ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHẠM THỊ THANH THÚY
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU VIỆC SỬ DỤNG
NẤM MỐC ĐỂ XỬ LÝ SINH KHỐI RƠM THÀNH
CÁC ĐƯỜNG DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT ETHANOL
Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH
LỜI CẢM ƠN
Khi bắt đầu để viết Luận văn, đặt biệt là Lời cảm ơn Em vô cùng xúc động
và xin gửi lòng cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Hoàng Quốc Khánh, trưởng
Phòng Vi Sinh Ứng Dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công
Nghệ Việt Nam. Thầy là người đã đưa ra ý tưởng về đề tài và luôn quan tâm,
hướng dẫn, động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn
thành tốt luận văn này.
Em xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn quý thầy cô Bộ môn Sinh hóa cũng
như quí thầy cô Khoa Sinh, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ
Chí Minh, đã tận tâm truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt
khóa học này.
Tôi xin cảm ơn anh Ngô Đức Duy, em Đào Thị Thu Hiền, cán bộ nghiên
cứu Phòng Vi Sinh Ứng Dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, đã quan tâm, giúp đỡ,
động viên tôi trong suốt thời gian làm luận văn.
Cảm ơn tất cả những người bạn thân thiết lớp cao học Hóa Sinh K15,
chúng ta đã cùng nhau vượt qua khó khăn và động viên nhau trong học tập.
Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và lòng biết ơn, con xin chân thành
cảm ơn ông bà, cha mẹ đã luôn hết lòng yêu thương, chăm sóc, dạy dỗ con. Gia
đình là điểm tựa, là niềm tin để con vươn lên.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 08 năm 2010.

4#[# *!Y=( :2Z&MY\*=]8=^!_`]3]aZ>EX!E
E@@@9EQ%;!@9E=I<(Trichoderma reesei 19
 ! "#$%&'()*
 Mục lục
E\EjOGQ&k&A:&E^
E\KjOG:#$ E^
E\NjOG,? K]
E\SH<lHQ;CK]
E\WjOG<Q'_m K]
4#b#!NR9>B=IE@@@$9E=%E=$@#####################################DG
E^E60;",[GKE
E^KA KE
4#4G#!NR9>B=I;!@$9E=%E=$@Q%*!Y=(:2Z&
MY\*=]8@?EE=$@##########################################################################DD
4#44#)Y=\:&>?c&$%>2d############################################################## DH
4#4D#)Y=\:&>?c=]$&2d############################################################## DT
23&De71fgh,
D#4#=@>A######################################################################################################## Db
KEE7&A;":& K^
KEEEnH K^
KEEK60;" K^
KEK?FQ;  N]
KEKE?FQ N]
KEKK IF;&Q;0;" NE
D#D*_23&_*_9ijk&######################################################################### CD
D#D#4#23&_*_\9*=8=*>Trichoderma reesei 32
KKEEo&0<#I=NK
KKEKo&0<;= NK
D#D#D#23&_*_\9*=8=*>=Ya%$<E Pichia stipitis và
Saccharomyces cerevisae 33

23&C)'1+f"71e
C#4#):$9*=:2Z&^!Y=(=o>&>MY%@2U&M2o&Ji
=$]=]$&\*=]8=^!_`]3###########################################################HD
NEEq03#a,?%&<)G,[SK
 ! "#$%&'()*
 Mục lục
NEK?# '  SN
NEN?I9C&0 SW
NES?I9C50 SJ
NEW?:&0&QG%&<)G,[HS\
C#D#):$9*=:2Z&^=MVa%$=i(MY%@2U&M2o&
Ji=]$&\*=]8=^!_`]3##############################################################FG
NKE?# '<'=&"#$(W]
NKK?I9C&0;50WE
NKN?:&0&QG%&<)G,[HWK
C#C#):$9*=:2Z&^!Y=(_aMnMY%@2U&M2o&
Ji=]$&\*=]8=^!_`]3##############################################################FD
NNE?# 'WK
NNK?I9C&0 WK
NNN?I9C50WS
NNS?:&0&QG%&<)G,[HWW
C#H#):$9*=%@2U&M2o&Ji=$]J>9ijk&Q%Jp&9ijk&
j&jMAE==E=]$&\*=]8=^!_`]3########################FS
NSE?# 'WJ
NSK?I9C&0;50WZ
NSN?:&0&Q,D2G,[H W\
C#F#):$9*=:2Z&^<=$=MV&aqL=@?\*=]8=^!
_`]3########################################################################################################## F[
NWE?# 'W\
NWK?I9C&0;50W^

