Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN VĂN QUANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP NHÂN TẠO ĐỂ LÂY
NHIỄM VIRUS GÂY BỆNH XOĂN VÀNG LÁ CÀ CHUA
Chuyên nghành : Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iii

LỜI CẢM ƠN
Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Nguyễn Thị Hải Yến, giảng
viên Khoa Khoa học Sự sống - Trƣờng Đại học Khoa học đã tận tình hƣớng dẫn,
truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ phòng thí
nghiệm Sinh học – Khoa Khoa học Sự sống – Trƣờng Đại học Khoa học, Phòng
Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học đã truyền đạt kiến thức,
tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành các thí nghiệm trong luận văn.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp luôn động viên,
khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Thái nguyên, ngày10 tháng 9 năm 2014
Học viên Nguyễn Văn Quang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
iv MỤC LỤC

MỤC
Trang
MỞ ĐẦU……………………………………………………………
1
1. Đặt vấn đề…………………………………………………………

19
2.1. Vật liệu…………………………………………………………
19
2.1.1. Vật liệu thực vật………………………………………………
19

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
v

2.1.2. Chủng vi khuẩn ………………………………………………
20
2.1.3. Hoá chất, thiết bị máy móc……………………………………
20
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………
21
2.2.1. Phƣơng pháp lây nhiễm bằng bọ phấn ………………………
21
2.2.2. Phƣơng pháp lây nhiễm bằng ghép áp…………………………
22
2.2.3. Phƣơng pháp lây nhiễm bằng Agro - inoculation ……………
22
2.2.4. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ (đo quang phổ - đo OD)……
23
2.2.5. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ biểu hiện bệnh…………………
23
2.2.6. Phƣơng pháp phân tích sự có mặt của virus TYLCV…………
24
2.2.6.1. Thu thập mẫu và tách chiết DNA tổng số……………………
24
2.2.6.2. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose………………………

vi

2. ĐỀ NGHỊ………………………………………………………
41

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
Từ viết tắt
Nghĩa tiếng Việt
Nghĩa tiếng Anh
Bp
Cặp base
base pair
CTAB
CTAB
Cetyltrimethylammonium Bromid
CP
protein vỏ
Coat protein
DNA
Axit Deoxyribonucleic
Deoxyribonucleic Acid
dNTP
dNTP
Deoxynucleoside triphosphate
EDTA
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetic

Replication
SCR
vùng vệ tinh
Satelite Conserved Region
TYLCV
Virus gây bệnh xoăn vàng lá
cà chua
Tomato Yellow Leaf Curl Virus
TB
Trung bình

RAPD
nhân bản ngẫu nhiên những
đoạn DNA
Random Amplified Polymorphic
DNA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1
Sơ đồ cấu trúc genome của TYLCV
9
1.2
Chu kỳ sinh trƣởng của bọ phấn (Bemisia tabaci)
11
2.1
Sơ đồ quy trình nghiên cứu
21
2.2
Các mức độ biểu hiện bệnh xoăn vàng lá cà chua
24
3.1
Hình ảnh cây cà chua bị bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV trồng
tại vƣờn có nguồn bệnh sau 50 ngày
27
3.2
Kết quả điện di sản phẩm tách DNA tổng số của một số dòng cà
chua nhiễm bệnh

2. Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hải Yến
3. Ngƣời thực hiện: Nguyễn Văn Quang
4. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm đƣợc phƣơng pháp lây nhiễm virus TYLCV phù hợp để lây bệnh cho
cà chua nhằm tạo phƣơng pháp chuẩn để đánh giá khả năng kháng virus này cho
cà chua trong điều kiện nhà lƣới và vƣờn thí nghiệm.
5. Nội dung nghiên cứu
1. Thu thập các giống cà chua mẫn cảm với virus, kháng tự nhiên với virus.
.
3. Tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo cho cà chua
4. Theo dõi và phân tích kết quả, đánh giá mức độ biểu hiện bệnh sau khi lây
nhiễm.
5. Đƣa ra quy trình lây nhiễm nhân tạo virus TYLCV cho cà chua.
6. Kết quả nghiên cứu
(1) Thu thập giống cà chua phục vụ thí nghiệm:
+ Giống PT 18 do viện rau quả Việt Nam cung cấp. Cà chua PT18 có chiều
cao trung bình 80 – 100 cm, dạng cây gọn, màu lá xanh nhạt, phân cành ít, sinh
trƣởng hữu hạn. PT18 là giống khá mẫn cảm với bệnh xoăn vàng lá do TYLCV.
+ Giống F
1
GM - 2008, là giống nhập nội có nguồn gốc từ Pháp. Quả của F1
GM - 2008 có dạng tròn dẹt, chín có màu đỏ tƣơi, thịt dày, rắn chắc. F1 GM -
2008 sinh trƣởng hữu hạn, chịu lạnh và nóng rất tốt, giống F
1
GM2008 đƣợc lai
tạo theo hƣớng kháng bệnh xoăn vàng lá do virus TYLCV.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
xi


