ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

(NGHIÊN CỨU BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Ở TRẺ EM
BẰNG ÁP DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR)
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Ký tên)
Mục lục
i

Danh sách các chữ viết tắt
ii

Danh sách các bảng
iii

Danh sách các hình
iv

Tóm tắt nội dung nghiên cứu (gồm phần tiếng Việt và tiếng Anh)
v PHẦN MỞ ĐẦU

1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3
1.1
Tình hình nghiên cứu ngoài nước
3
1.2
Tình hình nghiên cứu trong nước
3

Tỷ lệ biến chứng và các loại biến chứng
23
3.3.
Nội dung 3: Yếu tố tiên lượng lâm sàng – cận lâm sàng về khả năng
gây biến chứng
24
3.3.1.
Mối tương quan giữa các đặc điểm dân số học với sự xuất hiện biến
chứng trong BTCM
24
3.3.2.
Mối tương quan giữa các triệu chứng lâm sàng với sự xuất hiện biến
chứng trong BTCM
24
3.3.3
Mối tương quan giữa các dấu hiệu cận lâm sàng với sự xuất hiện
biến chứng trong BTCM
28
3.4.
Nội dung 4: Thực hiện xét nghiệm PCR trên các mẫu bệnh phẩm
29
3.5
Nội dung 5: Phân tích tỉ lệ bệnh nhân dương tính với EV71 theo thời
gian
30
3.6
Nội dung 6: Phân tích nồng độ vi rút trong bệnh phẩm
31

CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

CV
Coefficient of Variation (Hệ số biến thiên)
DNT
Dịch não tủy
EV
Enterovirus (vi rút đường ruột)
EV71
Enterovirus 71
EV non-71
Enterovirus khác 71
NĐVR
Nồng độ vi rút
NHRI
National Health Research Institute (Viện Nghiên cứu Sức khỏe
Quốc gia Đài Loan - Trung Quốc)
PBN
Phết bóng nước
PCR
Polymerase Chain Reation (Phản ứng khuếch đại chuỗi gen)
PH
Phết họng
PTT
Phết trực tràng
Real-time RT-
PCR
Phản ứng khuếch đại chuỗi gen với men sao chép ngược thời gian
thực
RT-PCR
Reverse Transcriptae Polymerase Chain Reation (Phản ứng khuếch
đại chuỗi gen với men sao chép ngược)

18
6
Triệu chứng khởi phát trong BTCM
19
7
Triệu chứng được quan tâm của gia đình đưa trẻ vào viện
21
8
Đặc điểm lâm sàng BTCM do EV71 và EV non-71
22
9
Biến chứng của BTCM
23
10
Mối tương quan giữa các đặc điểm dân số học và biến chứng
24
11
Các yếu tố nguy cơ biến chứng chung
25
12
Các yếu tố nguy cơ biến chứng nặng
26
13
Phân tích liên quan tình trạng dinh dưỡng trẻ và biến chứng
26
14
Các yếu tố nguy cơ tử vong
27
15
Kết quả xét nghiệm EV, EV71 của các mẫu bệnh phẩm

15
4
Hình ảnh khuếch đại của EV71-RNA trong các mẫu thử khi
thực hiện Realtime-PCR Taqman Probes
15
5
Đường cong chuẩn của Realtime-PCR Taqman Probe định
lượng EV71-RNA
15
6
Phân bố tuổi theo tháng
17
7
Ngày khởi phát của các triệu chứng sốt, thở nhanh và biến
chứng viêm màng não, viêm não
20
8
Phân bố ngày đến khám đầu tiên
21
9
Tương quan giữa tỷ lệ EV71 và BTCM, biến chứng theo thời
gian
30 vi
TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đặt vấn đề: Với tình hình diễn tiến phức tạp của Bệnh tay chân miệng (BTCM) trong
những năm gần đây cả về mặt dịch tễ cũng như lâm sàng, nhu cầu áp dụng một kỹ

