VIEN VI SINH VÄT VA CONG NGHE SINH HOC
BAO CAO TÖNG KET DE TAI
NGHIEN CU*U SAN XUÄT CHE PHÄM SINH HOC
HO TRÖ XU” LY NITÖ TRONG NLÖC THAI "
CNDT: DINH THUY HANG
9774
HA NÖI - 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
VIỆN VI SINH VẬT Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC '

-

-
— -—
Hà Nội, ngày tháng năm 2013
BÁO CÁO THỐNG KÊ KÉT QUẢ THỰC h iện đề tài
I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý nitơ trong
nước thải
Mã số: KC.04.TN07/11-15
Thuộc: Chương trình nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ sinh
học, mã số KC.04/11-15.
2. Chủ nhiệm đề tài:
Họ và tên: Đinh Thúy Hằng
Ngày, tháng, năm sinh: 01/03/1970 Nam/Nữ: Nữ
Học hàm, học vị: Tiến sỹ
Chức danh khoa học: nghiên cứu viên Chức vụ: trưởng phòng
Điện thoại: Tổ chức: 04 3754 7488 Mobile: 0972 523 466
Fax: 04 3754 7407 E-mail: [email protected]
Tên tổ chức đang công tác: Phòng sinh thái vi sinh vật, Viện Vi sinh vật

Thời gian
Kinh phí
(Tr. đ)
1
01/2012 - 12/2012: Thuê
khoán chuyên môn
190 03/2012 -
12/2012
190 190
CĐ1 10 10 10
CĐ2 20 20 20
CĐ3 10 10 10
CĐ4 30 30 30
CĐ5 30 30 30
CĐ6 10 10 10
CĐ7 20 20 20
CĐ8 20 20 20
CĐ9 10 10 10
CĐ10 10 10 10
CĐ11 10 10 10
CĐ12 10 10 10
2 01/2012 - 12/2012:
Nguyên, nhiên vật liệu
260 03/2012 -
12/2012
Nguyên vật liệu
174,85 174,85 174,85
Vật tư tiêu hao
72,55 72,55 72,55
Điện nước 12,6 12,6 12,6

2 Nguyên vật liệu, năng
lượng
260 260 260 260
3
Thiết bị, máy móc
4
Xây dựng, sửa chữa
nhỏ
5
Chi khác 100 100 88,135 88,135
Tổng cộng
550 550 538,135 538,135
3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài
(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét
chọn, phê duyệt kinh phí hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu
có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn kiến nghị điều chỉnh nếu có)
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản Ghi chú
1
Quyết định số
1876/QĐ-BKHCN
ngày 27/6/2011
Quyết định về việc thành lập Hội đồng
khoa học và công nghệ tư vấn xét chọn tổ
chức và cá nhân chủ trì đề tài nghiên cứu
khoa học công nghệ tiềm năng thực hiện
năm 2011 thuộc lĩnh vực Công nghệ sinh
học

20/12/2012
Quyết định về việc thành lập Hội đồng
nghiệm thu cấp cơ sở đề tài: “Nghiên cứu
sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý
nitơ trong nước thải“ mã số
KC.04.TN07/11-15
4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài
TT
Tên tổ chức
đăng ký theo
thuyết minh
Tên tổ chức đã
tham gia thực
hiện
Nội dung tham
gia chủ yếu
Sản phẩm chủ
yếu đạt được
Ghi
chú*
1 Ong Dương Tấn
Đức, trại lợn CP
tại Tam Dương,
Vĩnh Phúc
Ong Dương Tấn
Đức, trại lợn CP
tại Tam Dương,
Vĩnh Phúc
Phối hợp thực
hiện thử nghiệm

thuyết minh
Tên cá nhân
đã tham gia
thực hiện
Nội dung tham
gia chính
Sản phẩm chủ
yếu đạt được
Ghi chú*
1
TS. Đinh Thúy
Hằng
TS. Đinh
Thúy Hằng
Xây dựng đề
cương; điều hành
các công việc của
đề tài, viết báo
cáo tổng kết.
Đề cương nghiên
cứu chi tiết, các
báo cáo giữa kỳ
và cuối kỳ.
2
ThS. Thái
Mạnh Hùng
CN. Nguyễn
Thị Hằng,
CN. Dương
Chí Công