dụng thƣờng xuyên. Cà chua dễ trồng, chi phí đầu tƣ ban đầu thấp, là loại cây thích
ứng với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau, thời gian từ khi trồng đến thu hoạch
ngắn, do vậy có thể mở rộng sản xuất ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới.
Cũng nhƣ các cây trồng khác, các giống cà chua đang trồng ở trên thế giới và
Việt Nam bị tấn công bởi các loại sâu bệnh nhƣ nấm, côn trùng, vi khuẩn và đặc
biệt là virus. Trong số bệnh virus hại cà chua ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, bệnh
xoăn vàng lá do virus TYLCV gây nên đƣợc xem là bệnh gây hậu quả nghiêm trọng
nhất [17], [21]. Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá trên cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh
trên các ruộng trồng cà chua thƣờng rất cao, có khi tới 100%. TYLCV là loài virus
thuộc chi Begomovirus, họ Geminividae và chúng chỉ truyền nhiễm vào cây thông
qua vector truyền bệnh là bọ phấn Bemisia tabaci một cách nhanh chóng và liên tục
dẫn đến bùng phát thành dịch bệnh [7], [9]. Sự kiểm soát bệnh TYLCV ở các vùng
trồng cà chua chú trọng chính vào sự kiểm soát bọ phấn bằng các loại thuốc hóa
học tiêu diệt côn trùng hoặc các bẫy bắt, các rào cản vật lý nhƣ lƣới chắn bọ
phấn… Tuy nhiên, các phƣơng pháp kiểm soát bệnh TYLCV vừa nêu gây tốn kém
về kinh phí và sức lực con ngƣời trong sản xuất, hơn nữa còn gây ô nhiễm môi
trƣờng và tích lũy độc tính trong quả vì sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại diệt
bọ phấn [26].
Biện pháp hiệu quả nhất để phòng, chống virus là sử dụng giống cà chua
kháng virus, trong thực tế hiện nay các giống tự nhiên kháng virus không nhiều vì
vậy các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để tạo các giống có khả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2

năng kháng virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua để đƣa vào sản xuất. Tuy nhiên,
để đánh giá các dòng cây tạo ra có kháng đƣợc với virus hay không thì công việc
lây nhiễm virus để kiểm tra khả năng kháng là rất quan trọng. Virus gây bệnh xoăn
vàng lá cà chua không truyền qua hạt giống, qua hạt, đất, qua va chạm cơ học
nhƣng lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn. Dựa trên đặc điểm lan truyền của

khác nhƣ Trung Quốc và Đông Nam Á (thế kỷ 17), Nhật Bản (thế kỷ 18). Đến thế kỷ
18, nhiều vùng trên thế giới trồng cà chua làm thực phẩm và giống cà chua đã trở
nên phong phú và đa dạng. Vào đầu thế kỷ 19, quả cà chua đã trở thành loại thực
phẩm phổ biến và quen thuộc của con ngƣời. Đến cuối thế kỷ 19 cà chua đƣợc đƣa
vào trồng ở nƣớc ta ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ và một số tỉnh vùng cao.
Cà chua thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phân lớp cúc
(Asteridae), lớp ngọc lan (Magnoliosida) [40], [31]. Từ lâu đã có nhiều tác giả
nghiên cứu về phân loại cà chua và thành lập hệ thống phân loại theo quan điểm
của riêng mình. Theo hệ thống phân loại của Muller (1940) thì cà chua trồng hiện
nay thuộc chi phụ Eulycopersion C.H.Muller. Tác giả phân loại chi phụ thành 7
loài, loài trồng hiện nay (Lycopersicon esculentum) thuộc loài thứ nhất. Theo
Nonnecke(1989) thì L. esculentum là loài cà chua trồng có 4 chủng chính (1) L.
esculentum var. Commune bao gồm hầu hết những giống cà chua hiện nay với đặc
điểm là lá rậm, quả có khối lƣợng trung bình lớn; (2) L. esculentum var.
Grandiolium có đặc điểm lá rộng và láng bóng, số lá trên cây ít; (3) L. esculentum
var. Validium là cà chua anh đào với thân đứng mập và (4) L. esculentum var.
Pyriforme là cà chua quả lê.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4

