khí
ảnh hưởng trực tiếp đến các sinh vật sống trong các môi trường đó. Dư
lượng thuốc tồn lưu trong các nông phẩm còn ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ
con người làm phát sinh nhiều bệnh nan y như ung thư, viêm phổi, thai dị
dạng…Hơn nữa, do việc quá lạm dụng thuốc còn gây hiện tượng quen thuốc
của vi sinh vật gây bệnh.
Đứng trước thực tiễn đó, việc tạo ra các chế phẩm sinh học có hiệu quả
cao phòng, trị được sâu, bệnh và tiến tới thay thế dần biện pháp sử dụng chất
hoá học bảo vệ thực vật là yêu cầu và đòi hỏi cấp thiết không những để làm
giảm thiệt hại do sâu bệnh gây ra, góp phần nâng cao năng suất, chất lượng
sản phẩm nông nghiệp mà còn vì mục đích giải quyết vấn đề môi trường và


2
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
- Các chủng nấm nghiên cứu: Gồm các chủng Trichoderma (34 chủng)
được phân lập từ Rừng ngập mặn Giao Thủy - Nam Định đang được lưu giữ
tại phòng CNSH – Vi sinh, khoa Sinh học, trường ĐHSP Hà Nội.
- Các chủng nấm kiểm định: Phytophthora sp., Fusarium sp. (L2) do
Bộ môn CNSH-VS cung cấp; nấm Colletotrichum gloeosporioides do Viện
di truyền Nông nghiệp phân lập và cung cấp; nấm Rhizoctonia solani do
Viện bảo vệ thực vật phân lập và cung cấp; nấm Phytophthora capsici được
chúng tôi phân lập tại Bộ môn CNSH-VS từ mẫu bệnh do Viện nghiên cứu
Rau quả cung cấp.
2.1.2. Đối tượng cây sử dụng trong nghiên cứu
- Ớt chỉ thiên (Capsicum annuum L.): hạt ớt chỉ thiên chúng tôi sử
dụng hai loại, một của Tổng công ty Rau quả nông sản Việt Nam, một loại
do chúng tôi thu và xử lí hạt.
2.1.2. Hóa chất
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
2.1.4. Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu
2.1.4.1. Môi trường giữ giống Trichoderma
2.1.4.2. Môi trường nuôi cấy Trichoderma trong nghiên cứu
2.1.4.3. Môi trường xác định hoạt tính enzyme
2.1.4.4. Môi trường tự nhiên kích thích sinh bào tử Phytophthora capsici
2.1.4.5. Môi trường phân lập nấm
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme
2.2.1.1. Phương pháp cấy chấm điểm
2.2.1.2. Phương pháp nhỏ dịch

13 GTb4.8 - + + + ++
14 GTb5.3 - + + + +
15 GTB2.4 - + + + +
16 GTB2.5 - - + ++ ++
17 GTB2.6 - - - - -
18 GTB4.5 - + ++ +++ +++
19 GTB5.7 - - ++ ++ ++
20 GTd4.2 - + + + +
4
STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày
21 GTd4.3 - + + + ++
22 R221A1 + ++ +++ * *
23 L2T - - + + +
24 TT4 + ++ +++ * *
25 TT5 + ++ +++ * *
26 TT44 - + + + +
27 TT60 - - + + +
28 6 - - ++ ++ +++
29 11 - - + + +
30 17 - - + +++ +++
31 19 - - + ++ ++
32 25(1) - + ++ ++ ++
33 25(2) + + ++ +++ +++
34 NHA7.17 - - - - -
Trong đó:
-: không có khả năng đối kháng ; +: có đối kháng, hiệu quả ức chế 40-60%;
++: đối kháng mạnh, hiệu quả ức chế 60-80%; +++: đối kháng rất mạnh,
hiệu quả ức chế 80-90%; *: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90%.
3.1.2 Khả năng đối kháng của Trichoderma với Colletotrichum
gloeosporioides