xử lý nước thải
sau biogas ở Vĩnh
Phúc; thử nghiệm
áp dụng chế
phẩm, phân tích
mẫu nước thải
4 ThS. Nguyễn
Thị Tuyền
ThS. Nguyễn
Thị Tuyền
Phân lập, tuyển
chọn các chủng vi
khuẩn nitrat hóa
và khử nitrat;
Định danh các
chủng tuyển chọn
và xác định độ an
toàn sinh học.
Bộ chủng vi
khuẩn nitrat hóa
và khử nitrat; giải
trình tự 16S
rDNA và định
danh, sơ tuyển
các chủng theo
hoạt tính sinh học
5 ThS. Nguyễn
Thị Hải
ThS. Nguyễn
Thị Hải

(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số
đoàn, số lượng người tham gia )
Ghi chú*
1
2
7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm)
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm)
Ghi chú*
1 - Kinh phí: 12 000 000
- Thời gian: 11/2012
- Nội dung: Xử lý nitơ trong nước
thải ở Việt Nam: Hiện trạng và
vai trò hỗ trợ của ngành công
nghệ sinh học.
- Thời gian: 2/11/2012
- Địa điểm: P601, Viện Vi sinh
vật và Công nghệ sinh học
- Kinh phí: 7 885 000
r _ Ị
8
rri Ả V Ả _A* _1 __ _ A _ _ *A_ _ 1 _ *? A
. Tóm tăt các nội dung công việc chủ yếu
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong

5 - 9/2012 9/2012 Dương Chí Công
Đinh Thúy Hằng
5 Nội dung 5: Thử nghiệm áp dụng
chế phẩm vào thực tế
8 -
11/2012
11/2012
Dương Chí Công
Đinh Thúy Hằng
Nguyễn Thị Hằng
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra
a) Sản phẩm Dạng I:
TT Tên sản phẩm và chỉ tiêu
Đơn vị đo
Số lượng
chất lượng chủ yếu
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1
Chủng vi sinh vật nitrat hóa và
khử nitrat
Chủng 7 - 10 10
2
Chế phẩm sinh học xử lý nitơ
trong nước thải có chất lượng
như đã đăng ký:
Lít/kg 5 - 10 kg / lít 5 kg dạng bột
120 lít dạng dịch
- Thành phần vi khuẩn nitrat
hóa và khử nitrat

Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1 Quy trình sản xuất chế phẩm Quy trình dạng Quy trình dạng sơ CĐ 3.3,
sinh học hỗ trợ xử lý nitơ sơ đồ khôi đồ khôi Báo cáo tổng
trong nước thải đạt tiêu chuẩn kết
kỹ thuật như đã đăng ký
c) Sản phẩm Dạng III:
TT Tên sản phẩm
Yêu cầu khoa học cần đạt
Số lượng,
nơi công bố
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
1
Bài báo khoa học
01 bài đăng trên
tạp chí chuyên
ngành.
Nuôi tăng sinh vi khuẩn
nitrat hóa đạt mật độ tế
bào cao trên thiết bị lên
men.
Tạp chí Công
nghệ sinh
học, đã nhận
đăng.
d) Kết quả đào tạo
TT
Câp đào tạo, chuyên ngành
Số lượng Ghi chú
(Thời gian
kết thúc)

