BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
QUỸ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ ĐỔI MỚI CÔNG NGHỆ
DO DOANH NGHIỆP THỰC HIỆN THEO NGHỊ ĐỊNH SỐ 119/1999/NĐ-CP CỦA CHÍN
H
PHỦ BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN
Tên đề tài:

Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng nhằm phát
triển một số cây trồng trọng yếu của tỉnh Sơn La
(MÃ SỐ ĐỀ TÀI) Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài:
(ký tên) (ký tên và đóng dấu)

KS. Phạm Văn Hùng Dương Hồng Hương

Bộ Khoa học và Công nghệ
Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia
(ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)

Bảng 4 Khả năng hòa tan lân của các chủng VSV phân lập được 20
Bảng 5 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Azotobacter
mới phân lập
21
Bảng 6 Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter 22
Bảng 7 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV phân lập
được
23
Bảng 8 Hàm lượng IAA thô hình thành của các chủng vi sinh vật
phân lập
25
Bảng 9 Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn
đối kháng
27
Bảng 10 Hoạt tính đối kháng nấm F. solani

của các chủng vi
khuẩn đối kháng
29
Bảng 11 Điểm sinh học của các chủng Azotobacter tuyển chọn 31
Bảng 12 Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 32
Bảng 13 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến hoạt tính sinh học
của VSV
32
Bảng 14 Phân loại an toàn sinh học của các chủng vi khuẩn đối
kháng
33
Bảng 15 Đánh giá an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật đến
cây trồng
35

40
Bảng 26 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật
*
(CNP1, AT4,
KT2, ĐK14) trong điều kiện hỗn hợp chủng
41
Bảng 27 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật
**
(PTP1, AT7,
KT8, ĐK31) trong điều kiện hỗn hợp chủng
41
Bảng 28 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật
***
(TGP2,
AT10, KT9, ĐK37) trong điều kiện hỗn hợp chủng
42
Bảng 29 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật (CNP1, AT4,
KT2, ĐK14) trong than bùn khử trùng
42
Bảng 30 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật PTP1, AT7,
KT8, ĐK31 trong than bùn khử trùng
43
Bảng 31 Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật TGP2, AT10,
KT9, ĐK37 trong than bùn khử trùng
43
Bảng 32 Sự thay đổi hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật
trong quá trình bảo quản ở điều kiện hỗn hợp
43
Bảng 33 Ảnh hưởng của các tổ hợp vi sinh vật đến năng suất và
khả năng phòng trừ bệnh thối rễ của cây ngô

chủng vi sinh vật hữu ích
53
Bảng 44 Thành phần lý hoá học của than bùn 54
Bảng 45 Khả năng tồn tại của các chủng VSV trong chế phẩm dạng
bột sau thời gian bảo quản ở 4
0
C
58
Bảng 46 Ảnh hưởng của chế phẩm đến một số chỉ số nông học của
ngô
59

Bảng 47 Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến các yếu tố
cấu thành năng suất và năng suất ngô
59
Bảng 48 Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến khả năng
phòng trừ bệnh thối rễ của cây ngô
60
Bảng 49 Kết quả thử nghiệm chế phẩm vi sinh đến sinh trưởng,
phát triển, năng suất đậu tương
61
Bảng 50 Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến khả năng
phòng trừ bệnh thối rễ của cây đậu tương
61
Bảng 51 Mức độ khô cành và tốc độ phát triển đốt trên cành hữu
hiệu ở các công thức thí nghiệm
62
Bảng 52 Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến khả năng
phòng trừ bệnh thối rễ cây cà phê
62