26 TT44 - ++ +++ * *
27 TT60 - - - + +
28 6 - - + + +
29 11 - - + ++ ++
30 17 - + ++ ++ ++
31 19 - - - - -
32 25(1) - + ++ ++ ++
33 25(2) - + ++ +++ +++
34 NHA7.17 - - - - -
Trong đó:
-: không có khả năng đối kháng; +: có đối kháng, hiệu quả ức chế 40-60%; +
+: đối kháng mạnh, hiệu quả ức chế 60-80%; +++: đối kháng rất mạnh, hiệu
quả ức chế 80-90%;*: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90%
6
3.1.3. Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Rhizoctonia
solani
Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Rhizoctonia
solani được thể hiện ở bảng 3.3:
Bảng 3.3. Kết quả đối kháng giữa các chủng Trichoderma với
Rhizoctonia solani
STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày
1 NHA7.3 - - + ++ ++
2 NHA7.4 - + +++ +++ +++
3 NHA7.5 - + ++ +++ +++
4 NHA8.6 - - - - -
5 NHA8.8 - - - - -
6 GTa2.2 - - + ++ ++
7 GTa3.2 - - + + +
8 GTA3.5 - + + + +
9 GTA5.1 - - + ++ ++

quả ức chế 80-90%; *: đối kháng hoàn toàn, hiệu quả ức chế > 90%
3.1.4. Khả năng đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Fusarium sp.
Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với Fusarium sp.
được thể hiện ở bảng 3.4:
Bảng 3.4. Kết quả thử đối kháng giữa các chủng Trichoderma với
Fusarium sp (L2)
STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày
1 NHA7.3 - - - - -
2 NHA7.4 - - + + +
3 NHA7.5 - ++ +++ * *
4 NHA8.6 - - - - -
5 NHA8.8 - - - - -
6 GTa2.2 - + ++ * *
7 GTa3.2 - - + + +
8 GTA3.5 - - + ++ +++
9 GTA5.1 - - - - -
10 GTA5.5 - - - - -
11 GTb2.1 - - + + +
12 GTb4.7 - - - - -
8
STT Các chủng 3 ngày 5 ngày 7 ngày 9 ngày 11 ngày
13 GTb4.8 - - - - -
14 GTb5.3 - - + + +
15 GTB2.4 - + + ++ ++
16 GTB2.5 - - - - -
17 GTB2.6 - - - - -
18 GTB4.5 - ++ +++ +++ +++
19 GTB5.7 - + + ++ ++
20 GTd4.2 - - - - -
21 GTd4.3 - - + + +

3 NHA7.5 + +++ * * *
4 NHA8.6 - + ++ ++ ++
5 NHA8.8 - - ++ ++ ++
6 GTa2.2 - - + + +
7 GTa3.2 - + + + +
8 GTA3.5 - + ++ ++ ++
9 GTA5.1 - + ++ ++ ++
10 GTA5.5 - + +++ * *
11 GTb2.1 - ++ ++ ++ ++
12 GTb4.7 - + ++ +++ +++
13 GTb4.8 - - + ++ ++
14 GTb5.3 - + ++ ++ ++
15 GTB2.4 - ++ +++ * *
16 GTB2.5 - + + + +
17 GTB2.6 - + + + +
18 GTB4.5 - - + ++ ++
19 GTB5.7 - + + + +
20 GTd4.2 + +++ * * *
21 GTd4.3 - - + ++ ++
22 R221A1 + +++ * * *
23 L2T - + ++ +++ +++
24 TT4 - ++ * * *
25 TT5 - + ++ +++ +++
26 TT44 - ++ +++ +++ +++
27 TT60 - + ++ +++ +++
28 6 - + + + +
10
STT
Các chủng
Trichoderma

9 GTA5.1 10
10 GTA5.5 11
11 GTb2.1 11
12 GTb4.7 10
11
STT Các chủng Trichoderma
Hoạt tính enzyme chitinase
(D-d) mm
13 GTb4.8 17
14 GTb5.3 8
15 GTB2.4 21
16 GTB2.5 6
17 GTB2.6 9
18 GTB4.5 25
19 GTB5.7 8
20 GTd4.2 27
21 GTd4.3 23
22 R221A1 21
23 L2T 6
24 TT4 19
25 TT5 7
26 TT44 23
27 TT60 13
28 6 10
29 11 19
30 17 +
31 19 15
32 25(1) 20
33 25(2) 16
34 NHA7.17 10