Nội tại KCN Yên
Phong, Bắc Ninh
Khởi động tôt và ổn định
hệ thông TF với công suất
700 - 1000 m3 nước
thải/ngày, đảm bảo hàm
lượng nitơ ở đầu ra đạt
tiêu chuẩn quy định
2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh trình độ công nghệ với
khu vực và thế giới )
Công nghệ xử lý nitơ trong nước thải theo phương pháp nitrat hóa/khử
nitrat là công nghệ chủ yếu được áp dụng thành công tại nhiều nước trên thế
giới. Ở các nước phát triển như châu Âu, Mỹ, Nhật, công nghệ này đã được
nghiên cứu rộng rãi, các bước vận hành của công nghệ cũng đã được tối ưu hóa,
đặc biệt các nhóm vi khuẩn tham gia quá trình xử lý là nitrat hóa và khử nitrat
đã được nghiên cứu rất sâu sắc. Ở nước ta những nghiên cứu về vi khuẩn nitrat
hóa và khử nitrat còn chưa nhiều, chủ yếu do quy trình phân lập và nuôi cấy các
nhóm vi khuẩn này khá phức tạp. Trong bảo tàng giống quốc gia (VTCC) còn
vắng bóng các chủng vi khuẩn thuộc hai nhóm này để làm nguyên liệu cho
nghiên cứu vàứng dụng. Hơn thế, việc nuôi tăng sinh các loài vi khuẩn trên, đặc
biệt là nhóm nitrat hóa, trong hệ thống lên men để đạt mật độ tế bào cao cũng
chưa được thực hiện. Đó là những kiến thức về khoa học hiện đang còn thiếu mà
nhóm tác giả khi thực hiện đề tài muốn đóng góp.
Về mặt công nghệ, tuyệt đại đa số các hệ thống xử lý nước thải tập trung
(hoặc bán tập trung) ở nước ta đều thực hiện quy trình loại nitơ theo công nghệ
nitrat hóa/khử nitrat, tuy nhiên hiệu quả xử lý không cao do nhiều lý do, trước
nhất phải kể đến (i) thiết kế và vận hành chưa phù hợp (thường do hạn chế về
diện tích và kinh phí), (ii) nguồn thải không ổn định do nhiều công nghệ sản

- Hoàn thành nốt 3 chuyên đề còn lại thuộc
nội dung nghiên cứu 4 và 5
2
Họp mặt chương
trình KC.04/11-15
18 -
19/12/2012
- Báo cáo tóm tắt kết quả nghiên cứu và triến
khai thực tế của đề tài
3
Nghiệm thu cấp cơ
sở Quy trình sản
xuất chế phẩm
17/12/2012
Đạt yêu cầu
4
Nghiệm thu cấp cơ
sở đề tài
26/12/2012
Đạt yêu cầu, đề nghị tiếp tục triến khai
5
Bảng kê xác nhận
chứng từ đã thanh
toán
15/1/2013
Đầy đủ, hợp lệ
6
VPCT kiếm tra
thanh toán
21/1/2013

3.3. Các phương pháp sinh học phân tử 22
3.3.1. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại 22
3.3.2. Điện di biến tính DGGE 22
Chương IV. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 24
5.1. NỘI DUNG 1: Phân lập vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat từ một 24
số môi trường đại diện ở Việt Nam
5.1.1. Làm giàu và phân lập vi khuẩn nitrat hóa 24
5.1.2. Làm giàu và phân lập vi khuẩn khử nitrat 26
5.1.3. Định danh các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn sơ bộ 28
5.1.4. Nghiên cứu hoạt tính trao đổi chất của các chủng vi khuẩn 29
đã sơ tuyển
5.1.4.1. Hoạt tính trao đổi chất của các chủng vi khuẩn AOB 29
5.1.4.2. Hoạt tính trao đổi chất của các chủng vi khuẩn NOB 30
5.1.4.3. Hoạt tính trao đổi chất của các chủng vi khuẩn NRB 32
5.1.5. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới sinh trưởng của các 33
chủng vi khuẩn quan tâm
5.1.5.1. Điều kiện sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nitrat 33
hóa
5.1.5.2. Điều kiện sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khử 35
nitrat
5.2. NỘI DUNG 2: Nghiên cứu điều kiện lên men tối ưu đối với vi 39
khuẩn nitrat hóa và khử nitrat
5.2.1. Nghiên cứu điều kiện lên men tối ưu cho vi khuẩn nitrat 39
hóa
5.2.1.1. Xác định điều kiện tối ưu cho vi khuẩn nitrat hóa ở 39
thiết bị lên men
5.2.1.2. Nuôi tăng sinh đồng thời hai chủng vi khuẩn nitrat 41
hóa
5.2.2. Nghiên cứu điều kiện lên men tối ưu đối với vi khuẩn khử 43
nitrat

