BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TẠO CHỦNG VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC
TÍNH SINH HÓA CỦA CHỦNG
Salmonella choleraesuis Smith NHƯỢC
ĐỘC MANG GEN CRP BỊ ĐỘT BIẾN
GVHD : TS. VŨ KHẮC HÙNG
Th.S. LÊ ĐÌNH ĐỨC
SVTH : NGUYỄN HOÀNG OANH
Lớp : 50 CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Khoá : 50
Nha Trang, tháng 6 năm 2012
MỤC LỤC i
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
MỞ ĐẦU viii
Chương 1. Tổng quan 1
1.1 Bệnh phó thương hàn lợn 1
1.1.1 Cơ chế sinh bệnh 3
1.1.2 Phương thức lây truyền 3
1.1.3 Triệu chứng 4
1.1.4 Bệnh tích 4
1.1.5 Chẩn đoán bệnh 4
1.1.6 Phòng và trị bệnh 6
1.2 Đặc tính của vi khuẩn Salmonella choleraesuis Smith 7
1.2.1 Đặc điểm hình thái 8
1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 8
1.2.3 Đặc điểm sinh hóa 9
1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên 10
1.2.5 Sức đề kháng 13
1.2.6 Tính gây bệnh 14
1.3 Gen CRP 15
1.4 Phương pháp tạo DNA tái tổ hợp 19
1.4.1 Nguyên tắc chung 19
1.4.2 Quy trình tạo DNA tái tổ hợp 20
1.5 Tình hình nghiên cứu gây đột biến trên một số gen gây bệnh của Salmonella
21
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 24
2.1 Đối tượng nghiên cứu 24
ii
iii Kết luận và kiến nghị 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 iv DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của một số loài Salmonella 9
Bảng 1.2 Định type huyết thanh học (serotyp) của vi khuẩn Salmonella (Theo
Kauffman (1972) ) 12
Bảng 1.3 Các gen bị mất và chức năng của chúng trong phát triển các chủng
Salmonella spp. đã giảm độc lực 22
Bảng 2.1 Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 26
Bảng 2.2 Thành phần của bộ kit QIApre spin Miniprep Kit của QIAgen 28
Bảng 2.3 Thành phần của bộ kit Blood&Tissue Extraction của QIAgen 27
Bảng 2.4 Thành phần của bộ kit QIA Quick Gel Extraction của hãng QIAgen 30
Bảng 2.5 Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR 30
Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (RE) 31
Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng cắt plasmid bằng enzyme RE 32
Bảng 2.8 Thành phần phản ứng lai ghép sử dụng T4 ligase 32
Bảng 3.1: Các đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis Smith và
S.choleraesuis/Δcrp 47
Hình 3.5 Các khuẩn lạc S. choleraesuis sau khi tiếp hợp với E.coli
χ7213/pRE112/Δcrp-4 mọc trên môi trường chọn lọc LB + Cm. 42
vi Hình 3.6 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S. choleraesuis 539/Δcrp
(1), S. choleraesuis Smith (2), plasmid của χ7213/pRE112/Δcrp (3) với cặp mồi
Pr5F-Pr6R (ảnh trái), và Pr6R-Pr7F (ảnh phải) trên gel agarose 1,2%. 43
Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc của S.chorelasuis Smith và S. chorelasuis 539/Δcrp
sau 24h nuôi cấy 44
Hình 3.8 Biểu đồ tốc độ sinh trưởng của các chủng S. choleraesuis Δcrp và S.
choleraesuis Smith trong 10 giờ nuôi cấy 45
Hình 3.9 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S. choleraesuis Smith và
S.choleraesuis/Δcrp 46
Hình 3.10 Sản phẩm PCR từ genome của S. cholerasuis 539/Δcrp với cặp mồi
Pr5F-Pr6R, Pr6R-Pr7F ở các đời 1, 5, 10, 15, 20 47
Hình 3.11 Trình tự đoạn gen khuếch đại từ cặp mồi Pr5F- Pr6R của gen Δcrp với
đoạn 322 bp (545-867) (bôi đen) bị mất so với gen crp của Salmonella choleraesuis
nhược độc 49
vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Kí hiệu Chữ viết tắt
Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại vắc-xin, trong đó hai loại vắc-xin vô
hoạt và vắc-xin nhược độc được sử dụng nhiều nhất. Vắc-xin vô hoạt ít hiệu quả
hơn so với các loại vắc-xin sống nhược độc [15]. Những năm gần đây có rất nhiều
nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắc-xin sống nhược
độc. Tuy nhiên các loại vắc-xin sống nhược độc tạo ra bằng cách sử dụng các tác
nhân lý hóa hoặc bằng phương pháp tiếp truyền truyền thống chỉ giới hạn ở một số
loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắc-xin nhược độc quay
trở lại độc lực cao là rất lớn [18, 28]. Để khắc phục những mặt hạn chế trên, loại
vắc-xin thế hệ mới ra đời, một trong số đó là vắc-xin tái tổ hợp.