17 GTB2.6 -
18 GTB4.5 15
19 GTB5.7 16
20 GTd4.2 31
21 GTd4.3 2,0
22 R221A1 37
23 L2T +
24 TT4 32
25 TT5 17
26 TT44 26
27 TT60 -
28 6 20
13
STT Các chủng Trichoderma
Hoạt tính enzyme cellulase
(D-d) mm
29 11 +
30 17 36
31 19 -
32 25(1) +
33 25(2) 20
34 NHA7.17 +
Trong đó:
D: Đường kính vòng phân giải (mm); d: Đường kính lỗ thạch (10mm); +: Có
hoạt tính enzyme nhưng rất yếu; -: Không có hoạt tính enzyme.
3.3. Kết quả bước đầu nghiên cứu hiệu quả ứng dụng trên cây trồng của
một số chủng Trichoderma có khả năng đối kháng cao được chọn lọc
3.3.1. Ảnh hưởng của hai chủng NHA7.5 và TT4 tới tốc độ sinh trưởng,
phát triển của
Bảng 3.8. Chiều cao trung bình và số lượng lá/cây từng tuần theo dõi

Các công thức
TN
Chiều cao
TB (mm)
Số cây
2 lá 3 lá 4 lá 5 lá 6 lá 7 lá
NBCT(TT4) 26,66 ± 0,39 28 7
NBCT(NHA7.
5)
26,31 ± 0,41 23 12
ĐC1 25,74 ± 0,53 21 14
ĐC2 26,57 ± 0,31 25 10
Tuần
3
TT4(1) 31,89 ± 0,48 4 28 3
TT4(2) 31,79 ± 0,37 3 30 2
NHA7.5(1) 33,83 ± 0,41 4 23 8
NHA7.5(2) 31,80 ± 0,45 2 28 5
NBCT(TT4) 29,80 ± 0,45 10 23 2
NBCT(NHA7.
5)
29,29 ± 0,47 9 24 2
ĐC1 28,77 ± 0,39 8 25 2
ĐC2 29,96 ± 0,33 9 24 2
Tuần
4
TT4(1) 35,93 ± 0,50 21 14
TT4(2) 34,84 ± 0,42 22 12 1
NHA7.5(1) 36,86 ± 0,49 11 23 1
NHA7.5(2) 34,80 ± 0,41 23 11 1

TT4(2) 42,65 ± 0,39 1 21 10 3
NHA7.5(1) 43,98 ± 0,47 18 13 3 1
NHA7.5(2) 42,83 ± 0,50 1 17 14 2 1
NBCT(TT4) 40,26 ± 0,38 3 22 9 1
NBCT(NHA7.
5)
40,17 ± 0,50 2 22 9 2
ĐC1 39,56 ± 0,48 3 24 7 1
ĐC2 40,08 ± 0,29 3 22 9 1
Sự chênh lệch chiều cao trung bình giữa các lô thí nghiệm khác nhau
được thể hiện rất rõ qua biểu đồ hình cột dưới đây:
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
TT4(1)
TT4(2)
NHA7.5(1)
NHA7.5(2)
NBCT(TT4)
NBCT(NHA7.5)
Các lô TN
Chiều cao TB (mm)

2
lá
3
lá
4
lá
5
lá
6
lá
7 lá
Tuần
1
GTd 4.2(1) 27,53 ± 0,38 30
GTd 4.2(2) 27,48 ± 0,47 30
R221A1(1) 27,65 ± 0,43 30
R221A1(2) 27, 95 ± 0,45 30
NBCT(GTd4.2) 25,89 ± 0,54 30
NBCT(R221A1) 25,22 ± 0,50 30
ĐC1 25,48 ± 0,49 30
ĐC2 25,15 ± 0,53 30
Tuần
2
GTd 4.2(1) 31,04 ± 0,54 18 12
GTd 4.2(2) 31,11 ± 0,54 14 16
R221A1(1) 31,08 ± 0,51 17 13
R221A1(2) 32,02 ± 0,49 14 15 1
NBCT(GTd4.2) 29,07 ± 0,51 22 8
NBCT(R221A1) 29,18 ± 0,46 23 9
ĐC1 29,76 ± 0,42 20 10

