TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
BÀI TIỂU LUẬN :
SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỂ PHÂN
TÍCH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ
VITAMIN B TRONG SỮA
Sinh viên thực hiện: Trần Thị Ngà
Nguyễn Thị Hạnh A
Đoàn Thị Lan
Nguyễn Thị Phượng
Nguyễn Thị Thảo
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về sữa
Sau sữa mẹ ,sữa bò là thực phẩm chứa các chất dĩnh dưỡng đầy đủ và cân đối
nhất .các sữa từ trâu,dê,ngựa cũng có các chất dinh dưỡng khác nhau do điều kiện
về giốn, điều kiện tự nhiên,hay điều kiện chăn nuôi. Mặc dù ở nước ta chăn nuôi
trâu sữa,dê sữa đã có từ khá lâu nhưng chất lượng sản phẩm thấp. Vì vậy cho đến
nay nguyên liệu chủ yếu cho nghành sữa Viêt Nam vẫn là sữa bò.
Các sản phẩm sữa có thể ở dạng rắn như các phomats ,dạng hạt đơn điệu như
trong các sữa bột,dạng đặc mịn màng đôi khi có thêm hương sắc của hoa trái như
trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc có đường, các loại sữa tươi
có đường từ nguyên liệu sữa bò người ta đã chế tác ra vô vàn các sản phẩm có
cấu trúc trạng thái hương vị khác nhau.
Trong sữa có các thành chính là: nước , gluxit, chất béo ,hợp chất nito, chất
khoáng ,chất khô tổng số, các chất khác( các chất xúc tác sinh học như vitamin
A,D,K,B1 các khí hòa tan ,enzyme). Trong đó vitamin B chiêm một hàm lượng
nhất định nhưng rất quan trong.ví dụ trong 100g sữa bột vitamin B1,B2 có khoảng
600-780μg,vitamin B6 chiếm khoảng 1200μg,vitamin B12 chiếm khoảng 2,5μg.
1.2 Giới thiệu về vitamin B
Khái niệm vitamin:Vitamin là hợp chất hữu cơ ,phần lớn có phân tử tương đối

Cuối cùng sau 6 năm nghiên cứu, ông kết luận: Nhiều thể bệnh (như scorbut, beri
beri…) đều do các chế độ ăn thiếu hụt một chất rất cần thiết (dù với số lượng rất
nhỏ) cho sự phát triển cơ thể sinh vật.
Năm 1911, sau khi gây bệnh beri beri thực nghiệm ở chim câu, Funk đã dùng một
liều lượng nhỏ 20mg chất phân lập từ bột cám và điều trị khỏi bệnh này, từ đấy mở
đường cho việc tìm hiểu đầy đủ về vitamin B.
Năm 1929, giải Nobel Y học được trao tặng cho hai nhà khoa học Eijkman và
Hopkins để ghi nhận công lao phát hiện vai trò của vitamin nhóm B.
1.2.2.Tìm hiểu về vitamin nhóm B:
Vitamin B hoạt động như là các coenzyme, giúp các enzyme (chất men) phản
ứng hóa học với các chất khác, và có liên quan đến quá trình tạo năng lượng.
Nhóm vitamin này còn có hữu ích trong việc làm giảm bớt chứng trầm cảm và lo
âu. Bổ sung đủ vitamin nhóm B rất quan trọng đối với người có tuổi bởi vì các chất
này rất khó hấp thụ khi tuổi càng cao.
Có nhiều trường hợp được chẩn đoán mắc chứng Alzheimer có nguyên nhân là
do sự thiếu hụt vitamin B12 với các vitamin B khác. Các vitamin B nên luôn luôn
sử dụng chung hơn là riêng lẻ bới vì chúng hoạt động cùng với nhau. Do đó, thiếu
hụt vitamin B này cho thấy các vitamin B khác cũng đang thiếu hụt. Mặc dù các
Vitamin nhóm B là một nhóm, chúng ta sẽ tìm hiểu riêng từng vitamin:
Vitamin B1 (Thiamine):
Vitamin B1 tăng cường tuần hoàn máu và hỗ trợ trong việc hình thành máu,
quá trình trao đổi chất carbohydrate , và trong sản xuất hydrochloride acid (HCl),
chất quan trọng trong hệ tiêu hóa bình thường.
Thiamine còn tối ưu hóa các hoạt động liên quan đến nhận thức cũng như các chức
năng não bộ. Sinh tố này còn có các tác động tích cực đối với năng lượng cơ thể,
sự tăng trưởng, sự ngon miệng, khả năng học hỏi, và còn cần thiết cho sự làm chắc
các cơ bắp của bộ máy tiêu hóa, tim, bao tử. Thiamine còn hoạt động như là chất
chống oxi hóa, bảo vệ cơ thể khỏi các dấu hiệu tuổi tác do quá trình lão hóa, uống
rượu bia, và hút thuốc. Bệnh phù thũng (beriberi), bệnh liên quan đến hệ thần kinh
hiếm gặp ở các nước phát triển, có nguyên nhân do thiếu hụt thiamine.