1.1.2. Đặc điểm sinh học
Đặc điểm bộ rễ cà chua là rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng
phát triển rễ phụ rất lớn. Trong điều kiện thuận lợi nhất những giống tăng trƣởng
mạnh có rễ ăn sâu 100 - 150 cm và rộng 150 - 250 cm. Vì vậy cà chua chịu hạn tốt.
Bộ rễ ăn sâu, mạnh hay yếu đều có liên quan đến mức độ phân cành và phát triển
của bộ phận trên mặt đất, do đó khi trồng cà chua tỉa cành, bấm ngọn, bộ rễ thƣờng
ăn nông và hẹp hơn so với điều kiện trồng tự nhiên.
Cây cà chua có thân tròn, thẳng đứng, mọng nƣớc, phủ nhiều lông, khi cây
lớn gốc thân dần dần hóa gỗ. Thân mang lá và phát hoa ở nách lá là chồi nách. Chồi

o
C
cà chua không ra hoa [38]. Cà chua có khả năng chịu hạn song trong quá trình sinh
trƣởng, phát triển cà chua cần một lƣợng nƣớc lớn do vậy khi trồng cần phải đƣợc
tƣới nhiều nƣớc, thiếu nƣớc cây sẽ ít hoa và dễ rụng quả [ 32].
1.1.3. Một số bệnh hại cà chua
- Bệnh mốc sương (Phytophtaora infestans)
Bệnh mốc sƣơng gây ra do một loại nấm có tên là Phytophtaora infestans.
Đây là loài nấm ký sinh chuyên tính có khả năng hình thành nhiều chủng khác
nhau. Nấm gồm 16 chủng trong đó có cả các chủng đơn và chủng hỗn hợp. tuy
nhiên số lƣợng chủng nấm thay đổi tuỳ khu vực sinh thái trồng trọt hoặc ở từng
nƣớc khác nhau. Bệnh mốc sƣơng thƣờng phát triển trong điều kiện nhiệt độ từ 15 -
22
o
C, thích hợp nhất là 18 - 20
o
C và độ ẩm không khí cao. Độ ẩm thấp nhất cho
nấm phát triển là 76%, có ý kiến cho là 65%, độ ẩm càng cao bệnh lây lan và gây
hại càng mạnh. Trong điều kiện thiếu ánh sáng, trời âm u, mƣa phùn càng tạo điều
kiện thuận lợi cho nấm phát triển. Bệnh thƣờng xuất hiện đầu tiên ở mép chóp lá
tạo vết xám xanh nhạt sau đó lan rộng vào phiến lá. Phần giữa vết bệnh chuyển
màu đen và xung quanh vết bệnh thƣờng có cành bào tử màu trắng xốp bao phủ
giống một lớp mốc trắng nhƣ sƣơng muối làm cho lá chết lụi nhanh chóng, bệnh
cũng xuất hiện ở cuống lá, cành và thân [38].
- Bệnh héo xanh vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum Smith)
Bệnh gây hại nghiêm trọng đối với cây cà chua ở các vùng trồng cà chua ở
Việt Nam, các vùng nhiệt đới, bán nhiệt đới và những vùng trên thế giới có khí hậu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7

