i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã được sự hướng
dẫn, giúp đỡ tận tình của quý thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng kính trọng
và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới:
Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha
Trang. Ban lãnh đạo Phân Viện thú y Miền Trung đã tạo mọi điều kiện thuận lợi,
như liên hệ nơi thực tập, hỗ trợ cơ sở vật chất, trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành
công việc tốt nhất.
Đặc biệt tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành tới TS. Vũ Khắc Hùng và TS.
Nguyễn Văn Duy, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành luận
văn này.
Xin gởi lời cảm ơn tới BS. Đỗ Văn Tấn và CN. Đào Hoài Thu, cùng tất cả các
thầy cô giáo trong viện công nghệ sinh học. Các cô chú, anh chị tại Phân Viện thú y
Miền Trung đã hết lòng dạy bảo, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình tìm tòi,
học hỏi để hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Xin gởi lời biết ơn tới bố mẹ, anh chị em và bạn bè tôi, đã luôn ở bên động viên
và giúp đỡ tôi rất nhiều trong học tập và cuộc sống.
Nha Trang, Ngày 2 tháng 7 năm 2012
SV. Đoàn Thị Thu Dung
ii
1.5.1. Khái niệm 18
1.5.2. Các đặc điểm chính của vector 19
1.5.3. Các bước trong tạo DNA tái tổ hợp 20
1.6. Plasmid dùng trong kỹ thuật tạo dòng 20
1.6.1. Plasmid pBluescript II SK(+) (pBSIIK+) 21
1.6.2. Plasmid pRE112 23
1.7. Tế bào chủ để khuếch đại gen 24
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 25
2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu 25
2.2.1. Các chủng vi sinh vật 25
2.2.2. Hóa chất và môi trường 25
2.2.3. Thiết bị chuyên dụng 28
2.3. Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng 28
2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 28
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid 29
2.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR sau điện di 30
2.3.4. Phương pháp PCR 31
2.3.5. Phương pháp biến nạp của Kang và cs 36
2.3.6. Phương pháp tạo tế bào E. coli χ7213 khả biến 37
2.3.7. Phương pháp tiếp hợp của Kang và cs 38
2.3.8. Phương pháp lên men các loại đường 39
2.3.9. Phương pháp kiểm tra tính ổn định của gen asd đột biến 39
2.3.10. Bố trí thí nghiệm 39
iv
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
3.1. Khuếch đại đoạn gen Pa12, Pa34 41
3.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK(+)/Δasd 42
3.3. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/Δasd 44
4
Cm
Chloramphenicol
5
Cm
r
Gen kháng kháng sinh Chloramphenicol
6
CIRAD
Centre de coopération Iternationale en Recherche
agronomique pour le Dévelopment (French Agricultural
Research Centre for International Development)
7
DAP
DL-α, ε- Diaminopimelic acid
8 DNA Deoxyribonucleic acid
9 E. coli Escherichia coli
10 F Forward
11 Kb Kilobase
12 Km Kanamycin
vi
13
LB vii DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng thống kê tình hình nhiễm bệnh do Salmonella gây ra 2
Bảng 1.1. Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn S. choleraesuis 5
Bảng 1.2. Tính trạng chủ yếu của các loài, loài phụ và đa dạng sinh học của
Salmonella 6
Bảng 1.3. Sức đề kháng của S. choleraesuis 7
Bảng 1.4. Các dạng huyết thanh chủ yếu và tính gây bệnh của Salmonella 9
Bảng 1.5. Các nhóm plasmid chính và đặc điểm 21
Bảng 2.6. Các plasmid dùng trong nghiên cứu 25
Bảng 2.7. Các bộ kit được dùng trong nghiên cứu 26
Bảng 2.8. Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 26
Bảng 2.9. Các enzyme cắt giới hạn 27
Bảng 2.10. Thành phần các môi trường nuôi cấy 27
Bảng 2.11. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (nhân gen asd) 31