vii
mức độ biến chứng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng nhưng tỉ lệ biến chứng rất cao đến
47,7%. Những biến chứng thường gặp là viêm màng não vô trùng (36,8%), viêm não
(9,1%), yếu liệt chi (8,4%), co giật (6%). Các trường hợp biến chứng nặng như viêm
não, phù phổi, viêm cơ tim chiếm 10%. Tử vong chung chiếm 1,4% trong toàn lô
nghiên cứu; 3% trong các ca có biến chứng và 10,9 % trong các ca có biến chứng
nặng.
Dựa trên các đặc điểm dân số học, các trẻ tử vong đều dưới 24 tháng. Tuổi của trẻ
tử vong nhỏ hơn trẻ mắc bệnh có biến chứng chung. Các yếu tố: sốt, sốt ≥ 38
o
5C, phát
ban ít, giật mình, nôn ói, thở nhanh, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, bạch cầu tăng >
13.000/mm
3
, neutrophile > 7.000/mm
3
, nhiễm EV71 có liên quan có ý nghĩa thống kê
với sự xuất hiện biến chứng. Các yếu tố như sốt trên 38
o
5C, phát ban ít, thở nhanh,
nhịp tim nhanh > 150 lần / phút, bạch cầu tăng > 16.000 /mm
3
có giá trị trong tiên
lượng biến chứng nặng (viêm não, phù phổi cấp, viêm cơ tim). Các yếu tố: nhịp tim
nhanh > 150 lần / phút, lactate trong DNT > 2,5 mmol/L, hôn mê, sốc, phù phổi hoặc
biến chứng viêm não có giá trị trong tiên lượng tử vong. Phân tích về sinh học phân tử,
nồng độ vi rút trong mẫu bệnh phẩm phết họng, phết trực tràng, DNT được lấy ở từ
ngày 2-4 của bệnh chưa thấy có mối tương quan rõ ràng với khả năng gây biến chứng
của EV71. Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo thời gian tương ứng với những cao điểm
của BTCM, nhưng chưa thấy tương quan rõ rệt với biến chứng.

3. Study the risk factors for prognosis of complications.
Study methods: the study applied prospective case-series design and systematically
random sampling method upon the study objects including all children clinically
diagnosed with HFMD in both outpatient and inpatient of Children’s Hospital 1. Three
– step RT-PCR process, including both conventional PCR and real-time PCR, was
employed to identify the presence of EV, EV71 and its viral concentration in collected
specimens such as throat swab, rectal swab, cerebrospinal fluid (CSF), and vesicles.
Demographic characters, clinical signs and symptoms, investigational signs, and
molecular analysis results were collected to learn the complications in HFMD in
children.
Results: Among 449 children will HFMD enrolled in the study, 419 (93.3%) were
positive on RT-PCR with EV presence in at least one specimen (throat swab, rectal
swab, CSF, or vesicle). Among them, throat swab was most sensitive (84.5%). HFMD ix
is endemic in the South of Vietnam, mostly among children less than 36 months of
age. It is an acute disease, typically manifesting with fever, site-specific rashes, mouth
ulcers, sleep disturbance and myoclonic jerks. These typical signs and symptoms help
diagnose accurately HFMD in 90% of the cases. Complications may appear very early
since the first day of the disease course. Complications vary from mild to very severe
with the overall prevalence of 47.7%. Common complications include aseptic
meningitis (36.8%), encephalitis (9.1%), acute paralysis (8.4%) and convulsion (6%).
Severe complications such as encephalitis, pulmonary edema and myocarditis are
present in 10% of the cases. The overall mortality rate is 1.4% in total, 3% among the
cases with complications and 10.9 % among the cases with severe complications.
In the study, all deaths were under 24 months of age. The average age among
deaths is less than that among children with complications. The factors such as fever,
fever ≥ 38
o

Cơ quan chủ trì: Bệnh viện Nhi Đồng 1
Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2007 đến tháng 4/2009 (đã được chấp thuận gia
hạn đến tháng 12/2009)
Kinh phí được duyệt: 450.000.000 đồng
Kinh phí đã cấp: 280 triệu theo TB 158/TB-SKHCN ngày 25/9/2007 và 125 triệu
theo TB 182/TB-SKHCN ngày 12/10/2009