ủ 30 ngày
74
Bảng 65.
Một số chỉ tiêu so sánh giữa việc ủ không bổ sung và bổ
sung chế phẩm vi sinh vật
75
Bảng 66. Tỷ lệ nảy mầm của hạt cải trên nền các cơ chất 75
Bảng 67. Đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học của các chủng VSV
lựa chọn.
76
Bảng 68. Sự biến động về mật độ của các chủng VSV trong khối ủ
(CT1, CT2, CT3)
77
Bảng 69. Sự biến động về mật độ của các chủng VSV trong khối ủ
(CT4, CT5, CT6)
77
Bảng 70. Thành phần hóa học của cơ chất trước và sau khi ủ
Bảng 71. Đặc điểm hình thái và hoạt tính sinh học của các chủng vi
sinh vật
79
Bảng 72. Thành phần hóa học của các nguồn phế phụ phẩm trước
và sau xử lý
80
Bảng 73. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng đến sinh trưởng,
phát triển và năng suất của giống đậu tương ĐT84
85

v
Bảng 74. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại đậu
tương ĐT84

97
Bảng 85. Đánh giá hiệu quả kinh tế của phân HCVS đối kháng trên
giống ngô lai C999 tại Mộc Châu
98
Bảng 86. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới các yếu tố cấu
thành năng suất của giống cà phê Catimor tuổi 4 tại Mai
Sơn
98
Bảng 87. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại cây cà
phê chè Catimor tuổi 4 tại Mai Sơn
99
Bảng 88. Đánh giá hiệu quả kinh tế của phân HCVS đối kháng trên
giống cà phê chè Catimor tuổi 4
95
i
DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

TT Nội dung Trang
Hình 1: Khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn phân giải lân phân lập 18
Hình 2: Hoạt tính phân giải lân của một số chủng vi khuẩn phân lập 19
Hình 3: Hình ảnh phản ứng màu của các chủng Azotobacter với
thuốc thử Nessler
21
Biểu đồ 1: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter 22
Hình 4: Hình ảnh khuẩn lạc của một số chủng vi sinh vật phân lập
được
24

ii
Đồ thị 3: Đồ thị biến động nhiệt độ trong quá trình xử lý thân lá lạc 80
Đồ thị 4: Đồ thị biến động nhiệt độ trong quá trình xử lý thân lá đậu
tương
80
Hình 21: Thân lá lạc trước và sau xử lý 82
Hình 22: Thân lá đậu tương trước và sau xử lý 82 i
MỤC LỤC

Mục Nội dung Trang
I MỞ ĐẦU 1
II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
III
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
7
Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật
sử dụng cho sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
7
Nội dung 2: Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất phân
hữu cơ vi sinh đối kháng
7
Nội dung 3: Xây dựng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh
đối kháng
8
Nội dung 4: Xây dựng mô hình sử dụng phân hữu cơ vi sinh
đối kháng
8

30
5.1.6. Xác định an toàn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn để khẳng
định khả năng sử dụng cho nghiên cứu sản xuất phân bón
33
5.2. Xây dựng qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng 38
5.2.1. Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng qui mô phòng
thí nghiệm
38
SƠ ĐỒ 1 - QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV CHO CÂY
NGÔ
55
SƠ ĐỒ 2 - QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV CHO CÂY
ĐẬU TƯƠNG

56

SƠ ĐỒ 3 - QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV CHO CÂY CÀ
PHÊ
57
5.2.2. Xây dựng qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng từ
than bùn
62
QUI TRÌNH SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH ĐỐI
KHÁNG TỪ THAN BÙN
70
5.2.3. Xây dựng được qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
từ các nguồn phụ phẩm nông nghiệp
71
QUI TRÌNH SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH ĐỐI
KHÁNG TỪ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP

96
5.5.3. Đánh giá hiệu quả của phân bón HCVS đối kháng tới giống cà
phê Catimor tuổi 4 tại Mai Sơn
98
V. KẾT LUẬN 100
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 101
VII. PHỤ LỤC 103