Biological Oxygen Demand
COD: Chemical Oxygen Demand
DAPI:
4',6-diamidino-2-phenylindole
DNA:
Deoxyribonucleic acid
16S rDNA: gen mã hóa cho RNA ribosom 16S
ĐHXD:
Đại học xây dựng
CTAB: Cetyl Trimethyl Ammoniumum Bromide
dNTP: Di-deoxyribonucleotide Triphosphate
DGGE:
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
EDTA: Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid
FISH:
In situ Fluorescence Hybridization
KCN:
Khu công nghiệp
MQ: Mili - Q
NOB: Nitrite Oxidizing Bacteria
NRB:
Nitrate Oxidizing Bacteria
OD:
Optical Density
PBS: Phosphate - Buffered Saline
PCI: Phenol - Chloroform - Isoamyl alcohol
PCR:
Polymerase Chain Reaction
rDNA:
Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

Bảng 5.5 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tới mức sinh trưởng
của các chủng vi khuẩn khử nitrat
35
Bảng 5.6
Điều kiện tối ưu nuôi tăng sinh cho vi khuẩn nitrat hóa ở thiết
bị lên men
40
Bảng 5.7
Điều kiện tối ưu nuôi tăng sinh vi khuẩn khử nitrat ở thiết bị
lên men
43
Bảng 5.8
So sánh đặc tính lý/hóa của ba chất mang quan tâm
46
Bảng 5.9 Áp dụng chế phẩm trên mô hình xử lý trong phòng thí nghiệm 55
Bảng 5.10
Áp dụng chế phẩm để xử lý nước thải sau biogas tại Tam
Dương, Vĩnh Phúc
63
Bảng 5.11 Áp dụng chế phẩm để khởi động vận hành hệ thống TF tại
Nhà máy rượu Hà Nội
66
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình Trang
Hình 1.1 Chu trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên 8
Hình 5.1
Nhận biết nhanh hoạt tính của vi khuẩn nitrat hóa
24
Hình 5.2 Mức sinh trưởng và hoạt tính sinh học của ba chủng AOB đã
sơ tuyển trong môi trường có NH4+ là chất cho điện tử duy

Hình 5.13
Mức bám dính của tế bào vi khuẩn trên ba loại giá thể nghiên
cứu
49
Hình 5.14
Các bước tạo chế phẩm xử lý nitơ dạng dịch thể (STN-L)
50
51
52
53
54
56
57
58
61
62
64
65
66
67
Các bước tạo chế phẩm xử lý nitơ dạng bột (STN-S)
Xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat trong chế
phẩm bằng phương pháp MPN
Chế phẩm xử lý nitơ dạng dịch (STN-L) và dạng bột (STN-S)
Mô hình xử lý nước thải trong phòng thí nghiệm quy mô 1-
3L/ngày
Xử lý nước thải trên mô hình phòng thí nghiệm
Loại ammonia trong nước thải trên mô hình xử lý phòng thí
nghiệm
Phân tích biến động của thành phần vi khuẩn trong mô hình