2. Mục tiêu nghiên cứu:
Mục tiêu tổng quát: Xác định tác nhân gây bệnh (Enterovius 71 và Enterovirus
non-71) bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR, tiên lượng độ nặng và ứng dụng để dự
báo dịch trong BTCM ở trẻ em.
Mục tiêu chuyên biệt:
Xác định tác nhân gây BTCM do Enterovirus 71 và Enterovirus non-71 bằng
kỹ thuật Real-time RT-PCR;
Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng BTCM do enterovirus;
Xác định yếu tố tiên lượng biến chứng (lâm sàng, cận lâm sàng)

3. Nội dung nghiên cứu:
Chẩn đoán xác định nhiễm Enterovirus bằng qui trình kỹ thuật PCR qua 3
bước: Xác định Enterovirus, xác định EV71 (bằng RT-PCR), định lượng nồng
độ siêu vi EV71 bằng Real-time RT-PCR với đoạn mồi (primer) EV.
Mô tả đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng của BTCM ở trẻ em.
So sánh giữa nhóm có và không có biến chứng để tìm yếu tố tiên lượng lâm
sàng – cận lâm sàng về khả năng gây biến chứng, nhờ đó có thể chẩn đoán và
điều trị đặc hiệu sớm.
Phân tích tỉ lệ dương tính đối với từng loại mẫu bệnh phẩm nhằm đưa ra các
khuyến cáo phục vụ công tác chẩn đoán bệnh và điều trị. 2

phù phổi cấp gây tử vong cao và rất nhanh. Trên thế giới từ năm 1974 BTCM do tác
nhân EV71 đã xuất hiện ở hầu hết các nước, và gây ra khoảng 13 trận dịch lớn nhỏ.
Trong đó đáng lưu ý là các trận dịch năm 1973 và năm 1978 tại Nhật Bản, tại Bungary
và Hungary vào những năm cuối của thập kỷ 70 với 4 trận dịch gây nhiều ca tử vong
do biến chứng viêm thân não, tại Malaysia và Đài Loan (Trung Quốc) năm 1997 -
1998. Trong thời gian xảy ra dịch tại Đài Loan (Trung Quốc) năm 1998 đã có trên
100.000 ca mắc bệnh và 78 ca tử vong. [15], [16], [20], [24], [28], [29]
Hiện nay bệnh còn xuất hiện thường xuyên theo mùa trong năm tại các nước Đông
nam Á và Đài Loan (Trung Quốc). Tại Đài Loan (Trung Quốc) đã có chiến lược kiểm
soát bệnh bằng cách xác định tác nhân gây bệnh từ đầu năm nhằm dự đoán có xảy ra
dịch hay không để có kế hoạch phòng ngừa. Các nghiên cứu cho thấy khi số ca BTCM
tăng, nếu tác nhân là EV71 thì số ca viêm não và biến chứng nặng cũng sẽ tăng theo.
Tại Đài Loan (Trung Quốc) và Singapore đã thiết lập hệ thống giám sát cảnh báo dịch
BTCM ở cấp quốc gia trong nhiều năm qua. [12], [29]

1.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
BTCM hiện nay đã trở thành một trong những bệnh phổ biến trong nhi khoa ở phía
Nam. Theo số liệu thống kê tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 (BVNĐ1), tổng số lượt khám và
nhập viện do BTCM hàng năm tương đương với sốt xuất huyết Dengue. Bệnh lây qua 4
đường tiêu hóa và có nguy cơ phát triển thành dịch, đặc biệt là trong các môi trường
trẻ sống tập trung như nhà trẻ, mẫu giáo.
Từ năm 2002 – 2003, tại BVNĐ1 đã xuất hiện nhiều ca viêm não tối cấp, gây tử
vong rất nhanh ở trẻ nhỏ hơn 3 tuổi [11], [27]. Trong đó, một số trẻ có biểu hiện lâm
sàng điển hình của BTCM. Qua nghiên cứu tại BVNĐ1 phối hợp với Viện Pasteur
Thành phố Hồ Chí Minh (TPHCM), lần đầu tiên đã phân lập được EV71 trong phân
trẻ BTCM có biến chứng viêm não tại Việt nam vào ngày 04 tháng 8 năm 2003 [11].
Từ đó đến nay, số ca mắc BTCM gia tăng nhanh hàng năm. Năm 2006 đã có trên 2000