.
Các dấu hiệu cho thấy thiếu hụt vitamin B2 bao gồm nứt và loét ở mép miệng,
rối loại thị giác, viêm ở miệng và lưỡi, tổn thương da. Một số triệu chứng khác có
thể có là viêm da, choáng, rụng tóc, mất ngủ, nhạy ánh sáng, tiêu hóa kém, chậm
phát triển, phản ứng chậm.
Các nguồn thực phẩm giàu vitamin B2 được tìm thấy trong các thực phẩm sau:
phô mai, lòng đỏ trứng, cá, các loại đậu, thịt, sữa, gia cầm, rau bina, ngũ cốc
nguyên cám, và yogurt. Ngoài ra còn có măng tây, trái bơ, bông cải xanh, phúc bồn
tử, nấm, rau mùi tây…
Riboflavin dễ bị phá hủy nếu tiếp xúc với ánh sáng, kháng sinh, tác dụng của
rượu bia. Sử dụng quá nhiều riboflavin (trên 50 mg) có thể gây hại tới thủy tinh thể
và điểm vàng của mắt.
Vitamin B3 (Niacin, Nicotinic Acid, Niacinamide):
Vitamin B3 cần thiết cho tuần hoàn máu và một làn da khỏe mạnh. Nó hỗ trợ
các chức năng của hệ thần kinh; chuyển hóa carbohydrate, chất béo, và protein; và
trong sản xuất hydrochloric acid (HCl) cho hệ tiêu hóa. Vitamin B3 có đóng vai trò
trong bài tiết mật, dịch tiêu hóa và tổng hợp các hooc-môn tình dục. Niacin
(Nicotinic acid) hạ cholesterol và tăng cường tuần hoàn. Nó hữu ích cho điều trị
bệnh tâm thần phân liệt (schizophrenia), các chứng bệnh trí óc khác, và cũng tăng
cường trí nhớ. Bệnh tháo bì (nứt da, Pellagra) có nguyên nhân do thiếu niacin.
Các triệu chứng khác do thiếu niacin bao gồm: nhiệt miệng, mất trí, trầm cảm,
tiêu chảy, choáng váng, mệt mỏi, mất ngủ,… Niacin và niacinamide được tìm thấy
nhiều trong gan bò, men bia, bông cải xanh, cà rốt, phô mai, trứng, cá, sữa, bột
bắp, khoai tây… Các thảo dược có chưa niacin bao gồm cỏ linh lăng (alfalfa), chi
Ngưu bàng (burdock root), Chi Hoa phổi (mullein), bạc hà (peppermint)… Một ly
cà-phê cung cấp 3mg niacin.
Vitamin B5 (Pantothenic Acid):
Được biết đến như là vitamin chống stress, pantothenic acid đóng vai trò trong
sản xuất hooc-môn adrenal và hình thành của kháng sinh, hỗ trợ hấp thụ vitamin,
giúp chuyển hóa chất béo, carbohydrates và protein thành năng lượng. Pantothenic