Nguồn bệnh cƣ trú trong đất, xâm nhập vào cây qua bộ rễ. Bệnh phát triển
mạnh ở nhiệt độ cao 28
o
C. Triệu chứng của bệnh đầu là những lá ở dƣới thấp bị
vàng, héo, sau đó lây lan sang lá non và hoa. Toàn bộ bó mạch ở hệ rễ bị biến đổi
thành màu nâu và cây bị chết. Có thể phòng bệnh bằng cách coi trọng công tác vệ
sinh đồng ruộng, luân canh triệt để, xử lý đất. Khi bệnh phát triển mạnh có thể
dùng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây. Khi dùng thuốc phải tuân thủ sự hƣớng
dẫn của ngành bảo vệ thực vật.
- Bệnh xoăn lá do virus
Bệnh do virus gây hại cà chua và gồm rất nhiều loại, thuộc nhóm
Germinivirus. Bệnh có triệu chứng xoăn ngọn lá, những cây bị bệnh hại sinh
trƣởng, phát triển kém, thƣờng không cho quả. Vì vậy gây tổn thất nghiêm trọng
đến năng suất, có khi không cho thu hoạch. Đặc biệt từ sau khi trồng đến thời kỳ ra
hoa, cây bị hại sẽ làm giảm khối lƣợng quả rất lớn. Ở Việt Nam, bệnh xoăn lá cà
chua phát triển mạnh trong vụ cà chua sớm và vụ xuân hè khi nhiệt độ không khí từ
25 - 30
o
C, độ ẩm trên 70%.
1.2. Virus gây bệnh xoăn vàng lá cây cà chua
1.2.1. Triệu chứng biểu hiện bệnh
Bệnh do virus thuộc nhóm Geminivirus gây hại cà chua ở những vùng nhiệt
đới. Virus thƣờng gây ra triệu trứng xoăn lá, nhất là ngọn xoăn rất mạnh. Lá có
dạng xoắn vào trong, cây lùn thấp, mặt lá thƣờng bị khảm đốm vàng. Những cây bị
bệnh, sinh trƣởng phát triển kém, thƣờng không cho quả.
Bệnh xoăn lá do virus có thể gây nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh cà
chua khác nhƣ: nụ hoa cà chua lớn, cà chua vàng trên đầu, bệnh xoăn lá sinh lý và

protein [18], [38]. Những loài TYLCV phát hiện trƣớc đây có hệ gen gồm các gen
trùm nằm trên cùng một vòng DNA – A sợi đơn kích thƣớc khoảng 2,8 kb (thể
monopartite). Sau đó, ngƣời ta phát hiện nhiều chủng virus có hệ gen gồm hai vòng
DNA sợi đơn tách biệt với kích thƣớc xấp xỉ nhau khoảng 2,5 – 3,0 kb là DNA – A
và DNA – B (thể bipartite). Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện một số loài thuộc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9

nhóm một vòng gen ngoài vòng DNA – A còn có một hoặc hai vòng DNA vệ tinh
(DNAβ và DNAα) với kích thƣớc xấp xỉ một nửa DNA – A có tác dụng tăng
cƣờng tái bản hệ gen virus và biểu hiện triệu chứng bệnh trên cây chủ [6], [10],
[15], [23].
Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc genome của TYLCV
Hệ gen của TYLCV gồm 6 gen chức năng đó là gen CP (V1), prepCP (V1),
C1, C2, C3, C4. Các gen trong hệ gen của TYLCV có thể nằm trên cùng một vòng
DNA – A hoặc hai vòng DNA – A và DNA – B riêng biệt ngăn cách với nhau bởi
một vùng liên gen (IR – intergenic region) có độ dài khoảng 200 nucleotide. Trên
vùng IR đó có chứa điểm khởi đầu sao chép và vùng điều khiển cho sự tái bản vòng
gen virus theo cả hai hƣớng. Dạng trình tự điển hình nhất trong vùng IR là hai trình
tự bảo thủ lặp lại đảo ngƣợc của TAATATT/AC đƣợc định vị trên một cấu trúc
vòng (stem – loop) có liên quan tới việc tái bản sợi DNA mới và một trình tự lặp lại
cần thiết cho việc nhận biết và bám vào của protein Rep (Replication) trong quá
trình phiên mã [18], [25].
Các chủng Begomovirus monopartite ngoài vòng DNA – A có thể có một hoặc
hai vòng DNA sợi đơn với kích thƣớc xấp xỉ một nửa DNA – A đƣợc gọi là DNA