bệnh sớm hơn, đồng thời dự báo dịch sớm để có biện pháp khống chế dịch bệnh kịp
thời.
Nghiên cứu này nhằm giải đáp 2 giả thuyết chính :
- Sự gia tăng tỉ lệ bệnh nhân dương tính với EV71 có liên quan với cao điểm dịch
BTCM, nhờ đó có thể ứng dụng tỉ lệ này để dự báo dịch và can thiệp sớm.
- Nồng độ vi rút EV71 từ bệnh phẩm có liên quan đến mức độ biến chứng của
BTCM, nhờ đó có thể tiên lượng bệnh và điều trị sớm nhằm giảm biến chứng
và tử vong, đồng thời việc điều trị có chọn lọc cũng làm giảm đáng kể chi phí
điều trị do chi phí điều trị bằng gamma globuline rất cao.

6
CHƢƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung 1:
Bệnh phẩm: Các mẫu bệnh phẩm dịch não tủy (DNT), phết họng, phết trực tràng
được tách chiết theo qui trình, lưu giữ ở nhiệt độ âm 70
o
C cho tới khi thực hiện phản
ứng.
Hệ thống chuẩn và chứng dƣơng: Hệ thống chuẩn dựa vào chuẩn gốc do Viện
Nghiên Cứu Sức Khỏe Quốc Gia Đài Loan-Trung Quốc (National Health Research
Institute: NHRI) cung cấp là RNA của EV71 dưới dạng dung dịch có nồng độ 10
10

copies/ml. Dùng chuẩn này pha loãng thành các nồng độ chuẩn cho phép định lượng
EVs-RNA và làm chứng dương cho phản ứng Revere transcriptase PCR (RT-PCR)
định tính. Để có mẫu chuẩn, chúng tôi dùng bệnh phẩm có phản ứng PCR dương tính


7
vòng trong 1 phút. Chuyển qua ống thử thứ 2, cho thêm vào 500 l AW1, ly tâm 8.000
vòng trong 1 phút. Chuyển qua ống thử thứ 3, cho thêm vào 500 l AW2, ly tâm 8.000
vòng trong 1 phút. Chuyển qua ống thử thứ 4, cho thêm vào 500 l ethanol (96-100%),
ly tâm 8.000 vòng trong 1 phút. Chuyển qua ống thử thứ 5, ly tâm 14.000 vòng / phút
trong 3 phút. Sau đó chuyển MinElute Column qua một ống thử Eppendorf 1.5ml mới,
mở nắp và ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút. Thêm 30 l AE (nước cất
không có RNAse), ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 10 phút. Sau đó ly tâm 14.000
vòng trong 1 phút, cẩn thận hút 30 l vào ống thử Eppendorf 1.5ml mới. Dùng 10 l
dung dịch nổi này cho phản ứng Realtime-PCR.
Chứng âm: sử dụng môi trường vận chuyển làm chứng âm ly trích và dung dịch
TE1X làm chứng âm cho phản ứng Realtime-PCR.
Thực hiện chẩn đoán bằng phản ứng khuếch đại chuỗi gien có sao chép ngƣợc:
Đối với mỗi mẫu bệnh phẩm, để xác định chẩn đoán chúng tôi áp dụng Qui trình chẩn
đoán 3 bước do Viện Nghiên Cứu Sức Khỏe Quốc Gia Đài Loan chuyên giao (đính
kèm qui trình thực hiện), gồm 3 bước: xác định EV bằng RT-PCR với đoạn mồi EV
(bước 1), nếu dương tính sẽ thực hiện tiếp bước 2 bằng phản ứng RT-PCR với đoạn
mồi EV71, trường hợp bước 2 có phản ứng dương tính sẽ thực hiện phản ứng Real-
time RT-PCR với đoạn mồi EV để xác định nồng độ vi rút trong mẫu bệnh phẩm.
Định tính EV-RNA và EV71-RNA bằng kỹ thuật RT-PCR: Hai cặp mồi đặc hiệu
cho EV (EV-F và EV-R) và EV71 (F-primer1705 và R-primer 2036) được thiết kế
nằm trong vùng VP1 của EV và EV71 genome cho sản phẩm khuếch đại theo thứ tự
lần lượt là 148bp và 331bp do NHRI cung cấp. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong
các phản ứng PCR như sau:
EV-F: 5'-CCCCTGAATGCGGCTAATC-3'
EV-R: 5'-GATTGTCACCATAAGCAGC-3'
F-primer1705: 5'-GTGGCAGATGTGATTGAGAG-3'
R-primer 2036: 5'-GTTATGTCTATGTCCCAGTT-3'
Sử dụng cặp mồi EV-F và EV-R trong phản ứng RT-PCR đầu tiên bằng bộ thuốc