Kỹ thuật di truyền đã được sử dụng để tạo ra các sinh vật cải biến dùng làm
vắc-xin tái tổ hợp sống. Các vắc-xin này là sinh vật không gây bệnh được cải biến
để mang và biểu hiện quyết định kháng nguyên từ tác nhân gây bệnh đích hoặc
chủng cải biến của sinh vật gây bệnh trong đó gen độc đã được cải biến hoặc loại
bỏ. Trong trường hợp này, như là thành phần của vi khuẩn, các quyết định kháng
nguyên quan trọng có mặt trong hệ miễn dịch có thành phần rất giống với dạng
kháng nguyên ở sinh vật gây bệnh [1].
Gen crp mã hóa CAP-protein hoạt hóa trao đổi chất kết hợp với cAMP tạo
phức cAMP-CAP, phức này liên kết với promoter gây hoạt hóa sao mã các gen cấu
trúc. Thể đột biến gen crp không sao mã được mRNA của operon lac, dẫn đến
ix không tham gia chuyển hóa năng lượng, gây kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của
S. choleraesuis.
Như vậy, việc tạo chủng S. choleraesuis mang gen crp bị đột biến phục vụ cho
việc sản xuất vắc-xin tái tổ hợp phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn là
việc cấp thiết. Do đó tôi tham gia thực hiện đề tài “Tạo chủng và kiểm tra đặc tính
sinh hóa chủng Salmonella choleraesuis Smith mang gen crp đột biến”.
Mục tiêu của đề tài
- Tạo chủng plasmid pRE112/Δcrp. Chuyển nạp plasmid pRE112/Δcrp vào
2015 và lên 34.7 triệu con năm 2020. Sản lượng thịt hơi từ 3.1 triệu tấn năm 2010,
lên 3.9 triệu tấn năm 2015 và 4.8 triệu tấn năm 2020; sản lượng thịt xẻ từ 2191.3
ngàn tấn năm 2010; 2794.7 ngàn tấn năm 2015 và 3493.1 ngàn tấn năm 2020.
Trong đó đàn lợn nuôi công nghiệp 5.8 triệu con (chiếm 19.3%) năm 2010, lên 8.9
triệu con (chiếm 27.0%) năm 2015 và lên 12.9 triệu con (chiếm 37.0%) năm
2020. Sản phẩm thịt hơi nuôi công nghiệp từ 1135.2 ngàn tấn (chiếm 36.5%) năm
2010; 1851.5 ngàn tấn (chiếm 47.2%) năm 2015 và 2866 ngàn tấn (chiếm 59.2%)
năm 2020 .
Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác
nghiên cứu, phát triển giống, thức ăn, xây dựng các chương trình quản lý; đặc biệt
nhiệm vụ của công tác chăn nuôi – thú y càng nặng nề hơn. Trong đó việc tăng
cường áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch
bệnh ở lợn có hiệu quả là điều hết sức quan trọng.
Một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh
vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm
chất lượng con giống. Sản phẩm thịt lợn nhiễm bệnh làm tăng nguy cơ mất an toàn
vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh phó
thương hàn do vi khuẩn Salmonella và phù đầu do vi khuẩn E.coli gây ra.
2 Bệnh phó thương hàn là bệnh truyền nhiễm xảy ra chủ yếu ở lợn 2- 4 tháng
tuổi. Bệnh do trực khuẩn Salmonella cholereasuis chủng Kunsendorf (thể cấp tính)
và Salmonella typhi suis chủng Vondagsen (thể mãn tính). Đây là vi khuẩn đường
ruột tác động chủ yếu trên đường tiêu hoá gây ra các triệu chứng và bệnh tích như
viêm ruột, dạ dày, lách sưng to . Các đàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây
thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại
đối với con người [22, 29].
hạch và từ đó vào máu gây bại huyết. Ở những con vật qua khỏi bệnh vi khuẩn có
khuynh hướng khu trú ở một số phủ tạng như gan đặc biệt ở hạch lâm ba. Nội độc
tố của Salmonella đóng vai trò rất lớn trong quá trình gây bệnh. Nội độc tố ảnh
hưởng đến plasma, khả năng đông máu. Phản ứng viêm xảy ra đầu tiên, kích thích
tiểu cầu và tấn công bạch cầu. Sốt và trúng độc máu cũng là hai triệu chứng gây ra
trực tiếp do nội độc tố.