nhiều đơn vị nghiên cứu trong lĩnh vực môi trường đã đưa ra các giải pháp công
nghệ xử lý nước thải với qui mô tập trung (trạm xử lý nước thải Kim Liên, Trúc
Bạch) và bán tập trung (như mô hình BASTAFAT của Viện Khoa học Kỹ thuật
Môi trường - ĐHXD Hà Nội, mô hình Johkasou của công ty Xanh và Xanh).
Thực trạng hoạt động của các hệ thống xử lý hiện có cho thấy nhu cầu bổ sung
vi sinh vật chuyển hóa nitơ để tăng hiệu suất và rút ngắn thời gian xử lý là rất
lớn [39]. Các dạng chế phẩm sinh học khác nhau chứa vi khuẩn nitrat hóa và
khử nitrat đang được tiêu thụ trên thị trường phần lớn có xuất xứ từ các nước có
ngành công nghiệp sinh học phát triển như Mỹ, Úc, Canada [42]. Hiện tại chưa
có một chế phẩm sinh học nào sản xuất trong nước với mục đích hỗ trợ quá trình
loại nitơ trong nước thải theo công nghệ nitrat hóa - khử nitrat cho các hệ thống
xử lý tập trung. Do vậy, việc nghiên cứu phát triển chế phẩm này dựa trên nguồn
vi sinh vật trong nước là điều cấp thiết. Trên cơ sở nhu cầu thực tế chúng tôi đề
xuất thực hiện đề tài „Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý
nitơ trong nước thải".
1.2. Mục tiêu, đối tượng, tính cấp thiết, phạm vi nghiên cứu, ý nghĩa khoa
học và thực tiễn của đề tài
1.2.1. Mục tiêu
Mục tiêu tống quát: Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ nguồn
vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat phân lập tại Việt Nam nhằm cung cấp chế phẩm
sinh học hỗ trợ quá trình xử lý nitơ trong nước thải.
Mục tiêu cụ the: Thiết lập bộ chủng vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat phân lập
từ các môi trường ô nhiễm ở Việt Nam, trên cơ sở đó tuyển chọn các chủng có
hoạt tính cao để ứng dụng làm chế phẩm. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩ m
từ các chủng tuyển chọn, bao gồm lên men thu sinh khối, phối trộn với giá thể
và đánh giá tác dụng của chế phẩm trong việc xử lý nitơ.
1.2.2. Đối tượng
- Vi khuẩn nitrat hóa (oxy hóa ammonia và oxy hóa nitrit) và vi khuẩn khử
nitrat phân lập từ một số nguồn tự nhiên ở Việt Nam như đất vườn, nước
và bùn từ hệ thống xử lý nước thải.

[19].
Mặc dù Nhà nước đã có quy chế quy định đối với hàm lượng nitơ trong
nước thải khi đưa ra ngoài môi trường (40 mg/l, QCVN 40:2011), đồng thời có
những chế tài áp dụng cho việc xử phạt các trường hợp vi phạm, tuy nhiên trên
phạm vi cả nước số cơ sở xử lý nước thải đạt yêu cầu trên là rất nhỏ [19]. Phần
lớn các hệ thống xử lý tập trung hoạt động chưa thực sự hiệu quả do thiết kế,
vận hành không phù hợp [39]. Chế phẩm sinh học với thành phần vi sinh có hoạt
tính cao có thể cải thiện được hiệu quả xử lý của các hệ thống đang hoạt động và
rút ngắn thời gian khởi động đối với các hệ thống mới. Các chế phẩm sản xuất
trong nước cho mục đích xử lý môi trường hiện có chưa đáp ứng được yêu cầu
trên, trong khi đó các chế phẩm nhập ngoại lại có giá thành quá cao. Chính vì
vậy việc tiến hành Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học hỗ trợ xử lý nitơ
trong nước thải là cần thiết cấp bách.
1.2.4. Phạm vi nghiên cứu
Các hệ thống xử lý tập trung nước thải có hàm lượng nitơ cao, tiêu biểu là nước
thải sau biogas của các trang trại chăn nuôi gia súc, các cơ sở sản xuất và chế
biến thực phẩm.
1.2.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Hiện nay ở nước ta, nguồn vi khuẩn nitrat hóa và khử nitrat để làm nguyên liệu
cho các nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng về vấn đề chuyển hóa nitơ còn
thiếu, do vậy tập hợp các chủng vi khuẩn tạo ra trong đề tài có thể sẽ đáp ứng
được phần nào nhu cầu này.
Vi khuẩn nitrat hóa (oxy hóa ammonia và oxy hóa nitrit) là các loài sinh
trưởng tự dưỡng vô cơ, do vậy quy trình lên men thu sinh khối đối với chúng là
bài toán không đơn giản. Việc nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi tăng sinh các
loài vi khuẩn này trên thiết bị lên men sẽ làm cơ sở tham khảo cho các nghiên
cứu tương tự sau này.
Chế phẩm sinh học chứa các loài nitrat hóa và khử nitrat có hoạt tính cao
đang có nhu cầu rất lớn từ thực tế ở Việt Nam, phục vụ cho mục đích tăng hiệu
quả xử lý của các hệ thống đang hoạt động, ổn định và rút ngắn thời gian khởi