- ++ +&+&,
- ++ / +&+&, 
,00
- 1 
-  23
- 4. 405.,00
- .67 ",#8&'96:7
- 77;.777:,;,<=
- 10 1(-(&0
- . (->> 0
- +?@ +,?00@
- 1 (1;0
- ++@ +&&0+>@
- ?.1 ?-,>%&,
- . .50
- 11 1(5&0
- 7? 7&
- 7+? 7A:&0B
- . >.C
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ Mục lục
DANH MỤC CÁC BẢNG

DEE,8FBGHIJ
DEKLM90FGC500*Trichoderma reesei EJ
DEN1# ;"&=50O$;;'&P;QKK
DKEFR%&<)3# &P&0NS
DKK1<(TU#V&9: NW
DKNFR%&<)3# &P&0X50NJ
DKS1<(TG%&<)5<#YI9&0;50NJ

DANH MỤC CÁC HÌNH

?)EE12FBG&0J
?)EK=&@>(;'=&@Z
?)EN12FBG&0\
?)ES1<#H;YH(DG^
?)EW12FBGE]
?)EJ6Y9,[RG:C,[D&0EW
?)EZ6Y9RG:C,[D5EJ
?)E\12Q&Ib\] EZ
?)E^A*50 KN
?)KE7&A:&H#5g0H($K^
?)KK7QTrichoderma reesei 6--\]ENN]
?)NELfY(=&h03#a,?O< 9:SK
?)NKLfY(=&h# 'I SS
?)NN+3(U#aI9&0 SJ
?)NS+3(U#aI950  SZ
?)NWLfY(=&h:&0&Q%&<)G,[HS^
?)NJ=&#f(=&hI9&0d50"#$(
 WE
?)NZ=&#f(=&hI9C&0;50I'0
`;'0`&Y#:7-WZ
?)N\=&#f(=&hC&0;50I'(a0&;
'(a0&b\]c]dEe J]
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
Luận Văn Thạc Sĩ Mở đầu
MỞ ĐẦU
Sự thay đổi khí hậu, khai thác nguồn tài nguyên thiên nhiên có giới hạn và
nhu cầu sử dụng năng lượng toàn cầu tăng là một vấn đề cần quan tâm cấp thiết.
Nhu cầu năng lượng toàn cầu tăng 50% vào năm 2025 và sự tăng trưởng kinh tế

