Bộ KH CN
Viện Thú y
Bộ KH CN
Viện Thú y

Bộ khoa học - công nghệ
Viện Thú Y
86, Đờng Trờng Chinh - Đống Đa Hà Nội Báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.16:

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất
và sử dụng KIT chẩn đoán
một số bệnh nguy hiểm ở vật nuôi
Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Trơng Văn Dung 6101
19/9/2006Hà Nội 2005 Bản quyền 2005 thuộc Viện Thú y.

KIT ELISA chẩn đoán Salmonella ở gà
công nghiệp bằng công nghệ sản xuất
kháng nguyên bằng vi khuẩn biến nạp
TS Trơng Nam Hải
Viện Công nghệ
sinh học
5
KC04-16 05
KIT chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng trâu
bò bằng kỹ thuật miễn dịchn -Bệnh lý
PGS TS Trơng Văn Dung
Viện Thú y
Danh sách các cán bộ thực hiện
đề tài KC04.16

I. Cán bộ tham gia chủ chốt
STT Họ và tên Học vị Cơ quan công tác Chữ ký
A Chủ nhiệm đề tài

Trơng Văn Dung PGS. TS. Viện Thú y
B Cán bộ tham gia chính

1 Đinh Thơng Vân
TS
Viện Côn
g
n
g
hệ
sinh học

11 Nguyễn Thế Vinh BSTS ViệnThú Y
12 Nguyễn Thuý Duyên Th.S ViệnThú Y
13 Nguyễn Thị Bơ KTV ViệnThú Y
14 Đỗ Ngọc Thuý TS Viện Thú y
15 Nguyễn Thu Hằng BSTY Viện Thú y
16 Âu Xuân Tuấn BSTY Viện Thú y
STT Họ và tên
Học vị
chuyên môn
Cơ quan công tác
17 Phạm Bảo Ngọc TS Viện Thú y
18 .Đào Thị Hảo Th.S Viện Thú y
19 Văn Thị Hờng BSTY Viện Thú y
20 Nguyễn Xuân Huyên BSTY Viện Thú y
21 Vũ Ngọc Quý BSTY. Viện Thú y
22 Nguyễn Bích Thuỷ BSTY Viện Thú y
23 Phạm Thuý Hồng TS Viện Công nghệ Sinh học
24 Nguyễn Thanh Thuỷ CN Viện Công nghệ Sinh học
25 Nguyễn Thanh Lịch CN Viện Công nghệ Sinh học
26 Lê Hữu Cờng Th.S Viện Công nghệ Sinh học
27 Lê Thu Hồng CN Viện Công nghệ Sinh học
28 Dơng Cẩm Thuý CN Viện Công nghệ Sinh học
29 Đỗ Thị Huyền Th.S Viện Công nghệ Sinh học
30 Nguyễn Thị Trung Th.S Viện Công nghệ Sinh học
31 Trần Ngọc Tân CN Viện Công nghệ Sinh học
32 Tô Long Thành TS Viện Thú y
33 Hoàng Xuân Nghinh Th.S Viện Thú y
34 Đỗ Tuấn Cơng Th.S Viện Thú y
STT Họ và tên
Học vị


Trang
1
5
Tóm tắt báo cáo
Danh mục các từ viết tắt
Lời nói đầu
9
Chơng I: Tổng quan tài liệu
17
1.1. Bệnh đốm trắng ở tôm
1.1.1. Tình hình dịch bệnh
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nớc
17
18
19
1.2. Bệnh Dịch tả lợn
21
1.2.1. Tình hình bệnh Dịch tả lợn trên thế giới
1.2.2. Tình hình bệnh Dịch tả lợn trên ở Việt Nam
1.2.3. Dịch tễ bệnh Dịch tả lợn
1.2.4. Chất chứa mầm bệnh và độc lực của virus
1.2.5. Sinh bệnh học
1.2.6. Một số đặc điểm chủ yếu của virus Dịch tả lợn
21
21
22
25
25
26

63
2.3. Kit chẩn đoán miễn dịch bệnh Salmonella ở gà
64
2.4. Kit ELISA chẩn đoán bệnh do Salmonella
64
2.5. Kit chẩn đoán bệnh Tụ huyết trùng trâu bò
65
B. Phơng pháp nghiên cứu
69
2.1. Bệnh Đốm trắng ở tôm
69
2.1.1. Phơng pháp tách AND tổng số
2.1 2. Phơng pháp xác định nồng độ ADN
2.1.3. Kỹ thuật PCR
2.1.4. Mutiplex PCR
2.1.5
. Phơng pháp biến nạp AND plasmid vào tế bào E.coli
2.1.6. Phơng pháp tách AND plasmid từ vi khuẩn
2.1.7. Phơng pháp điện di AND trên gel
2.1.8. Phơng pháp xác định trình tự AND tự động