6
góp một vai trò trong đề kháng ung thư và hỗ trợ chống xơ cứng
động mạch. Nó chống lại sự hình thành của một chất độc hóa học tên
homocysteine – gây hại cho cơ tim và tập trung cholestorol xung quanh cơ tim.
Pyridoxine hoạt động như là chất lợi tiểu, giảm các triệu chứng của tiền kinh
nguyệt. Puridoxine còn có lợi trong phòng tránh sỏi thận calcium oxalate, trong
chữa trị dị ứng, đau khớp, và hen suyễn.
Thiếu hụt vitamin B6 biểu hiện thiếu máu, động kinh, đau đầu, buồn nôn, loét
lưỡi, tróc da, ói mữa. Các dấu hiệu khác của thiếu hụt vitamin B6 là mụn, biếng ăn,
đau khớp, viếm kết mạc (conjunctivitis), trầm cảm, chống mặt, mệt mõi, vết
thương không lành, vấn đề thính giác, đơ cứng, da mặt dầu, rụng tóc, mất trí, ngứa
ran.
Hội chứng ống cổ tay cũng liên quan tới sự thiếu hụt vitamin B
6
Tất cả nguồn
thực phẩm đều cung cấp vitamin B
6;
tuy nhiên, các thực phẩm sau có lượng cao:
men bia, cà rốt, gà, trứng, cá , thịt, đậu, rau bina, hạt hướng dương, quả óc chó
(walnuts). Các nguồn khác bao gồm bơ, chuối, đậu, bông cải xanh, gạo nâu, cải
bắp. Cỏ linh lăng cũng có chứa Vitamin B
6.
Vitamin B12 (Methylcobalamin):
Vitamin B12 tham gia phản ứng tổng hợp thymidylate, một thành phần trong
phân tử ADN, cung cấp nguyên liệu để tổng hợp ADN, góp phần vào quá trình
phân chia tế bào và trưởng thành tế bào trong cơ thể. Thiếu vitamin B12 gây ảnh
hưởng rõ rệt lên những dòng tế bào có sự phân bào nhiều như các tế bào máu, tế
bào biểu mô (nhất là ở niêm mạc đường tiêu hóa).
Vitamin B tan trong nước, cần thiết cho quá trình trao đổi chất, hình thành tế
bào hồng cầu và duy trì hệ thống thần kinh trung ương. Có trường hợp mắc bệnh

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách hóa lý dựa vào ái
lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan
với nhau ,một pha động và một pha tĩnh . Pha động là một chất lỏng chảy trong cột
với một tốc độ nhất định còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân
chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phhur lên một chất mang rắn hay một
chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học cới các nhóm hữu cơ .Qúa trình
sắc ký xảy ra do các cơ chế : hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử.
Trong HPLC sắc kí lỏng cột là một trong những nhánh của phân tích công cụ
phát triển nhanh nhất, đuợc áp dụng cho nhiều loại mẫu hơn bất kì kỹ thuật tách
nào và có khả năng phân tích những hỗn hợp mẫu cực kì phức tạp trong hóa học và
trong sinh học.
Nghiên cứu kỹ thuật tách bằng LC là cần thiết vì nó sẽ tiếp tục dóng một vai trò
quan trọng trong tất cả những linh vực của phân tích hóa học, mặc dù có những
tiến bộ hon nữa trong các thuốc thử chọn lọc và những cải tiến trong các kỹ thuật
vật lí do luờng.
Với sự phát triển trong suốt những thập niên qua về thiết bị và sự nhồi cột, sắc
kí lỏng hiệu nang cao (HPLC) nổi lên nhu một phuong pháp duợc ua thích cho kỹ
thuật tách và phân tích dịnh luợng của rất nhiều loại mẫu.
Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có thể dò tìm luợng mẫu nhỏ dến 200 pg.
Những co hội áp dụng HPLC hầu nhu không giới hạn do HPLC dã trở thành một
công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghiệp.
Sắc kí lỏng dựa trên hiện tuợng: duới cùng một diều kiện, mỗi cấu tử trong một
hỗn hợp tuong tác với môi truờng xung quanh khác với tất cả các cấu tử khác.
Khi duợc sử dụng nhu một công cụ phân tích, LC có thể xác dịnh các cấu tử trong
một hỗn hợp và luợng của chúng trong mẫu. Khi kết hợp với những kỹ thuật phân
tích kháthì có thể nhận diện dịnh tính các cấu tử trong mẫu.
Phép tách duợc dòi hỏi khi:
› Một hỗn hợp quá phức tạp cho việc phân tích trực tiếp ví dụ do phổ.
›Các chất phân tích rất giống nhau ví dụ các dồng phân.
› Sự cần thiết phải diều chế một chất có dộ tinh khiết cao.