1.1.2 Phương thức lây truyền
Bệnh phó thương hàn lợn là bệnh ở đường tiêu hóa nên đường lây truyền chủ
yếu của bệnh là qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Khi lợn ăn phải thức ăn,
nước uống có vi khuẩn thì sẽ nhiễm khuẩn và có khả năng phát bệnh.
4 Bệnh này chủ yếu gặp ở lợn con từ 2-4 tháng tuổi. Đặc biệt bệnh có thể lây
nhiễm sang người và các động vật nuôi khác như gia cầm, cừu,…
1.1.3 Triệu chứng
Thể cấp tính
Khi lợn mắc bệnh thể cấp tính thì có triệu chứng như sốt cao từ 40–41
0
C, chót
tai lạnh, kém ăn, táo bón. Phân lợn có màu đen, màng nhày bao quanh phân. Lợn
con có thể có triệu chứng tiêu chảy phân có màu vàng, sệt lẫn máu và rất hôi thối.
Lợn nhiễm bệnh thường nằm co trên 4 chân, bụng nổi gai ốc, lông dựng. Ngoài ra
lợn cũng có các triệu chứng khác như thở khó và nhanh, tim đập yếu. Trên da xuất
huyết thành từng nốt đỏ ửng rồi chuyển sang tím xanh ở tai, bụng, mặt trong đùi.
Tốc độ lây lan trong chuồng chậm, tốc độ gây chết chậm, nhưng bệnh làm lợn
mất sức suy kiệt, còi cọc. Sau 1-2 tuần nhiễm bệnh, lợn bị suy kiệt dần, tiêu chảy
nặng và có thể chết. Lợn nái trong thời kỳ mang thai mắc bệnh có thể dẫn đến sẩy
thai.
Thể mãn tính
- Nếu số lượng vi khuẩn trong phân ít thì cấy vào môi trường tăng sinh, Mule
kofman, để tủ ấm 37
0
C trong 18 - 24 giờ, rồi mới cấy ria trên môi trường phân lập.
- Nếu trong máu có ít vi khuẩn thì cấy nhiều máu vào bình nước thịt 50ml có
1% glucose và nước mật bò, để tủ ấm 37
0
C trong 1 - 2 tuần lễ rồi mới cấy vào môi
trường phân lập.
- Giám định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn đã phân lập.
- Tiêm động vật thí nghiệm (thỏ, chuột bạch, chuột lang). Bệnh phẩm sẽ làm
chết con vật sau 6 - 10 ngày.
Chẩn đoán huyết thanh học
Dùng kháng nguyên vi khuẩn đã phân lập được làm phản ứng ngưng kết trên
phiến kính với kháng huyết thanh Salmonella đa giá A - E, kháng huyết thanh O và
H của nhóm C1 và cuối cùng với kháng huyết thanh S. choleraesuis, hiệu giá phải
trên 1/100 mới dương tính (hiệu giá ngưng kết tối thiểu).
6 Có thể phát hiện ngưng kết tố trong lợn bệnh, nhưng những kháng thể này chỉ
xuất hiện từ ngày thứ 7 sau khi mắc bệnh.
Ngoài ra cũng có thể làm các phản ứng khác như PCR, ELISA,…để
tìm ra vi khuẩn gây bệnh.
1.1.6 Phòng và trị bệnh
1.1.6.1 Phòng bệnh và khống chế bệnh
Vệ sinh và quản lý:
Vấn đề quan trọng là loại trừ các điều kiện có lợi cho mầm bệnh phát triển và
tiếp xúc với lợn bệnh và lợn mang trùng là nguồn lây lan bệnh nên các biện pháp vệ
sinh phòng dịch như cách ly, xử lý những đàn lợn mắc bệnh rất quan trọng. Xây
Nếu dùng cho cả đàn thì dùng nitrofurazone hay phối hợp chlortetracyclin với
sulfamethiazine (75 mg của mỗi thứ cho 1 lít nước). Liệu trình: 3 - 5 ngày.