GTd 4.2(1) 39,18 ± 0,43 8 20 2
GTd 4.2(2) 39,07 ± 0,34 7 20 3
R221A1(1) 39,22 ± 0,45 4 22 4
R221A1(2) 39, 12 ± 0,39 2 24 4
NBCT(GTd4.2) 36,58 ± 0,42 14 15 1
NBCT(R221A1) 37,13 ± 0,49 1 13 16
ĐC1 37,44 ± 0,52 16 14
ĐC2 37,02 ± 0,43 12 18
Tuần
5
GTd 4.2(1) 43,16 ± 0,45 19 11
GTd 4.2(2) 43,24 ± 0,46 16 14
R221A1(1) 42,43 ± 0,45 18 12
R221A1(2) 43,39 ± 0,39 12 15
NBCT(GTd4.2) 41,36 ± 0,52 19 10
NBCT(R221A1) 41,62 ± 0,46 21 9
ĐC1 41,01 ± 0,43 22 8
ĐC2 41,11 ± 0,52 20 10
Tuần
6
GTd 4.2(1) 47,93 ± 0,51 2 24 4
GTd 4.2(2) 48,31 ± 0,46 1 23 5 1
R221A1(1) 48,31 ± 0,53 1 24 5
R221A1(2) 48,54 ± 0,43 1 22 6 1
NBCT(GTd4.2) 45,29 ± 0,53 4 24 2
NBCT(R221A1) 45,16 ± 0,49 5 24 1
18
Thời
gian
Các công

Các công thức thí nghiệm
Tỉ lệ bệnh
(%)
Hiệu lực phòng
trừ (%)
NHA7.5(2) (xử lí hạt, bổ sung NHA7.5
vào đất trước khi chủng bệnh )
17,14 60
NBCT(NHA7.5) (xử lí với NHA7.5 sau
khi chủng bệnh)
31,43 26,67
TT4(2) (xử lí hạt, bổ sung TT4 vào đất
trước khi chủng bệnh)
22,86 46,67
NBCT(TT4) (xử lí với TT4 sau khi chủng
bệnh)
34,29 20
19

0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50

B
C
T(
NHA7
.
5
)
Các công thức TN
Tỉ lệ bệnh (%)
Hình 3.12. Tỉ lệ (%) cây bị bệnh ở 8 công thức thí nghiệm khác nhau
(TT4(1), TT4(2), NHA7.5(1), NHA7.5(2), NBCT(TT4), NBCT(NHA7.5),
ĐC1, ĐC2)
Trong đó:
- TT4(1): Xử lí Trichoderma (chủng TT4) không xử lí nấm bệnh; - TT4(2):
Xử lí Trichoderma (chủng TT4) trước khi chủng bệnh; NHA7.5(1): Xử lí
Trichoderma (chủng NHA7.5) không xử lí nấm bệnh; NHA7.5(2): Xử lí
Trichoderma (chủng NHA7.5) trước khi chủng bệnh; NBCT(TT4): Xử lí
Trichoderma (chủng TT4) khi cây có biểu hiện bệnh sau một gian chủng
bệnh; NBCT(NHA7.5): Xử lí Trichoderma (chủng NHA7.5) khi cây có biểu
hiện bệnh sau một thời gian chủng bệnh; ĐC1: Không xử lí bất cứ nấm gì cả
nấm bệnh và nấm Trichoderma; ĐC2: Chủng nấm bệnh, không xử lí nấm
Trichoderma.
3.4.2. Hiệu quả phòng, trị Phytophthora capsici trên ớt của hai
chủng GTd4.2 và R221A1
Kết quả tính tỉ lệ bệnh và hiệu lực phòng, trừ của GTd4.2 và R221A1
được thể hiện ở bảng 3.11 dưới đây:
Bảng 3.11. Tỉ lệ bệnh và hiệu lực phòng trừ của các công thức thí
nghiệm có xử lí GTd4.2 và R221A1.
Các công thức thí nghiệm
Tỉ lệ bệnh

Tỉ lệ bệnh (%)
Hình 3.13. Tỉ lệ (%) cây bị bênh ở 8 công thức thí nghiệm khác nhau
(GTd4.2(1), GTd4.2(2), R221A1(1), R221A1(2), NBCT(GTd4.2),
NBCT(R221A1), ĐC1, ĐC2)
Trong đó: - GTd4.2(1): Xử lí Trichoderma (chủng GTd4.2) không xử
lí nấm bệnh; GTd4.2(2): Xử lí Trichoderma (chủng GTd4.2) trước khi
chủng bệnh; R221A1(1): Xử lí Trichoderma (chủng R221A1) không xử lí
nấm bệnh; R221A1(2): Xử lí Trichoderma (chủng R221A1) trước khi chủng
bệnh; NBCT(GTd4.2): Xử lí Trichoderma (chủng GTd4.2) khi cây có biểu
hiện bệnh sau một gian chủng bệnh; NBCT(R221A1): Xử lí Trichoderma
(chủng R221A1) khi cây có biểu hiện bệnh sau một thời gian chủng bệnh;
ĐC1: Không xử lí bất cứ nấm gì cả nấm bệnh và nấm Trichoderma; ĐC2:
Chủng nấm bệnh, không xử lí nấm Trichoderma.
21
3.5. Kết quả phân lập lại Phytophthora capsici từ những cây ớt có biểu
hiện bệnh sau khi chủng bệnh