1

I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, việc quá lạm dụng phân bón hoá học trong sản
xuất nông nghiệp đã dẫn tới rất nhiều diện tích đất canh tác trở nên bạc màu, chai
cứng và mất dần khả năng canh tác, những diện tích này ngày càng lớn và rất cần
thiết phải trả lại sự mầu mỡ, phì nhiêu của đất bằng cách áp dụng các biện pháp
thâm canh liên hoàn, trong
đó phân bón hữu cơ vi sinh đóng một vai trò hết sức
quan trọng.
Theo các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, cây trồng chỉ hấp thu được
35-40% tổng lượng Nitơ, 50-60 % tổng lượng Photpho và Kali bón trên đồng ruộng.
Lượng phân hoá học còn lại hoặc bị bốc hơi, rửa trôi hoặc ngấm vào trong đất. Theo
tính toán, hàng năm, có khoảng 1,0-1,2 triệu tấn Nitơ bón vào trong đất không có tác
dụng dinh dưỡng đối với cây trồng (bị bốc hơ

phân bón. Trong số đó quan trọng là các nhóm vi sinh vật cố định đạm, phân giải
2

lân, phân giải chất hữu cơ, kích thích sinh trưởng cây trồng, v.v Việc bổ sung các
loại vi sinh vật có khả năng phân huỷ xenlulo cao (Aspergillus, Trichoderma và
Penicillium), cố định nitơ tự do (Azotobacter), phân giải lân (Aspergillus,
Penicillium, Pseudomonas, Bacillus) và các chủng vi sinh vật đối kháng
(Pseudomonas, Bacillus) với mật độ 10
6
-10
8
cfu/g cùng các nguyên tố dinh dưỡng
như đạm dạng hữu cơ, lân dạng quặng photphorit (liều lượng 5%) đã làm tăng chất
lượng của phân bón lên đáng kể.
Phân hữu cơ vi sinh có chứa các vi sinh vật là nấm đối kháng sẽ giúp phòng trừ
nấm bệnh cho cây trồng. Tiến bộ này đã được nghiên cứu, công nhận từ nhiều năm
qua ở nhiều nước trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Việ
c sử dụng phân bón vi
sinh vật có thể cung cấp cho đất từ 30-60 kg N (đạm)/năm, tăng hiệu lực phân lân,
làm tăng độ phì nhiêu của đất. Các chế phẩm có chứa vi sinh vật còn làm tăng khả
năng trao đổi chất trong cây, nâng cao sức đề kháng và chống bệnh ở cây trồng, làm
tăng chất lượng nông sản, tăng thu nhập cho nông dân.
Xu hướng chung hiện nay trên thế giới là tạo ra các sản phẩm phân hữu cơ giàu
dinh dưỡng có b
ổ sung vi sinh vật hữu ích. Để góp phần phát triển nông nghiệp bền
vững, nhiều quốc gia trên thế giới đã khuyến khích người dân sử dụng phân bón
sinh học bằng cách trợ giúp giá bán cho nông dân đồng thời phát triển mạng lưới
khuyến nông, trong đó đặc biệt chú trọng công tác xây dựng các mô hình trình diễn
trên đồng ruộng về việc sử dụng hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh.
Mặt khác việc sử dụng phân hoá h

* Phân vi sinh vật cố định đạm: gồm nhiều loài vi sinh vật có khả năng cố định
N từ không khí. Đáng chú ý có các loài: tảo lam (Cyanobacterium), vi khuẩn
Azotobacter, Bradyrhizobium, Rhyzobium; xạ khuẩn Actinomyces, Klebsiella.
Phần lớn các loài vi khuẩn cố định đạm thường sống cộng sinh với các cây
họ đậu. Chúng xâm nhập vào rễ cây và sống cộng sinh trong đó, tạo thành các nốt
sần ở rễ cây. Chúng sử dụng chất hữu cơ của cây để sinh trưởng đồng thời hút đạm
từ không khí để cung cấp cho cây, một phần tích luỹ lại trong cơ thể chúng.
Tảo lam cộng sinh với bèo hoa dâu và hút đạm tích luỹ lại làm cho bèo hoa
dâu có hàm lượng đạm cao, trở thành cây phân xanh rất quý.
Thời gian gần đây, cùng với những tiế
n bộ của khoa học và công nghệ, các
nhà khoa học đã sử dụng công nghệ gen để tạo ra các chủng vi sinh vật cố định đạm
có nhiều đặc điểm tốt: khả năng cố định đạm cao, khả năng cộng sinh tốt. Công
nghệ sinh học cũng giúp tạo ra những chủng vi sinh vật có đặc tính cạnh tranh cao
với các loài vi sinh vật trong đất. Mặt khác, công nghệ sinh học đã cho phép các nhà
khoa học tách đượ
c gen quy định đặc tính cố định đạm từ vi khuẩn và đem cấy vào
nhân tế bào cây trồng, làm cho một số loài cây trồng cũng tạo được khả năng cố
định đạm như vi khuẩn.
Hiện nay trên thị trường phân bón nước ta, phân vi sinh vật cố định đạm
được bán dưới các tên thương phẩm sau đây:
Phân nitragin chứa vi khuẩn nốt sần cây đậu tương.
Phân rhidafo chứa vi khuẩn nốt sần cây lạc.
Azotobacterin chứa vi khuẩn cố định đạm tự do.
Azozin chứa vi khuẩn cố định đạm từ không khí sống trong ruộng lúa. Loại
phân này có thể trộn với hạt giống lúa.
* Phân vi sinh vật hoà tan lân: cây chỉ có thể hút được lân từ đất dưới dạng
hoà tan trong dung dịch đất. Vì vậy, cây chỉ có thể hút được lân ở dạng dễ tiêu trong
đất. Lân ở dạng khó tan trong đất cây không hút được. Vì vậy, có nhiều loại đất nh
ư