Kết hợp đìều trị triệu chứng tiêu chảy như: Atropin, Kaolin
Ngoài ra phải dùng các loại thuốc bù các chất điện giải và mất nước như dung
dịch Sodium Bicarbonate 5%, nước muối sinh lý (0,9%)
1.2 Đặc tính của vi khuẩn Salmonella choleraesuis Smith
S. choleraesuis là một trong những vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn lợn.
Lợn bị nhiễm S. choleraesuis không chỉ bị viêm dạ dày, ruột mà gây chết biểu hiện
bao gồm viêm phổi, viêm gan, viêm màng não [22].
Vi khuẩn được phân lập lần đầu tiên trên lợn vào năm 1885 do Salmon và
Smith [20].
Phân loại khoa học của S.choleraesuis :
Giới (regnum) : Bacteria
Ngành (phynum : Proteobacteria
Lớp (class) : Gamaproteobacteria
Bộ (ordo) : Enterobacteriales
Họ (familia) : Enterobacteriaceae
Chi (genus) : Salmonella
Loài (species) : S.choleraesuis
8 1.2.1 Đặc điểm hình thái
S. choleraesuis là một loại vi khuẩn hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước
0,4–0,6µm x 1–3µm, không có khả năng hình thành giáp mô và nha bào. Có khả
năng di động mạnh do có từ 8 -12 tiêm mao xung quanh thân. Vi khuẩn dễ bắt màu
thuốc nhuộm, Gram âm, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở
hai đầu [7].
S
S.paratyphi - +H +H - +H -
S.echotmuelleri +H +H +H +H +H +
S.híchfeldii +H +H +H - +H +
S.typhosa ± ± + - + +
S.typhimurium +H +H +H +H +H +
S.abortus equi +H +H - - +H ±
S.abortus ovis +H +H - - +H ±
S.cholerae suis +H - - - +H ±
S.typhi suis +H +H +H - +H -
10 S.enteritidis +H +H +H - +H +
S.pullorum +H +H +H - ± +
S.gallinarum + + + - + ±
S.anatis +H +H + - +H +
Chú thích: + : sinh axit, dương tính; H : sinh hơi
- : âm tính; ± : không xác định
Các phản ứng sinh hoá khác:
Indon -
H
2
S +
VP -
MR -
Khử nitrat thành nitrit +
1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên
S. choleraesuis thuộc nhóm C trong bảng phân loại Salmonella của Kauffman
có công thức kháng nguyên như sau:S . VI, VII : c–1,5 [7].
; D
1
, D
2
, E
1
, E
2
, E
3
, E
4
, F, G
1
,
G
2
, H. I, J, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, 49, 50.
Đặc tính :
Kháng nguyên O là yếu tố giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật
chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại
thực bào (Morris và cộng sự, 1976) [19].
Kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella là kháng nguyên chịu nhiệt. Ở nhiệt
độ 100
0
C, kháng nguyên bị hủy sau 24 giờ. Kháng nguyên O có thể chịu được cồn
50
0
và axit HCL 1N trong 24 giờ, nhưng bị phá hủy bởi focmon nồng độ 5% [5].
Kháng nguyên có tính độc. Chuỗi polysaccarit khi mất dần phân tử đường hay
Kháng nguyên H Nhóm huyết
thanh
Serotyp
Kháng
nguyên O
Pha 1 Pha 2
Nhóm A S.paratyphi A 1, 2, 12 A /1, 5/
S.paratyphi B 1, 4, /5/, 12 B 1,2
S.abortus ovis 1, 4, 5, 12 C 1,6
S.saintpaul 1, 4, 12 E, h 1,2
S.agona 1, 4, 12 F, g, s -
S.typhimurium 1, 4, /5/, 12 I 1,2
S.heidelberg 1, 4, /5/, 12 R 1,2
Nhóm B
S.abortus equi 4, 12 - E,n,x
S.paratyphi C 6, 7, /Vi/ C 1,5
S.cholerae suis 6, 7 C 1,5
S.cholerae suis var
Kunzendorf
6, 7 - 1,5
S.typhisuis 6, 7 C 1,5
Nhóm C1
S.montervideo 6, 7, 14 G,m/p/, s /1,2,7/
13 S.thomson 6, 7, 14 K 1,5
S.virchow 6, 7 R 1,2
S.infantis 6, 7, 14 R 1,5
S.typhi 9, 12, /Vi/ D -
muối (nồng độ khoảng 29%) được 4-8 tháng ở nhiệt độ từ 6–12
o
C [2].
Copyright: Tài liệu đại học ©