Bảng 2.12. Bảng chu trình nhiệt (nhân gen asd) 31
Bảng 2.13. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (kiểm tra tạo dòng plasmid).32
Bảng 2.14. Bảng chu trình nhiệt (kiểm tra tạo dòng plasmid) 32
Bảng 2.15. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (kiểm tra gây đột biến) 33
Bảng 2.16. Bảng chu trình nhiệt (kiểm tra gây đột biến) 33
Bảng 2.17. Thành phần cho một mẫu phản ứng colony PCR 34
Bảng 2.18. Bảng chu trình nhiệt cho phản ứng Colony 34
viii
Hình 3.13. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 6 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp
pBSIIK(+)/Δasd 44
Hình 3.14. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt pBSIIK(+)/Δasd 45
Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 3 dòng chọn lọc vector tái tổ
hợp pRE112/Δasd 46
Hình 3.16. Khuẩn lạc S. choleraesuis sau khi tiếp hợp với E. coli
χ7213/pRE112/Δasd 47
Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ hệ gen của chủng
x
S. choleraesuis với cặp mồi Pa5F-Pa6R (A) và Pa6R-Pa7F (B) 48
Hình 3.18. Khuẩn lạc vi khuuẩn S. choleraesuis Smith và S. choleraesuis/Δasd 57
Hình 3.19. Đường cong sinh trưởng của S. choleraesuis Smith và
S. choleraesuis/Δasd 50
Hình 3.20. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis /Δasd 58
Hình 3.21. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis Smith 59
Hình 3.22. Sản phẩm PCR từ hệ gen của S. choleraesuis Smith và
S.cholereasuis/Δasd các đời 1, 5, 10, 15, 20 với cặp mồi Pa5F - Pa6R (trắng)
và Pa7F - Pa6R (đỏ) 52
Hình 3.23. So sánh trình tự gen Δasd của S. choleraesuis với asd của
S. choleraesuis Smith 55
1
MỞ ĐẦU
Trong thời gian gần đây ngành chăn nuôi ở nước ta được khởi sắc và có sự
tăng trưởng khá cao, đạt 24% giá trị tổng sản lượng ngành nông nghiệp. Theo kết
quả điều tra tại thời điểm 01/4/2010, cả nước có 6 triệu con bò, 2,9 triệu con trâu,
27,3 triệu con lợn, 4 triệu con gia cầm [1]. Chiếm tỉ lệ lớn trong ngành chăn nuôi là
1995
Đan Mạch
Có 2.911 trường hợp nhiễm Salmonella, trong đó
có 19 gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng
và các sản phẩm của trứng bị nhiễm vi khuẩn này.
Hàn Quốc
Có 25,9% mẫu thịt gà tươi sống bị nhiễm
Salmonella.
1999
Hà Lan Có 23% thịt lợn nhiễm Salmonella spp.
Hàng
năm
Mỹ
Có khoảng 4000 trường hợp mắc bệnh do thực
phẩm bị nhiễm Salmonella spp.
Có thể nói rằng ở bất kỳ một cơ sở chăn nuôi nào dù quy mô lớn hay nhỏ đều
có thể xuất hiện bệnh này. Khi đời sống của nhân dân ngày càng được nâng cao,
vấn đề an toàn thực phẩm trong đó có lợn và thịt lợn sạch bệnh, không bị nhiễm
Salmonella là một yêu cầu cấp thiết.
Các đàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây thiệt hại kinh tế cho
người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại đối với con người. Bởi
vậy mà mỗi biện pháp ngăn chặn có hiệu quả ở gia súc đều cần thiết và là điều kiện
tiên quyết góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập cho người chăn nuôi,
chống ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.
Do đó, việc giảm tỷ lệ các trại bị nhiễm mầm bệnh Salmonella sẽ làm cho sự
an toàn thịt lợn tăng lên, và mục tiêu của các nhà khoa học, nhà sản xuất là xây
dựng các đàn gia súc sạch Salmonella. Chính vì thế mà việc nghiên cứu tạo ra các
chủng Salmonella nhược độc ứng dụng trong sản xuất vacxin phòng bệnh ở lợn,
1.1. Đại cương về vi khuẩn S. choleraesuis Smith
Salmonella do Daniel E. Salmon (1850 - 1914) phát hiện ra vào năm
1885. Năm 1880, Grafhy mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và
là người đầu tiên phân lập được S. typhi vào năm 1884 [4].