Người ta sử dụng những chế phẩm gồm tập đoàn vi sinh vật được chọn lọc
để phun lên cây hoặc bón vào đất làm cho cây sinh trưởng và phát triển tốt, ít sâu
bệnh, tăng năng suất. Chế phẩm này còn làm tăng khả năng nảy mầm của hạt, tăng
trọng lượng hạ
t, thúc đẩy bộ rễ cây phát triển mạnh. Như vậy, chế phẩm này có tác
động tương đối tổng hợp lên cây trồng.
Để sản xuất chế phẩm vi sinh vật kích thích tăng trưởng của cây, người ta sử
dụng công nghệ lên men vi sinh vật. Ở các nước phát triển người ta sử dụng các
thiết bị lên men tự động, công suất lớn. Ở nước ta, đã dùng kỹ thuật lên men trên
môi trường bán rắn
để sản xuất chế phẩm này, bước đầu cho kết quả khá tốt.
Những năm gần đây ở nước ta đang tiến hành khảo nghiệm chế phẩm EM
của giáo sư người Nhật Teruo Higa. Chế phẩm này được đặt tên là vi sinh vật hữu
hiệu (Effective microorganisms – EM). Đây là chế phẩm trộn lẫn một nhóm các loài
vi sinh vật có ích trong đó có vi khuẩn axit lactic, một số nấm men, một số xạ
khu
ẩn, vi khuẩn quang hợp, v.v Tại hội nghị đánh giá kết quả sử dụng EM tại Thái
Lan tháng 11/1989, các nhà khoa học đã đánh giá tác dụng tốt của EM như sau:
- Cải tạo lý hoá tính và đặc tính sinh học của đất.
- Làm giảm mầm mống sâu bệnh trong đất.
- Tăng hiệu quả của phân bón hữu cơ.
- Cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt, cho năng suất cao, phẩm chất nông sản
tốt.
- Hạn ch
ế sâu bệnh hại cây trồng.
- Góp phần làm sạch môi trường.
2.2.2. Phân hữu cơ vi sinh
Phân hữu cơ vi sinh gồm phân vi sinh vật và hợp chất hữu cơ (ít nhất đạt
15%). Ở nước ta, những quan điểm mới trong sản xuất nông nghiệp ngày càng
được nhận thức sâu sắc và đề cao trong giai đoạn hiện nay là hướng tới sản xuất

(2001-2004)

2.2.3. Phân hữu cơ vi sinh đối kháng
Phân hữu cơ vi sinh đối kháng về thành phần cơ bản như phân hữu cơ vi sinh,
trong đó có bổ sung thêm một số loại vi sinh vật (Bacillus, Pseudomonas,
Metarhizium, Beauveria ) có khả năng đối kháng cao với một số bệnh hại cây trồng
như: bệnh héo xanh, bệnh héo vàng, bệnh thối quả, thối thân, thối rễ, Nhờ vậy,
loại phân này có phổ tác dụng rất rộng trên nhiều lo
ại cây trồng, không những góp
phần làm tăng năng suất cây trồng mà còn tăng chất lượng nông sản, đảm bảo cho
sự phát triển một nền nông nghiệp hữu cơ bền vững.
Đây chính là sản phẩm cần được hoàn thiện, phát triển mạnh mẽ trong xu thế hội
nhập hiện nay.