Bọ phấn trắng có chu kỳ sinh trƣởng khoảng 18 – 28 ngày để phát triển từ
trứng thành con trƣởng thành trong điều kiện thời tiết ấm áp và khoảng 30 – 40
ngày trong mùa đông. Chu kỳ sinh trƣởng gồm những giai đoạn sau: (1) trứng nở
trong khoảng 7 đến 10 ngày; (2) giai đoạn bò kéo dài khoảng 3 – 4 ngày; (3) Giai
đoạn thiếu trùng kéo dài khoảng 6 – 12 ngày; (4) giai đoạn nhộng kéo dài khoảng 4
– 6 ngày; (5) con trƣởng thành sống trong khoảng thời gian 6 – 16 ngày và có thể
sống đến 50 ngày (Hình 1.2).
Bọ phấn trắng hút
nhựa cây bằng cách dùng
miệng chích và hút làm
cho cây phát triển còi
cọc, lá vàng và trái chín
không đều. Trong khi hút
nhựa cây, bọ phấn trắng
tiết ra dịch ngọt mà từ đó
mốc đen phát triển rất
nhanh làm đen lá và đen
bề mặt quả. Trong điều
kiện tự nhiên bọ phấn trắng có thể di chuyển xa tới 2 km và làm lây lan bệnh rất
nhanh [4].
Năm 1966, Cohen và Nitzany đã tiến hành những thử nghiệm đầu tiên nhằm
kiểm soát dịch bệnh TYLCV. Trƣớc hết là tìm hiểu mối quan hệ giữa virus – vector
bằng cách kiểm tra hiệu quả truyền TYLCV bởi bọ phấn trắng. Sau 48 giờ nuôi
cộng sinh bọ phấn trắng với cây WT (wild type – cà chua dại) nhận thấy chỉ có 5%
ruồi đực truyền virus, tuy nhiên hiệu quả truyền virus ruồi trắng cái tới 32% gấp 6
lần ruồi đực. Tiến hành thử nghiệm với các số lƣợng 1, 3, 5, 10 và 15 bọ phấn cái/1

Hình 1.2. Chu kỳ sinh trưởng của bọ phấn (Bemisia
tabaci)


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13

Ở nƣớc ta, bệnh xoăn lá cà chua do virus phát triển mạnh trong vụ cà chua
sớm và vụ xuân hè. Sự lây lan của TYLCV có thể ngăn bằng cách loại bỏ các cây
ký chủ ra khỏi vùng có bệnh và bằng cách ngăn chặn loài bọ phấn có mặt trên đồng
ruộng trƣớc khi loại bỏ cây. Tuy nhiên, phƣơng pháp này tốn kém, gây ô nhiễm
môi trƣờng và nông phẩm khi sử dụng chất hóa học độc hại tiêu diệt côn trùng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14

1.2.5. Một số biện pháp phòng bệnh xoăn vàng lá cho cà chua
Bệnh xoăn vàng lá cà chua đã đƣợc biết đến nhiều năm, tuy nhiên vẫn chƣa
có phƣơng pháp phòng tránh hiệu quả và những thiệt hại do virus này gây ra vẫn rất
đáng kể. Tổn thất trung bình từ 5 – 90 % và có thể lên tới 100% khi mật độ quần
thể bọ phấn cao. Việc khống chế TYLCV chủ yếu thông kiểm soát qua môi giới
truyền bệnh. Các biện pháp truyền thống đã đƣợc sử dụng bao gồm phƣơng pháp
cơ học, hóa học và sử dụng các giống kháng với TYLCV. Một số phƣơng pháp
phòng chống TYLCV có thể kể đến bao gồm:
- Phương pháp tránh nguồn lây bệnh
Thời gian hoặc hoặc địa điểm canh tác đƣợc bố trí nhằm tránh những nơi
hiện diện của quần thể bọ phấn thƣờng sẽ có tác động đáng kể đến việc giảm tỷ lệ
mắc bệnh do TYLCV trên đồng ruộng. Ở một số nƣớc nhƣ Israel, TYLCV lây lan
chủ yếu trong thời gian cuối mùa hè và đầu mùa thu mật độ bọ phấn cao điểm từ
tháng chín đến tháng mƣời một. Do đó, để tránh nguồn bệnh, cà chua đƣợc trồng
vào đầu mùa xuân, thƣờng là cuối tháng ba hoặc đầu tháng tƣ, và đƣợc thu hoạch 3
tháng sau đó. Cà chua sẽ đƣợc thu hoạch trƣớc khi các quần thể lớn bọ phấn đƣợc