- Detector đo độ dẫn nhiệt,
- Detecor diode phát quang và diode mảng,
- Detector phổ khối lợng (khối phổ: MS, ICP-MS), v.v.
Tất nhiên phải tuỳ theo mỗi loại chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp để đạt đ ợc độ nhạy cao khi
phát hiện các chất, cũng nh đo định lợng chúng tốt nhất. Trong các loại trên, thì detector hấp phụ quang phân tử vùng
phổ UV hay UV-VIS hiện nay đang đợc dùng phổ biến nhất. Vì nó thích hợp cho nhiều loại chất, và lại không quá
đắt.
5. Trang bị ghi và hiện thị kết quả: Trang bị chỉ thị kết quả có nhiều loại, nhng đơn giản và phổ biến nhất là các
máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dới dạng các pic của các chất, rồi đến bộ tích phân kế (Intergrator), sau đó
máy tính kèm theo để xử lý kết quả và may in để in các kết quả tách.
Đó là 5 bộ phận chính cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống máy HPLC. Hình 1.2 là sơ đồ khối về hệ thống
này. Tất nhiên những hệ thống máy HPLC hoàn chỉnh, hiện đại, ngày nay còn có thêm 4 phần sau:
6. Bộ chơng trình gradient dung môi (pha động),
7. Bộ bơm mẫu tự động và pha loãng mẫu,
8. Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột tách sắc ký,
9. Máy tính và các chơng trình (phần mềm) điều khiển, kiểm soát toàn bộ hệ thống HPLC và xử lý kết quả tách, lập
báo cáo và in các kết quả sắc kí.
Một cách tổng quát chúng ta có thể mô phỏng cấu hình nguyên tắc của chúng theo
hình di õy :
CHNG 2: NI DUNG NGHIấN CU.
2.1. Phân tích định lợng
2.1.1. Phơng trình cơ bản để định lợng
Trong kỹ thuật HPLC, để định lợng một chất, ngời ta dựa theo hai phơng trình cơ bản sau đây về mối quan hệ giữa
pic sắc ký (diện tích, hay chiều cao) của chất phân tích với nồng độ C của chúng đợc bơm vào cột tách.
H = k.C
b
(4.1a)
S = k.C
b
(4.1b)

và S
i
= k
2
.C
i
(b)
Trong đó:
+ H
i
và S
i
là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i.
+ Ci là nồng độ của chất ứng với thời gian lu t
Ri
.
+ Còn k
1
, k
2
là các hằng số thực nghịệm, nó phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký của hệ pha.
Trong hai mối quan hệ này, quan hệ S
i
- C
i
theo biểu thức (b) có vùng tuyến tính rộng hơn quan hệ H
i
- C
i
theo biểu

x
của mẫu phân tích áp vào đờng chuẩn tơng ứng chúng ta sẽ phát hiện đợc nồng độ
của chất trong các mẫu phân tích đã đợc bơm vào cột tách sắc ký.
Bảng 2.1. Dẫy mẫu chuẩn và mẫu phân tích
Các chất Co C1 C2 C3 C4 C5
Chất PT X
i
(ppm)
0 1 2 3 4 5
Chất khác
Đo H (cm)
H
0
H
1
H
2
H
3
H
4
H
5
Đo S (cm
2
)
S
0
S
1

qun nhit 4
o
C).
Dung dch chun lm vic vitamin B2 nng 50, 25, 10, 5 ppm pha khi dựng.
H thng sc ký lng HPLC vi detector hunh quang FL hoc detector PDA
Cõn phõn tớch chớnh xỏc 0,0001g
Cõn k thut chớnh xỏc 0,01g
Bp un cỏch thy
Mỏy o pH
Bỡnh nún 250ml
Phu lc
Bỡnh nh mc 100, 200ml
L thy tinh nõu nỳt nhỏm loi 50ml, 100ml
Pipet cỏc c 5,10,20 ml
Bỡnh nh mc cỏc c.
* Cỏch tin hnh
- Cõn chớnh xỏc khong 0,1-10g mu cho vo bỡnh nún 250ml
-Thờm vo mi bỡnh 10ml HCl 1N v 90ml nc
-Thy phõn trong ni cỏch thy 100
o
C trong 1h
-Chnh pH ca dch thy phõn n pH=4,5 bng dd CH
3
COONa 2,5M
-Thờm vo mi bỡnh 0,1g men amilase
-t bỡnh vo t m 37
o
C trong 18h
-nh mc dung dch n 200ml hoc 250ml bng nc ct v lc
-Dịch lọc mẫu và chuẩn được bơm vào HPLC.

CHƯƠNG 3 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Như chúng ta đã biết một trong những thành phân dinh dưỡng quan trọng trong sữa đó là vitamin B. Có nhiều
phương pháp để xác định hàm lượng vitamin trong sữa nhưng một trong những phương pháp hiện đại được sử dụng
đó là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC). Trong nghiên cứu này phương pháp đường chuẩn được sử
dụng để định lượng hàm lượng của vitamin B (B2) trong sữa .chúng tôi đã khái quát về sữa ,vitamin B và cơ sở lý
thuyết của phương pháp HPLC cũng như xác định hàm lượng cụ thể của vitamin B2.
Bài tiểu luận trên được đóng góp qua sự tìm hiểu của các thành viên trong nhóm. Tuy nhiên vẫn không tránh được
những thiếu sót. Rất mong bạn đọc bổ sung ý kiến để bài làm của nhóm thêm đầy đủ và thuyết phục hơn
Xin chân thành cảm ơn!