2.3. Nhu cầu sản xuất và tiêu thụ phân hữu cơ vi sinh tại Sơn La
Theo thống kê, với nhu c
ầu sản xuất và tiêu thụ phân hữu cơ vi sinh tại tỉnh
Sơn La từ 2009 đến hiện nay là rất lớn

6

Theo từng loại cây

TT Loại cây Nhu cầu (tấn)
1 Cây chè 7.502
2 Cây cà phê 12.139
3 Cây dâu tằm 2.594
4 Cây mía 6.548
5 Cây ăn quả 27.272
6 Cây lương thực 12.186

Tổng số Cấp I Cấp II
1 Tân Lập - Mộc
Châu
Tấn 107.060 64.660 42.400
2 Chiềng Ve – Mộc
Châu
Tấn 105.503 49.790 55.713
3 Mường Chanh -
Mai Sơn
Tấn 35.979 4.100 31.879
4 Mường Lựm -Yên
Châu
Tấn 1.463 1.463
5 Bản Ban - Huy
Thượng
Tấn 18.220 18.220
Tổng 268.225 118.550 149.675
(Nguồn: Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Sơn La, 2009)

Theo khảo sát những mỏ than bùn này có hàm lượng chất hữu cơ cao, đạt trên
20%, đảm bảo đủ nguyên liệu và chất lượng cho sản xuất với công suất 5.000 tấn
phân hữu cơ vi sinh/năm.

III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1
: Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật sử dụng cho sản
xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Khảo sát và thu thập mẫu đất tại 3 vùng đặc thù chuyên canh cây cà phê, đậu
tương và ngô ở Sơn La.
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật thuộc 3 nhóm: phân giải lân, cố

La.
- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng từ
các nguồn nguyên liệu phế phụ phẩm.
- Đánh giá hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh đối kháng (sản xuất từ các nguồn
phế phụ phẩm nông nghiệp) trên cây trồng (cà phê, đậu tương và ngô).
Nội dung 3:
Xây dựng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Xây dựng, áp dụng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng trên
03 loại cây trồng trọng yếu (cà phê, đậu tương và ngô).
- Hiệu chỉnh, đề xuất quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng trên
03 loại cây trồng trọng yếu (cà phê, đậu tương và ngô).
Nội dung 4
: Xây dựng mô hình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Xây dựng 03 mô hình đánh giá khả năng thích ứng của phân hữu cơ vi sinh
đối kháng cho một số đối tượng cây trồng (cà phê, đậu tương và ngô).
- Tổ chức hội nghị đầu bờ tổng kết mô hình: tổ chức hội nghị và giới thiệu kết
quả sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng tới các hộ nông dân.
9

- Quảng cáo sản phẩm trên các phương tiện thông tin đại chúng.
Nội dung 5
: Đăng ký sản phẩm phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở.
- Khảo nghiệm và đăng ký “Phân hữu cơ vi sinh đối kháng Ngọc Trung”.
IV. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1.1. Vật liệu
- Mẫu đất thu ở các huyện Mộc Châu, Yên Châu, Mai Sơn, Sông Mã, thành
phố Sơn La.
- Giống đậu tương ĐT84
- Giống ngô lai CP999

2
O 0,05g; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường King B: Để phân lập và nhân sinh khối vi sinh vật kích thích
sinh trưởng nhóm Bacillus: Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K
2
HPO
4