dung dịch đệm Na-acetate trong quá trình thủy phân rơm.
5. Khảo sát ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt lên quá trình thủy
phân rơm.
6. Sử dụng bình lên men với các điều kiện thời gian, mật độ bào tử mốc,
pH và chất hoạt động bề mặt đã chọn ở các thí nghiệm trên.
B. Giai đoạn 2: Lên men ethanol từ các đường được tạo ra
7. Lên men ethanol trong điều kiện cung cấp oxi với hai mức độ khác
nhau với chủng Saccharomyces cerevisiae và Pichia stipitis
Nội dung và kết quả nghiên cứu của đề tài làm cơ sở cho việc ứng dụng
công nghệ lên men trong quá trình lên men sinh khối lignocellulosic. Từ những
kết quả nghiên cứu của đề tài với qui mô phòng thí nghiệm sẽ phát triển thành kỹ
thuật ứng dụng cho các mô hình sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulosic qui
mô lớn hơn, đáp ứng việc sản xuất nguồn nhiên liệu sinh học từ nguồn nguyên
liệu tái tạo để phục vụ đời sống.
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
2
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình sản xuất nhiên liệu sinh học
1.1.1. Tình hình trên thế giới và tiềm năng
Ngày nay, một số quốc gia sản xuất nhiên liệu sinh học (NLSH) như khí
sinh học, ethanol sinh học và dầu diesel sinh học từ nguồn nguyên liệu tái tạo
ngày càng gia tăng. Toàn cầu sản xuất ethanol sinh học tăng từ 17,25 tỷ lít trong
năm 2000 đến hơn 46 tỷ lít trong năm 2007, chiếm khoảng 4% của 1.300 tỷ lít
xăng tiêu thụ trên toàn cầu. Các chương trình ở Mỹ, châu Á và châu Âu dự kiến
tổng nhu cầu nhiên liệu ethanol sinh học có thể phát triển hơn 125 tỷ lít vào năm
2020 [45]
Hoa Kỳ là nước sản xuất lớn nhất thế giới về nhiên liệu ethanol sinh học,
chiếm gần 47% ethanol sinh học toàn cầu trong năm 2005 và 2006. EU cũng gia
tăng sự phát triển năng lượng từ sinh khối gỗ, chất thải và cây trồng nông nghiệp,

5 nhà máy sản xuất ethanol nhiên liệu đi vào hoạt động với tổng công suất
365.000 tấn/năm đủ để pha chế 7,3 triệu tấn xăng E5 [47].
Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam đã giao cho các công ty thành viên
Tổng Cty Dầu Việt Nam, Tổng công ty Dịch Vụ Tổng hợp dầu khí xây dựng
chiến lược phát triển vùng nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất của các nhà
máy Nhiên liệu sinh học. Công ty NLSH Phương Đông (OBF), đã ký văn bản
hợp tác với Sở NN và PTNN của tỉnh Bình Phước về hợp tác trồng cây sắn trên
địa bàn của tỉnh. Công ty còn làm việc với một số tổ chức tài chính như Tổng
công ty Tài Chính dầu khí, Ngân hàng BIDV, Ngân hàng Hàng Hải, Ngân hàng
Thương Mại cổ phần Việt Nam (Vietcombank), về khả năng cung cấp những
khoản vay tín dụng cho nông dân trồng sắn, cho những doanh nghiệp sản xuất và
kinh doanh, cung cấp sắn lát cho nhà máy ethanol Bình Phước [48].
Song song với việc phát triển vùng nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất
ethanol, Tổng công ty Dầu Việt Nam đang tiến hành hợp tác với Công ty
Idemitsu và Công ty NBF của Nhật Bản nghiên cứu triển khai việc nhập các
giống cây Jatropha có năng suất cao trên thế giới về trồng thử nghiệm tại Bình
Thuận, Việt Nam để làm cơ sở phát nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất dầu
diesel tương lai. Trên cơ sở chọn lọc và thuần hóa các giống quốc tế tại Bình
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
4
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
Thuận, giống Jatropha có năng suất cao sẽ được trồng đại trà tại các nơi đất khô
cằn, đất hoang hóa tại Bình Thuận, Ninh Thuận, Quảng Trị, Quảng Ngãi để thu
dầu Jatropha. PV OIL sẽ tiến hành nghiên cứu việc xây dựng nhà máy diesel sinh
học khi sản lượng dầu từ cây Jatropha và việc trồng cây Jatropha có hiệu quả
kinh tế đối với nông dân [48].
Tập đoàn Dầu khí Việt Nam cho biết, từ tháng 8 năm 2010 sẽ đưa sản
phẩm xăng sinh học E5 bán tại hơn 20 điểm ở TP Hồ Chí Minh, Hà Nội, Vũng
Tàu, Hải Phòng và Hải Dương. Sau đó, xăng sinh học E5 sẽ được mở rộng ra 3
cửa hàng ở Đà Nẵng, 3 cửa hàng ở Huế và 5 cửa hàng ở Cần Thơ. Và bắt đầu

nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm.
Các vi sợi được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi
sự tấn công của enzyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân.
1.2.1. Cellulose
Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose được tìm thấy ở
thành tế bào thực vật. D-glucose được liên kết với nhau bằng liên kết β (1 - 4)
glucosid với mức độ trùng hợp không nhỏ hơn 15.000 DP. Thành phần cellulose
của gỗ khác nhau giữa các loài từ khoảng 40-50%. Mức độ trùng hợp (DP) của
cellulose là trong khoảng 10.000-15.000 DP. [8]
Hình 1.1: Công thức hóa học của cellulose
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và lực Van
Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình. Trong
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
6
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị
tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình,
cellulose liên kết không chặt nên dễ bị tấn công. Có hai kiểu cấu trúc của
cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình.
Hình 1.2: Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) và kiểu chuỗi gấp
khúc (Folding chain) [8]
1. Kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed Fibrillar): phân tử cellulose kéo
thẳng và định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500Å, xếp xen kẽ
với vùng vô định hình.
2. Kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain): phân tử cellulose gấp khúc theo
chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm
a và b như trên hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các
mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại,
hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong
vùng vô định hình, các liên kết β - glucosid giữa các monomer bị thay đổi góc

khoảng 70 - 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường 6 (galactose-D, L-galactose,
D-mannose, L-rhamnose, L-fructose) và đường 5 (D-xylose, L-arabinose), acid
uronic (D-glucuronic acid) và chứa một lượng nhỏ nhóm acetyl. Thành phần của
hemicellulose phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu. Hemicellulose trong gỗ cứng
chứa chủ yếu là xylan (15-30%) trong khi ở gỗ mềm chứa galactoglucomannan
(15-20%) và xylan (70-10%) chiếm ưu thế. Thành phần cơ bản của hemicellulose
là β - D - xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β - (1,4).
Hình 1.3: Công thức hóa học của hemicellulose
Cấu tạo của hemicellulose đa dạng tùy vào từng loại nguyên liệu và có
một vài điểm chung gồm:
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
8
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
- Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1,4). Xylose là
thành phần quan trọng nhất. Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết
với vị trí 2 hoặc 3.
- Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide
hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và
với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại
ở dạng vô định hình và dễ bị thủy phân hơn so với cellulose.
1.2.3 Lignin
Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào
thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể
tách lignin ra hoàn toàn. Lignin là polymer, được cấu từ các đơn vị
phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), chất gốc là rượu
trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rượu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl
(H), chất gốc là rượu trans-p-coumary [9].
Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của lignin
Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả với
cellulose (không nhiều) độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào

khung xylan là các chuỗi ngắn của O-acetyl, α-L arabinofuranosyl, D-α
glucuronic và các acid phenolic cố định. Các chuỗi này được xem như các gốc R
phân nhánh tại vị trí gắn kết với các nguyên tử C của khung protein. Trong cấu
tạo của xylan, các xylose tồn tại trong liên kết β-1,4. Mức độ polymer ở xylan
cũng khác nhau, chẳng hạn, trong gỗ lá rộng và gỗ lá kim lần lượt là 150–200 và
70–130 đơn vị glucose/phân tử.
Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử. Nó khác nhau ở các loài
thực vật, ở các mô và tế bào. Do đó, sự thủy phân hoàn toàn của xylan đòi hỏi
một sự kết hợp mạnh của nhiều enzym hoạt động. Nó được thủy phân tốt bởi tổ
hợp endoxylanase (1,4-D-xylan xylanohydrolase, EC 3.2.1.8) và 3-xylosidase
(EC 3.2.1.37) do nhiều chủng vi khuẩn và nấm sinh tổng hợp.
1.4. Từ sinh khối cellulose thành Ethanol
Việc chuyển đổi cellulose thành nhiên liệu sinh học ethanol có ba bước cụ
thể là tiền xử lý, thủy phân và lên men. Các nguyên liệu trở nên dễ tiếp cận hơn
với các enzym sau khi tiền xử lý. Cellulose phân cắt tạo thành đường khử mà đó
là cơ chất cho quá trình lên men.
Cellulose là thành phần quan tâm chính và có thể xử lý bằng phương pháp
hóa học hoặc thủy phân bằng enzyme để tạo thành glucose làm chất nền chính
trong quá trình lên men ethanol. Hemicellulose có cấu trúc nhỏ gọn hơn so với
cellulose và có thể bị phân hủy đáng kể hoặc hòa tan trong tiền xử lý.
1.5. Đặc điểm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm men Saccharomyces
cerevisiae
* Phân loại
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Lớp: Saccharomycetes
Bộ: Saccharomycetales
Họ: Saccharomycetaceae
Giống: Saccharomyces
Loài: Saccharomyces cerevisiae