S. choleraesuis là một trong những vi khuẩn gây bệnh Phó thương hàn lợn.
Lợn bị nhiễm S. choleraesuis có các biểu hiện bao gồm viêm dạ dày, ruột, viêm
phổi, viêm gan, viêm màng não [17].
1.1.1. Phân loại khoa học của S. choleraesuis
Giới (regnum): Bacteria
Ngành (phynum) : Proteobacteria
Lớp (class) : Gamaproteobacteria
Bộ (ordo) : Enterobacteriales
Họ (familia) : Enterobacteriaceae
Chi (genus) : Salmonella
Loài (species) : S. choleraesuis
1.1.2.Đặc điểm hình thái
S. choleraesuis là loại
trực khuẩn gram âm, hình gậy
ngắn, hai đầu tròn, kích thước
0,4 - 0,6 × 1 - 3 µm, không hình
thành giáp mô và nha bào. S.
choleraesuis có khả năng di
động mạnh do có từ 7 - 12 lông
quanh thân [3]. Hình 1.1. Đặc điểm hình thái vi
khuẩn S. choleraesuis chủng Smith.
5
Salmonella [3]
0
C 20 phút
Nước sôi 5 phút
Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp
trong nước trong
5 phút
Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp
trong nước đục
9 phút
8
polymer của các tiểu phần O, mỗi tiểu phần O sẽ gồm 4 - 6 nhóm đường tùy từng
nhóm kháng nguyên O. Các kháng nguyên O khác nhau do chứa các nhóm đường
khác nhau, hay khác nhau do bản chất cộng hóa trị giữa các nhóm đường trong cùng
một tiểu phần hoặc khác nhau về liên kết cộng hóa trị giữa các tiểu phần. Kháng
nguyên O được kí hiệu bằng số và được chia thành từng nhóm khác nhau, một số
nhóm còn được kí hiệu bằng chữ cái latin.
Kháng nguyên H là protein tiểu phần cấu tạo nên phần sợi của lông roi, đây
là phần cấu trúc chính của lông roi, do đó kháng nguyên H còn được gọi là kháng
nguyên lông roi (hay kháng nguyên flagellin). Flagellin chia làm 8 vùng :
Vùng I, II, và VIII là vùng bảo tồn cho chi Salmonella và họ vi khuẩn
đường rột, có vai trò liên kết các flagellin tiểu phần.
Vùng IV, V, VI là vùng biến đổi, nằm trên bề mặt sợ roi, có tính miễn
dịch kháng nguyên cao, kích thích tạo kháng thể chuyên biệt với các kiểu huyết
thanh của Salmonella.
Theo bảng phân loại Salmonella của Kauffman S. choleraesuis có công thức
kháng nguyên: O 6, 7 và H 1, 5 [5].
choleraesuis (vi khuẩn Phó thương hàn lợn) gây ra. Lợn ở mọi lứa tuổi đều có thể
mắc bệnh, phổ biến là lợn con từ cai sữa đến 4 tháng tuổi, ít khi xảy ra ở lợn trên 6
tháng tuổi (nếu có chỉ thấy mắc bệnh ở thể mãn tính).
Vi khuẩn gây bệnh có khả năng tồn tại ngoài môi trường, nếu lợn gặp phải
điều kiện bất lợi do stress như: thời tiết thay đổi, giao mùa, cai sữa, vận chuyển lợn
đi xa, nhập đàn, thay đổi thức ăn một cách đột ngột. Ngoài ra còn do thức ăn bị nấm
mốc, do ký sinh trùng, v.v lúc này vi khuẩn sẽ xâm nhập vào cơ thể lợn lây qua
đường tiêu hóa (gây bệnh cấp tính trên lợn con). Ngoài ra, lợn nái mang thai có thể
truyền bệnh cho bào thai.
11 1.2.2. Cơ chế sinh bệnh Hình 1.4. Sơ đồ con đường xâm nhập gây bệnh của S. choleraesuis ở lợn
1.2.3. Triệu chứng
Thể cấp tính
Thể cấp tính
Lách sưng to, đặc biệt là 1/3 phần ở giữa sưng to hơn, dai như cao su, màu
xanh thẫm.
Hạch lâm ba sưng, tụ máu, xuất huyết.
Gan tụ máu có nốt hoại tử bằng hạt kê.