(12,5%) 12 ml; MgS0
4
.7H
2
0 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường SPA. Để phân lập và nhân sinh khối vi sinh vật kích thích sinh
trưởng nhóm Pseudomonas: Saccharoza 20g, peptone 5g, K
2
HPO
4
0,5g,
MgS0
4
.7H
2
0 0,25g, nước cất 1000 ml.
+ Môi trường SX1 để nhân sinh khối các chủng VSV: đậu trắng 100 g;
K
2
HPO
4
0,5g; MgSO

K
2
HPO
4
12,5%) 16,3 ml; yeast extract 4g; casein hydrolyzat 8g; sucaroza 10g; agar
18g; nước cất 1000 ml.
10

+ Môi trường King B (KB): Để phân lập và thu sinh khối vi khuẩn đối kháng:
Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K
2
HPO
4
(12,5%) 12 ml; MgS0
4
.7H
2
0
(6,25%) 25ml; nước cất 1000ml.
+ Môi trường LB: Để nuôi cấy vi khuẩn đối kháng (Luria Broth: Difco
Bacto): tryptone 10g; difco bacto yeast extract 5g; NaCl 5g; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường PDA: Glucoza 20.0 g; Khoai tây 200.0 g; Thạch 15 g nước cất
1000 ml.
+ Môi trường Czapek- Dox: Sucrose 30.0g; NaNO
3
3.0g; MgSO
4
.7 H
2
O 0.5g;

4
: vết; FeSO
4
: vết; nước cất: 1.000 ml;
pH=7.

4.1.2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Azotobacter theo Erogov (1983)
- Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật (theo phương pháp Koch)
- Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler theo Lê Văn Khoa (1996)
- Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái theo Nguyễn Lân
Dũng (1998).
- Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật: Khả năng cố

định nitơ của các chủng vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đo hoạt tính
khử axetylen trên máy sắc ký khí. Azotobacter được nuôi cấy trên môi trường dịch
bán lỏng (4 ml môi trường trong lọ 10 ml) hoặc cắt toàn bộ phần rễ cây lạc cho và
bình tam giác 250 ml (đối với Rhizobium). Đậy kín lọ/bình bằng nút cao su, dùng
bơm tiêm thay thế 10% thể tích khí trong lọ/bình bằng khí axetylen. Ủ mẫu qua 24 h
rồi tiến hành phân tích mẫu trên máy sắc kí khí.
Kết quả tính toán được th
ực hiện theo công thức:
Trong đó:
M : Hoạt tính cố định nitơ được thể hiện bằng lượng Etylen tạo thành
V
1
: Lượng axetylen dùng để hoà vào bình hoà loãng khí chuẩn

.L
2
.22,4
M =
11

L
2
: Chiều cao píc của vạch mẫu trên vạch Etylen chuẩn trên băng tự ghi của
máy sắc kí khí
t: Thời gian ủ mẫu
22,4. 10
6
: Hệ số chuyển số ml khí Etylen sang số nmol khí Etylen
- Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng R.
solanacearum và F.oxysporum.
+ Thu mẫu: mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây lạc và
vừng khoẻ, đang thời kỳ ra hoa kết quả. Mẫu đất được thu ở độ sâu 15 cm ÷ 20 cm,
mỗi điểm thu 100g đất, mẫu được đựng trong từng túi polyetilen riêng biệt, ghi ngày
tháng n
ăm và địa điểm thu mẫu.
+ Phân lập và tuyển chọn: (theo Geels và Schippers -1983).
10 g đất được khuấy đều trong 90 ml nước cất khử trùng, lắc 30 phút, để lắng
tự nhiên, lấy phần dịch trong để phân lập vi khuẩn đối kháng. Mẫu thu từ các cây
được nghiền trong cối sứ có chứa 1 ml nước cất khử trùng, bỏ cặn, sử dụng phần
dịch để phân lập vi khuẩn đối kháng.
Bướ
c 1: Mỗi mẫu dịch trên được pha loãng đến nồng độ nhất định, sao cho
khi dùng 0,1 ml trải đều trên bề mặt môi trường KB hoặc PDA, ủ ở nhiệt độ 28
0