o
C / 5phút trong một chu kỳ; tiếp theo là 40
chu kỳ với 94
o
C / 30 giây, 50
o
C / 30 giây, 72
o
C / 01 phút; và cuối cùng là 72
o
C / 10
phút trong một chu kỳ. Tương tự như trên, sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan sát
dưới ánh sáng UV sau khi điện di trên thạch 1,5% được chuẩn bị với dung dịch đệm
0.5X TBE. Mỗi lần thực hiện phản ứng RT-PCR đều chạy kèm theo một chứng dương
và hai chứng âm (một chứng âm ly trích và một chứng âm phản ứng PCR).
Định lƣợng EV71-RNA bằng kỹ thuật REAL-TIME PCR với đoạn dò
TAQMAN:
Thử nghiệm Realtime-PCR được phân tích trên máy LightCyler (Roche
Diagnostics). Bộ thuốc thử LightCycler RNA Amplification Kit Hybprobe (Roche
Diagnostics) đã được sử dụng trong phản ứng này. Đây là bộ thuốc thử cho phép sử
dụng một bước Realtime-PCR trên ống mao quản 10µl có chứa 0.4µl MgCl
2
, 0.5µl
EV-F, 0.5µl EV-R, 0.1µl TaqMan Hybprobe, 0.2 µl enzymes, 2 µl RNA ly trích. Phản
ứng Realtime-PCR được thực hiện với các bước sau: 55
o
C / 20 phút trong một chu kỳ,
95
o
C / 30 giây trong một chu kỳ; tiếp theo là 45 chu kỳ với 95

Amphotericin B
- Xử lý bệnh phẩm và ly trích RNA từ bệnh phẩm: Sử dụng QIAamp MinElute
Virus Spin kit (QIAGEN 57704) để ly trích RNA từ bệnh phẩm theo qui trình
chuẩn của NHRI (Đài Loan - Trung Quốc).
- Qui trình thử nghiệm One-Step RT-PCR đối với Enterovirus (NHRI, Đài Loan -
Trung Quốc)
o Thuốc thử : QIAGEN One-Step RT-PCT kit (57704)
o Máy PCR : Genius (Techne, England)
o Đoạn mồi (Primer) : EV-F, EV-R, 148bp
o Chương trình :
50
o
C 30 phút 1 chu kỳ
95
o
C 05 phút 1 chu kỳ
94
o
C 30 giây }
58
o
C 30 giây } 40 chu kỳ
72
o
C 01 phút }
72
o
C 10 phút 1 chu kỳ
04
o

10
- Qui trình thử nghiệm One-Step TaqMan probe for Real-time RT-PCR đối với
EV (NHRI, Đài Loan - Trung Quốc)
o Thuốc thử: LC RNA Amplification Kit Hybprobe (Roche Diagnostics)
o Máy RealTime PCR : Light Cycler 1.5 (Roche Diagnostics)
o Đoạn mồi (Primer) : EV-F, EV-R, Amplicon size: 148bp
o Chương trình :
RT (sao chép ngược): 55
o
C 20phút 01 chu kỳ
Denaturation (tháo xoắn): 95
o
C 30giây 01 chu kỳ
Amplification (khuếch đại):95
o
C 05 giây
57
o
C 15 giây 45 chu kỳ định lượng
72
o
C 06 giây
Cooling (làm lạnh): 40
o
C 30 giây 01 chu kỳ

2.2 Nội dung thứ 2 đến nội dung 6:
Đối tƣợng nghiên cứu:
- Tất cả bệnh đến khám hay nhập viện tại bệnh viện nhi đồng 1 có chẩn đoán lâm
sàng BTCM.