69
70
71
72
73
74
74
75
2.2. Kit chẩn đoán Dịch tả lợn

2.4.5. Điện di thu gen trong túi thẩm tích
2.4.6. Xử lý DNA plasmid bằng enzym hạn chế
2.4.7. Phơng pháp tiến hành PCR
2.4.8. Phơng pháp tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực
2.4.9. Phơng pháp lai Western blot
2.4.10. Thí nghiệm ELISA
88
88
89
89
90
90
91
2.5. Kit chẩn đoán Tụ huyết trùng trâu bò
92
2.5.1. Qui trình chiết tách IgG của thỏ
2.5.2. Xác định nồng độ protein
2.5.3. Qui trình gây miễn dịch cho dê
2.5.4. Phản ứng ELISA để kiểm tra HGKT của dê
2.5.5. Chế tạo Peroxidase conjugation
2.5.6. Xác định đặc tính VSV, SH và độc lực của VK
2.5.7. Qui trình chế kháng nguyên và chất gây MD
2.5.8. Lịch trình gây tối miễn dịch trên thỏ
2.5.9. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của thỏ
2.5.10. Phơng pháp thu hoạch kháng thể

2.5.11. Xác định hàm lợng protein
2.5.12. Phơng pháp điện di protein
2.5.13. Sử dụng IgG thu đợc trong phản ứng IHA
2.5.14. Phơng pháp miễn dịch bệnh lý chẩn đoán bệnh THT

126
130
3.2. Kit chẩn đoán bệnh Dịch tả lợn
134
3.2.1. Kết quả so sánh bốn phơng pháp chẩn đoán
3.2.1. Kết quả phơng pháp lấy máu bằng giấy thấm
134
138
3.3. Kit chẩn đoán miễn dịch bệnh Salmonella ở gà
142
3.3.1. Phân lập VK S. enteritidis và S. typhimurium
3.3.2. Chế tạo kháng huyết thanh O đa giá qua thỏ
142
143
3.4. Kit ELISA chẩn đoán bệnh Salmonella ở gà
146
3.4.1. Kết quả tách chiết DNA genome từ tế bào VK
3.4.2. Kết quả phân lập các gen từ DNA genome bằng PCR
3.4.3. Kết quả tách dòng các gen mã hoá KN roi của
Salmonella bằng hệ vector tách dòng pCR2.1
3.4.4. Biểu hiện các gen mã hoá KN roi
3.4.5. Tìm các điều kiện tối thích để biểu hiện các gen
3.4.6. Tinh sách các protein tái tổ hợp
3.4.7. Nghiên cứu khả năng liên kết miễn dịch của các
protein tái tổ hợp
3.4.8. Xây dựng qui trình chuẩn tạo Kit ELISA
146
146
146


Chơng IV: Kết luận và kiến nghị
Kết luận
Kiến nghị
Lời cảm ơn
201
201
203
204
Tài liệu tham khảo

205 Tóm tắt báo cáo

Đề tài
:
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất và
sử dụng KIT chẩn đoán một số bệnh nguy hiểm ở vật nuôi

Đề tài KC04.16 nhằm nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học
tiên tiến của các nớc trên thế giới để tạo ra các chế phẩm sinh học dùng trong chẩn
đoán một số bệnh truyền nhiễm quan trọng ở vật nuôi đang là đòi hỏi của thực tế sản
xuất ở nớc ta nh: Bệnh Đốm trắng ở tôm, bệnh Dịch tả lợn, bệnh do Salmonella
gây ra và bệnh Tụ huyết trung trâu bò.
Trên cơ sở đề cơng và hợp đồng ký kết với Bộ khoa học công nghệ, đề tài
đợc tách ra làm 5 nhánh tơng ứng với 5 nội dung nghiên cứu độc lập nhau.
Đề tài đợc thực hiện từ tháng 11-2001 và kết thúc vào tháng 12-2004. Sau 3
năm thực hiện tất cả nội dung nghiên cứu đều đạt đợc kết quả tốt nh dự định ban
đầu khi xây dựng đề cơng (một số nhánh vợt hơn so với nội dung đặt ra). Kết quả