Hình 3.14. Cây ớt có biểu hiện nhiễm P. capsici sau khi chủng bệnh
Hình 3.15. Nấm Phytophthora capsici được phân lập lại từ mẩu
thân và rễ của cây ớt bệnh trên môi trường Agar – nước cất. A: Phân lập
P. capsici từ thân; B: phân lập P.
3.6. Một số cơ chế đối kháng có thể của các chủng Trichoderma với
các nấm bệnh nghiên cứu đặc biệt với nấm Phytophthora capsici
Chúng tôi nhận thấy chủng NHA7.5, R221A1, GTd4.2, TT4, GTB2.4,
TT44 biểu hiện cao cả hoạt tính chitinase và cellulase đều có khả năng đối
kháng cao với hầu hết 5 loại nấm kiểm định đã thử nghiệm. Khả năng sinh
enzyme và tính đối kháng của các chủng Trichoderma nghiên cứu có liên
quan mật thiết. Các chủng biểu hiện hoạt tính cellulase cao trong nghiên cứu
này thường thể hiện tính đối kháng cao với nấm Phytophthora (cellulose và
glucan là thành phần chính của thành tế bào). Ngoài ra, tốc độ sinh trưởng

Phytophthora capsici cả 34 chủng đều biểu hiện khả năng đối kháng). Nhiều
chủng có khả năng đối kháng rất mạnh và hoàn toàn, trong đó 3 chủng
(R221A1, TT4, TT5) đối kháng hoàn toàn với Phytophthora sp., 3 chủng
(NHA7.4, GTd4.2, TT44) đối kháng hoàn toàn với nấm Colletotrichum
gloeosporioides, 4 chủng (R221A1, TT4, TT5, TT44) có khả năng đối
kháng hoàn toàn với Rhizoctonia solani, 3 chủng (NHA7.5, GTa2.2, L2T)
có khả năng đối kháng hoàn toàn với Fusarium sp., có 8 chủng có khả năng
đối kháng hoàn toàn với Phytophthora capsici trong đó 4 chủng biểu hiện
tính đối kháng nhanh và mạnh là NHA7.5, GTd4.2, R221A1, TT4. Bốn
chủng này được chúng tôi chọn lọc để nghiên cứu tiếp ở giai đoạn ứng dụng.
2. Nghiên cứu hoạt tính enzyme chitinase và cellulase cho thấy có 33/34
chủng có biểu hiện hoạt tính enzyme chitinase, trong đó chủng GTd4.2 có hoạt
tính mạnh nhất (27mm). Biểu hiện hoạt tính cellulase có 28 chủng, hai chủng
có hoạt tính cao nhất là R221A1 (37mm) và NHA7.5 (35mm).
23
3. Tất cả 4 chủng Trichoderma (NHA7.5, TT4, R221A1, GTd4.2) đều
có ảnh hưởng tích cực đến khả năng sinh trưởng, phát triển của cây, kích
thích khả năng nảy mầm nhanh hơn của hạt, làm tăng sinh trưởng thân, tăng
tốc độ cao trung bình, tốc độ ra lá nhanh hơn, màu sắc lá xanh hơn.
4. Kết quả nghiên cứu hiệu lực phòng trừ của 4 chủng NHA7.5,
R221A1, TT4, GTd4.2 cho thấy cả 4 chủng đều có khả năng phòng trừ đáng
kể, trong đó hiệu quả phòng cao hơn trị. Hiệu quả phòng của 4 chủng
NHA7.5, R221A1, TT4, GTd4.2 theo thứ tự là 60%, 52,94%, 46,67%,
35,29%. Hiệu quả trị của 4 chủng trên theo thứ tự là 26,67%, 23,53%, 20%,
11,76%. Như vậy trong 4 chủng, chủng NHA7.5 có hiệu quả phòng trị cao
nhất, chủng GTd4.2 có hiệu quả phòng trị thấp nhất. Hai chủng có nhiều
tiềm năng ứng dụng tạo chế phẩm phân bón hay chế phẩm thuốc bảo vệ thực
vật là NHA7.5, R221A1.
KIẾN NGHỊ
Cần nghiên cứu tiếp khả năng ứng dụng của của các chủng