RT-PCR là 67%.
- Kết quả nghiên cứu hợp tác giữa BVNĐ1 và Viện Pasteur TPHCM, tỉ lệ
EV71/EV là 50%.
- Tổng số bệnh nhân tay chân miệng đến khám trong năm 2006 tại BVNĐ1 là
2225 bệnh nhân.
- Ước tính cỡ mẫu nghiên cứu mô tả dựa vào chương trình Epi Info 2002:
Ước tính tổng số ca nhiễm EV71 được phát hiện: 740 = 67% x 50% x 2225
Tỉ lệ biến chứng của BTCM do EV71: 50%
Sai số xa nhất chấp nhận được: 5% (10% x 50%)
Alpha: 95%
Đưa tất cả thông số trên vào chương trình tính cỡ mẫu trong EPI INFO 2002:
n (EV71) = 125 x n (bệnh tay chân miệng) = 400
Các bệnh phẩm đƣợc thu thập trong nghiên cứu để thực hiện xét nghiệm PCR:
- Phết trực tràng : bằng 1-2 que và cho ngay vào môi trường chuyên chở vi rút
- Phết họng : 1- 2 que rồi cho vào môi trường chuyên chở vi rút
- Phết bóng nước còn tươi và cho vào môi trường chuyên chở vi rút.
- DNT: 1-2 ml DNT được cho vào môi trường chuyên chở vi rút. 12
Tất cả bệnh nhân được lấy mẫu phết họng, phết trực tràng và phết bóng nước
(nếu bóng nước chưa khô). Bệnh nhân nghi ngờ có biến chứng thần kinh sẽ được
chọc dò tủy sống để lấy bệnh phẩm dịch não tủy.
Bệnh phẩm thực hiện xét nghiệm PCR được cho ngay vào môi trường chuyên
chở: EMEM-Earle + Gelatin + Antibiotics + Amphotericin B.
Thực hiện xét nghiệm chẩn đoán và điều trị:
- Thực hiện tất cả các xét nghiệm chẩn đoán theo phân loại độ nặng và điều trị
theo phác đồ điều trị BTCM tại bệnh viện hiện nay.
- Trường hợp có biểu hiện thần kinh, thực hiện xét nghiệm ion đồ, đường huyết,
xét nghiệm sinh hoá - tế bào dịch não tuỷ, nuôi cấy dịch não tuỷ và cấy máu.

5
copies/ml.

Từ kết quả phản ứng Real-time PCR dựa trên chuẩn gốc, chúng tôi thiết lập đường
cong chuẩn cho phản ứng. Kết quả (hình 2) cho thấy đường cong chuẩn của phản ứng
có tương quan tuyến tính khi nồng độ EV71-RNA của mẫu chuẩn nằm trong giới hạn
từ 10
2
đến 10
5
copies/ml.
Để đánh giá mức độ tin cậy của phản ứng Real-time PCR thực hiện tại phòng thí
nghiệm BVNĐ1, chúng tôi nghiên cứu về độ lập lại của kết quả phản ứng cho một
mẫu chuẩn được thực hiện phản ứng trên nhiều ống nghiệm khác nhau trong cùng một
lần chạy phản ứng, cũng như những lần thực hiện phản ứng khác nhau.
Hình 1: Chu kỳ ngưỡng của hệ thống mẫu
chuẩn pha loãng có nồng độ từ 10
2

bình
Độ
lệch
chuẩn
CV
(%)
10
5

26,24
26,50
26,79

10
5

26,5
0,22
1
10
4

30,02
30,26
30,16

10
4

30,15

Độ lập lại của phản ứng là khả năng lập lại kết quả xét nghiệm của cùng một mẫu
thử, khi phản ứng được thực hiện nhiều lần khác nhau.
Để khảo sát độ lập lại của các mẫu thử lâm sàng, chúng tôi sử dụng 3 mẫu ly trích
có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 trên xét nghiệm PCR định tính, mỗi mẫu
lập lại 4 lần trong cùng một lần chạy phản ứng real-time PCR, và chạy như vậy trong 3
lần khác nhau. Kết quả trong bảng 3 và 4 cho các giá trị về nồng độ của mẫu mỗi lần
lập lại trong một lần phản ứng và trong các lần chạy phản ứng khác nhau.