lợn.
- Đã chuyển giao Kit và qui trình chẩn đoán bệnh dịch tả lợn cho trung tâm thú
y vùng: Vinh, Đà nẵng và Cần Thơ để chẩn đoán với số lợng 1000 mẫu ( Kit chẩn
đoán miễn dịch huỳnh quang).
- Đã đào tạo 2 sinh viên
3) Kit chẩn đoán bệnh do Salmonella ở gà bằng công nghệ vi sinh
- Từ 339 mẫu phân gà Lơng phợng đã phân lập đợc 20 mẫu dơng tính với
Salmonella enteritidis. Từ 407 mẫu phân gà ri đã phân lập đợc 9 mẫu dơng tính
với S. enteritidis.

3

- Đã chế tạo thành công kháng huyết thanh tối miễn dịch qua thỏ để định typ vi
khuẩn S. enteritidis và S. typhymurium.
- Đã thiết lập đợc qui trình chế huyết thanh đơn giá và đa giá O vi khuẩn S.
êntritidis và S. typhymurium.
- Đã đăng đợc một bài báo trên tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn.

4) Kit ELISA chẩn đoán Salmonella gây bệnh ở gà công nghiệp bằng công
nghệ sản xuắt kháng nguyên bằng vi khuẩn biến nạp.
- Tách dòng thành công các vùng gen mã hoá cho Epitop kháng nguyên roi của
các vi khuẩn S. typhymurium và S. enteritidis trong vi khuẩn E.coli.
- Thiết lập thành công các vector biểu hiện mang gen fliB1, fliB2, gm1, gm2 từ
vector bỉểu hiện pET22b+- Tạo đợc 4 chủng vi khuẩn E. coli tái tổ hợp mang các
gen fljB1, fljB2, gm1 và gm2.
- Biểu hiện và tinh chế đợc 4 protein tái tổ hợp FljB1, FljB2, Gm1 và Gm2.
- 4 protein tái tổ hợp FljB1, FljB2, Gm1 và Gm2 đợc thử khả năng liên kết đặc
hiệu với kháng thể tự nhiên bằng phơng pháp lai western blot. Trong đó, FljB1 và
FljB2 có khả năng phát hiện đặc hiệu đợc S. typhimurium; Gm1 và Gm2 có khả
năng phát hiện đặc hiệu đợc S. enteritidis. Các protein này đợc sử dụng để làm
BVDV Bovine diarrhea disease virus
CSFV Classical swine fever virus
ELISA Enzim-linked immunosorbent assay
FAT Fluorescent antibody test
FCS Fetal calf serum
DTL DÞch t¶ lîn
FITC Fluorescent isothiocyanate
HRPO Horse radish peroxidase
RT_PCR Revert Transcript polymerase reaction

APS Amonium persunphate
bp Base pairs
BSA Bovine serum albumin
DNA Deoxyribonucleotide acid
dNTP 2’-deroxyribonucleotit 5’-triphosphate
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylen diamin tetra acetic acid
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
EtBr Ethedium bromide
IPTG
Isopropylthio-β-D-galactosidase
kb Kilo base
kDa Kilo dalton

6
LB Luria-betani medium
LBA M«i tr−êng LB cã bæ sung ampicillin
PCR Polymerase chain reaction

H: g,m của vi khuẩn S. enteritidis
sef14
Gen mã hoá epitop của kháng nguyên lông
H: g,m của vi khuẩn S. enteritidis
FljB1
Protein tái tổ hợp đợc tạo ra ở E. coli do gen
fljB1 mã hoá
FljB2
Protein tái tổ hợp đợc tạo ra ở E. coli do gen
fljB2 mã hoá
FliC1
Protein tái tổ hợp đợc tạo ra ở E. coli do gen
fliC1 mã hoá
Gm1
Protein tái tổ hợp đợc tạo ra ở E. coli do gen
gm1 mã hoá
Gm2
Protein tái tổ hợp đợc tạo ra ở E. coli do gen
gm2 mã hoá

AGPT: Agar Gel Precipitation Test
BSA: Bovine Serum Albumin
CFU: Colony forming unit
CSMD: Chỉ số miễn dịch
ELISA: Enzym Liking Immuno Sorbent Assay
G-HCC: Hỗn dịch hồng cầu cừu glutaraldehyt
HE: Hematoxilin Eosin
HGKT: Hiệu giá kháng thể
HS: Haemorrhagic Septicaemia