Thận có những điểm hoại tử ở vỏ thận.
Phổi tụ máu và có các ổ viêm, ruột sưng nhiều nước.
Niêm mạc dạ dày và ruột viêm đỏ, có điểm xuất huyết, đôi khi có vết loét
như hạt đậu.
Thể mãn tính
Bệnh tích chủ yếu ở dạ dày và ruột.
Niêm mạc dạ dày và ruột viêm đỏ từng đám. Ở ruột già và ruột non có
nhiều đám loét bờ cạn, những đám loét này phủ fibrin.
Lách không sưng, đôi khi có những nốt hoại tử to bằng quả mận.
Gan có nốt viêm hoại tử màu xám, to bằng hạt đậu.
Phổi viêm sưng có ổ hoại tử màu vàng xám.
1.2.5. Phòng bệnh
Mua lợn từ nơi không có bệnh, cách ly và theo dõi lợn ít nhất 2 tuần rồi mới
nhập đàn.
Vệ sinh phòng bệnh
Định kỳ sát trùng chuồng trại, máng ăn, máng uống, đảm bảo cung cấp đủ
thức ăn và nước uống sạch, không cho lợn ăn thức ăn hôi thiu, ẩm mốc.
Nên áp dụng biện pháp cùng vào - cùng ra, chuồng trại nên được để trống
khoảng 5 - 7 ngày.
Phải sát trùng chuồng trại và dụng cụ thật kỹ sau mỗi lứa lợn.
Phòng bệnh bằng vacxin
Hiện nay, tại Việt Nam có hai loại vacxin phòng bệnh Phó thương hàn lợn:
đó là vacxin chết và vacxin nhược độc. Vacxin chết phòng bệnh Phó thương hàn
13
nguyên. Các đáp ứng miễn dịch chống lại cơ chất không kháng nguyên, hoàn toàn
trái ngược với sự ngăn chặn nhiễm trùng và có thể làm ảnh hưởng hoặc làm giảm
đáp ứng miễn dịch đối với cơ chất kháng nguyên. Chúng có thể tạo ra các phản ứng
phụ có hại do các cơ chất ngoài mong muốn như các loại nội độc tố (Wegenr và
cộng sự, 1998).
Các loại vacxin sống nhược độc có khả năng tạo ra hai loại miễn dịch là
miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào. Mặt khác, khi sử dụng vi
khuẩn nhược độc làm tế bào chủ mang các kháng nguyên vacxin protein tái tổ hợp
làm kéo dài sự hiện diện của kháng nguyên với hệ thống miễn dịch của động vật
được tiêm vacxin. Khi sử dụng vi khuẩn nhược độc làm tế bào chủ mang kháng
nguyên vacxin tái tổ hợp, những gen mã hóa các kháng nguyên vacxin được dòng
hóa trên các plasmid bên trong các tế bào vi khuẩn nhược độc.
Những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy
trình sản xuất các loại vacxin sống nhược độc. Tuy nhiên, các loại vacxin sống
nhược độc này chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng
vi khuẩn vacxin nhược độc quay trở lại độc lực cao là rất lớn (Moos, 1995; Terpstra
and Kroese, 1996a,b).
Các chủng vi khuẩn Salmonella nhược độc là chủng đầu tiên được sử dụng
làm vacxin phòng các bệnh do vi khuẩn Salmonella gây trên người và động vật
(Germanier và cộng sự, 1971; 1975). Sau này các chủng Salmonella nhược độc
được biến đổi một số gen để sử dụng làm vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ
hợp đã được dòng hóa các kháng nguyên ngoại lai. Những vacxin tái tổ hợp này tạo
miễn dịch do các kháng nguyên ngoại lai đồng thời tạo miễn dịch do các kháng
nguyên của vi khuẩn Salmonella.
Một hệ thống tế bào chủ - vector biểu hiện cân bằng gây chết (a balanced-
lethal host-vector system) dựa trên gen asd (aspartate β-semialdehyde
dehydrogenase) đã được sử dụng cho những kháng nguyên tái tổ hợp đặc hiệu từ
các plasmid asd
+
SL3261 làm vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng
nguyên của Cryptosporidium parvum.
Copyright: Tài liệu đại học ©