Mẫu
số
EV71-RNA
(Copies/ml)
Trung
bình
Độ
lệch
chuẩn
CV
(%)

Mẫu
số
EV71-RNA
(copies/ml)
/ngày
Trung
bình

6,1
Ống 2: 2,4 x
10
5

Lần 2: 2,7 x
10
5

Ống 3: 2,6 x
10
5

Lần 3: 2,8 x
10
5

Ống 4: 2,3 x
10
52
Ống 1: 8,9 x
10
3

8,77
x 10
3


Ống 4: 8,4 x
10
3Bảng 1: Độ lập lại của chu kỳ ngưỡng (Ct) ứng
với các nồng độ chuẩn trong 3 lần chạy liên tiếp
của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát
hiện và định lượng EV71

Bảng 2: Dữ liệu của đường cong chuẩn
với FAM-490 (Ct)
Bảng 3: Sự biến thiên trong một lần phản
ứng của phản ứng Realtime-PCR Taqman
Probes phát hiện và định lượng EV71
Bảng 4: Sự biến thiên giữa các lần khác
nhau của phản ứng Real-Time PCR Taqman
phát hiện và định lượng EV71 15
Hình 3: Độ lập lại của 4 lần chạy của
cùng một mẫu trong cùng một đĩa

Mẫu
số
EV71-RNA
(Copies/ml)
Trung


5,2

3
Lần 1: 7,77
x 10
7

7,79
x 10
7

0,25
3,1
Ống 2: 7,9 x
10
7

Lần 2: 8,1 x
10
7

Ống 3: 7,4 x
10
7

Lần 3: 7,5 x
10
7


Kết quả của các mẫu lâm sàng cũng có tương quan tuyến tính với hệ số góc tương
tự với mẫu chuẩn (hai đường cong chuẩn trùng khớp nhau) (hình 5).
Kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương pháp Realtime-PCR Taqman Probes với
ưu điểm sử dụng các mồi đặc hiệu và đoạn dò đặc hiệu giúp tạo ra các sản phẩm đặc
hiệu sẽ làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng. Chu kỳ ngưỡng được ghi nhận khi mà tín
hiệu huỳnh quang của mẫu phát ra cao hơn tín hiệu nền. Dựa trên chu kỳ ngưỡng của
các chất chuẩn và số bản sao của các chuẩn đã biết mà từ đó người ta có thể định
lượng được số bản sao RNA có trong mẫu bệnh phẩm.
Hệ thống mẫu chuẩn được chúng tôi sử dụng dựa trên chuẩn gốc do NHRI cung
cấp, từ đó chúng tôi có gam chuẩn với nồng độ từ 10
2
copies cho tới 10
7
copies/ml.
Khi thực hiện Realtime-PCR Taqman Probes, chúng tôi có kết quả phản ứng với hệ số
tương quan là 1, độ cong là -3,478, hiệu suất PCR là 93, 9 và phương trình Y= -
3,478X + 44,151. Các giá trị chu kỳ nguỡng Ct của các chuẩn này ổn định trong các
lần chạy định lượng khác nhau (CV< 10%) (bảng 1), cho thấy mức độ ổn định của
định lượng EV71 bằng Taqman Probes. Ngoài ra với 4 nồng độ này cách nhau 10 độ
pha loãng thì chu kỳ ngưỡng của chúng đi từ chuẩn có nồng độ cao nhất cho đến nồng
độ kế tiếp cách nhau 3, 3 cho đến 3,7. Điều này nói lên tính chất tuyến tính của phản
ứng.
Về độ lập lại của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes, kết quả các số liệu
trong bảng 2 cho thấy các giá trị số lượng bản sao của các mẫu mỗi lần lặp lại trong
một lần phản ứng và trong các lần chạy phản ứng khác nhau có hệ số biến thiên
CV<10%, chứng tỏ không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong một lần chạy và
giữa các lần chạy khác nhau, điều đó cho thấy phản ứng Realtime-PCR Taqman
Probes định lượng EV71-RNA có tính đồng nhất, không thay đổi trong các ống thử
phản ứng khác nhau có cùng nồng độ mẫu thử.
Về độ chính xác của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes, khi tiến hành thử