Loài: Pichia stipitis (Pignal 1967)
* Đặc điểm hình thái: Nấm men Pichia stipitis thuộc cơ thể đơn bào, tế
bào dạng hình oval.
* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa: Nấm men Pichia stipitis, nhiệt độ tăng
trưởng tối ưu là 28
0
C – 32
0
C, nhiệt độ lên men là 32
0
– 34
0
C, pH cho tăng trưởng
là 3 – 7, pH lên men là 3 - 8 [24].
* Đặc điểm sinh thái: Nấm men Pichia stipitis được phân bố vùng núi và
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
12
Luận Văn Thạc Sĩ Tổng quan tài liệu
vùng nhiệt đới
1.7. Đặc điểm, hình thái, sinh lý và sinh hóa nấm sợi Trichoderma reesei
* Phân loại
Trichoderma reesei là một loại nấm sợi sinh sản vô tính được phân lập từ
vải bông ở quần đảo Solomon vào thời Chiến tranh thế chiến thứ II, loài duy nhất
được phân lập là Trichoderma reesei QM6a, và được phân loại như sau [25]:
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Lớp: Deuteromycetes
Bộ: Moniliales
Họ: Moniliaceae
Giống: Trichoderma

dạng vô định hình, tác động yếu đến cellulose dạng kết tinh.
- Exo-ß-glucanase hay còn gọi là 1,4-ß-D-glucan cellobiohydrolase,
Avicelase, C1: Enzyme cắt đặc hiệu liên kết β-1,4 glucosid ở đầu tự do của
cellulose để tạo thành cellobiose. Không có khả năng phân giải cellulose dạng kết
tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng giúp cho enzym
endocellulase phân giải chúng. Cellobiohydrolase có hai loại khác nhau như
Trichoderma reesei CBH I và CBH II, trong đó, CBH I cắt chuỗi celluolose ở đầu
khử và CBH II cắt chuỗi cellulose ở đầu không khử [8].
- β-glucosidase hay còn gọi là cellobiase (EC.3.2.1.21): enzym này tham
gia thủy phân cellobiose, tạo thành glucose [44].
* Tính chất của enzyme cellulase
Thuộc tính của enzyme cellulase thay đổi tùy theo nguồn gốc của chúng.
Cellulases là một protein có tính axit. Enzyme cellullase có thể hoạt động ở dãy
pH từ 3 – 7, nhưng pH tối ưu là 4 – 5 và nhiệt độ tối ưu là 40 – 50°C. Cellulase
bị ức chế bởi các sản phẩm như glucose và cellobiose được tạo ra trong phản ứng
thủy phân. Glucose ức chế β-glucosidase và cellobiose ức chế Endo-ß-glucanase
và Exo-ß-glucanase [44].
* Vị trí phân cắt của enzyme cellulase
Trong tự nhiên, thủy phân cellulose cần có sự tham gia của tất cả 3 loại
enzyme endoglucanase, exolglucanase và β- glucosidase. Mỗi loại enzym chỉ
tham gia thủy phân một phần trong cellulose. Các loại enzyme này thay phiên
nhau thủy phân cellulose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose.
HVTH: Phạm Thị Thanh Thúy CBHD: TS. Hoàng Quốc Khánh
14

Trích đoạn Nguồn cacbon Lên men ethanol Nguyên vật liệu Hóa chất và môi trường Hoạt tính cellulase và xylanse

---