0
C trong 24 ÷ 48 giờ, các tế bào phát triển thành cụm khuẩn lạc hình tròn.
++ Dùng bông vô trùng loại bỏ các tế bào trong cụm khuẩn lạc.
++ Xử lý những tế bào còn sống sót bằng cách xông hơi chloroform từ 45 đến
60 phút.
++ Phun dung dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh đạt mật độ 10
7
÷10
8

tế bào/ml
kín bề mặt môi trường.
++ Ủ ở nhiệt độ 28
0
C ÷ 30
0
C, sau 48 giờ quan sát khả năng đối kháng của vi
khuẩn được thể hiện qua hiện tượng có hay không có vòng ức chế.
++ Dựa vào kích thước vòng ức chế để đánh giá hiệu lực đối kháng của chúng.
12

- Phương pháp Salkowsky cải tiến (Misra và cs, 1989): sử dụng để xác định
khả năng sinh tổng hợp IAA thô: Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong môi
trường có bổ sung 0,1% Triptophan. Sau thời gian nuôi cấy, ly tâm, thu được dịch
trong. Cho 2 ml dịch trong vào ống nghiệm chứa 8 ml thuốc thử Salkowsky cải tiến.
Lắc đều, để yên trong 20 phút, sau đó so màu trên máy với bước sóng 530nm. Hàm
lượng IAA tạo ra trong môi trường được tính toán trên cơ sở đồ thị IAA chuẩn.
Thuốc thử Salkowsky cả
i tiến: FeCl
3

vào ống nghiệm chưa 4,5 ml nước cất vô trùng. Trộn đều và pha loãng tiếp cho đến
khi đạt
được độ pha loãng thích hợp. Hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng
thích hợp nhỏ vào đĩa pettri có chứa môi trường Pikowskia gạt đều và ủ cho đến khi
xuất hiện khuẩn lạc. Giữ các khuẩn lạc riêng rẽ có vòng trong bao quanh trong ống
nghiệm giữ giống và tiếp tục làm sạch cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cấy
truyền những khuẩn lạc có vòng phân hủy sang ống nghiệm thạch nghiêng để giữ
giố
ng.
Môi trường giữ giống thạch nghiêng có thành phần như sau (g/l): Glucose:
10g; Cao nấm men; 6,5g; Ca
3
(PO
4
)
2
: 5g; (NH
4
)
2
SO
4
: 0,5g; Kl: 0,2g;
MgSO
4
.7H
2
O: 0,1g; MnSO
4
: 0,01g; FeSO

4
)
2
MoO
4
trong H
2
SO
4
10 N; Dung dịch axit Ascobic
1%; Dung dịch Chuẩn P
2
O
5
.
Cách làm dung dịch chuẩn P
2
O
5
:
Cân chính xác 0.1917g KH
2
PO
4
vào một lít nước cất hai lần trong bình định
mức. Dung dịch P
2
O
5
tiêu chuẩn có hàm lượng P

O
5.
Định lượng phốtpho trong dịch nuôi cấy: Nhiễm các chủng vi sinh vật vào
môi trường dịch thể Pikowskia và nuôi trong 2 ngày. Ly tâm mẫu thí nghiệm và đối
chứng ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 10
0
C sau đó thu dịch trong. Hút
0,5 ml dịch trong để định lượng. Sau khi đo OD của mẫu thí nghiệm và mẫu đối
chứng. Mật độ quang học (OD) thực tế bằng hiệu của hai mật độ quang học trên.
Căn cứ vào đường chuẩn P
2
O
5
tính được định lượng của P
2
O
5
hòa tan.
- Phương pháp đánh giá độc tính của vi khuẩn đối kháng trên cây trồng
Đất được chuẩn bị kỹ, trồng cây, khi cây được 1 tháng tuổi thì bổ sung trực
tiếp dịch lên men các chủng vi khuẩn nghiên cứu vào gốc cây sao cho mật độ đạt
khoảng 10
5
-10
6
tb/g đất, theo dõi tình trạng phát triển của cây và tỷ lệ cây chết sau 2
tuần.
- Phương pháp đánh giá độc tính của vi khuẩn sử dụng trên chuột bạch
Thử nghiệm trên chuột theo phương pháp LD
50