I. NGUYÊN LIỆU LÀM MÔI TRƯỜNG VI SINH VẬT:
1. Vi khuẩn lactic
1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae.
Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình gậy, đứng riêng lẻ hoặc tạo chuỗi,
thuộc vi khuẩn gram dƣơng (+).
Vi khuẩn lactic không di động.
Vi khuẩn lactic không tạo bào tử (tuy nhiên hiện nay ngƣời ta tìm thấy một số
giống trong họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử).
Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn kị khí chịu dƣỡng.
Vi khuẩn lactic không chứa cytochrom và enzyme catalase.
Vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh.
Chúng phân giải H
2
O
2
để tạo ra nƣớc và O
2
để phát triển.
1.2. Sự phân bố:
Ít gặp trong đất và nƣớc,thƣờng phát triển trong những môi trƣờng có chứa
nhiều chất hữu cơ phức tạp nhƣ:
- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thƣờng gặp Lactobacillus lactic,
Lactobacillus bulgarius, Lactobacillus helviticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus
ferment,Lactobacillus brevis, Streptococcus diacetyllactis. Để tồn tại trong môi trƣờng
sữa vi khuẩn lactic tổng hợp ATP từ cơ chất lactose.
- Trên bề mặt thực vật và xác thực vật đang bị phân giải hay có Lactobcillus
plantanium, Lactobcillus delnikii, Lactobcillus ferment, Lactobacillus brevis,
Streptococcus lactis Chúng còn đƣợc tìm thấy trên các loại rau quả, trái cây.
- Trong ruột và các niêm dịch ở ngƣời và động vật có Lactobacillus acidophilus,

Đồng hình
lactat
DL và L
(+)

Lactobacillus
Đồng hình
lactat

Thermobacterium
Đồng hình
lactat
D
(-)
,L
(+),
DL
Streptobacterium
Dị hình
(tùy tiện)
Lactat : axetat
1 : 1
D
(-)
,L
(+),
DL
Betabacterium
Dị hình
Lactat : axetat : CO

Ví dụ: Streptococus lactic, Lactobacillus casei, L. plantarum,…
- Vi khuẩn lactic ƣa nhiệt: 37-45 C
Ví dụ: Streptococus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L. helvetcus,…

2. SINH KHỐI VI KHUẨN LACTIC
2.1. Mục đích thu nhận sinh khối vi khuẩn lactic
Trong thời gian trƣớc đây mỗi cơ sở sản xuất có phƣơng pháp và qui trình riêng
để nhân giống và bảo quản giống dùng cho sản xuất. Khi cần sử dụng ngƣời ta sẽ tiến
hành nhân giống qua nhiều giai đoạn theo nguyên tắc thu nhận một canh trƣờng vi sinh
vật thuần khiết. Hiện nay một số nhà máy chế biến thực phẩm và những nhà máy sản xuất
các sản phẩm trao đổi chất từ vi sinh vật vẫn đang sử dụng phƣơng pháp này nên giống vi
sinh vật đƣợc xem là độc quyền sở hữu của mỗi nhà máy.
Từ những năm 1980, trên thế giới phát triển mạnh một ngành công nghiệp mới,
công nghiệp sản xuất và cung cấp giống vi sinh vật. Các chế phẩm giống thƣơng mại bao
gồm đủ loại: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi… Vi khuẩn lactic cũng không ngoại lệ, sinh
khối vi khuẩn lactic đƣợc thu nhận, bảo quản và cung ứng cho ngành công nghiệp sản
xuất các sản phẩm từ sữa.
Chế phẩm giống thƣơng mại có thể cấy trực tiếp vào môi trƣờng lên men hoặc
hoạt hoá chúng trên một môi trƣờng dinh dƣỡng trong một khoảng thời gian nhất định
trƣớc khi cấy.
2.2. Các loài vi khuẩn lactic dùng trong công nghiệp sản xuất sinh khối vi khuẩn
lactic
Quan trọng là sinh khối của vi khuẩn lactic lên men đồng hình.
Streptococcus thermophilus
Lactobacillus bulgaricus
Streptococus lactic
Streptococcus cremoris
Lactobacillus acidophilus
Nhóm vi khuẩn sinh hƣơng



Hình 3: Streptococcus thermophilus

 Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, đƣờng kính 0.7-0.9 µm, không chuyển động,
thƣờng kết thành chuỗi ngắn, gram (+).
 Phát triển tốt ở 40-45 C, pH 5.8-6.0. Không phát triển đƣợc ở 53 C và dƣới 20 C,
sống đƣợc ở 65 C trong 30 phút.
 Không phát triển đƣợc trong môi trƣờng sữa chứa 0.01% methylen blue, môi
trƣờng máu chứa 10% mật.
 Có khả năng lên men glucose, fructose,lactose, saccharose.
 Nhạy cảm với các chất kháng sinh 0.01µg/ml tetracycline hay 0.1µg/ml
chloremphen.
d/ Streptococcus cremoris
Hình 4: Streptococcus cremoris
 Cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tạo thành từng chuỗi rất dài, gram (+).
 Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 30 C.
 Chúng không phát triển đƣợc ở nồng độ NaCl 4%.
 Khi lên men đƣờng tạo ra acid acetic, CO
2
, diacetyl.
 Chúng có khả năng tạo ra những chất kháng khuẩn

e/ Streptococcus lactic Hình 5: Streptococcus lactic
 Thuộc chuỗi cầu khuẩn, gram (+).

trình sử lý thích hợp. Các đặc diểm cần lƣu ý ở mật rỉ bao gồm:
Rỉ đƣờng có màu nâu sẫm. Màu này khó bị phá hủy trong quá trình lên men. Sau
lên men chúng bám vào sinh khối vi sinh vật và bám vào sản phẩm. Việc tách màu ra
khỏi sinh khối và sản phẩm thƣờng rất tốn kém và rất khó khăn.
Hàm lƣợng đƣờng khá cao (thƣờng nằm trong khoảng 40-50%). Lƣợng này chủ
yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng với nồng độ thích hợp.
Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình lên men là hệ keo trong mật rỉ. Keo
càng nhiều, khả năng hòa tan oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật
càng kém. Do đó công việc quan trọng của nhất khi sử dụng mật rỉ là phải phá hệ keo
này.
Vì rỉ đƣờng là chất dinh dƣỡng khá lý tƣởng nên chúng rất dễ bị vi sinh vật xâm
nhập và phát triển. Nhƣ vậy chất lƣợng mật rỉ cũng dễ thay đổi theo thời gian bảo
quản
Thành phần hóa học:
Thành phần rỉ đƣờng dao động nhƣ sau:
- Nƣớc chiếm 15-20%, chất khô chiếm 80-85%.
- Trong đó, có 60% là đƣờng ( 40% là đƣờng saccharose, 20% là fructose và
glucose và 40% chất còn lại là chất phi đƣờng )
- Trong thành phần phi đƣờng có khoảng 30-32% hợp chát hữu cơ và 6-105
hợp chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ có:
K
2
O: 3,5% Fe
2
O
3
: 0,2% MgO: 0,1% Sulfat: 1,6%
CaO: 1,5% SiO
2
: 0,5% P

2

0.5
SO
3

1.6
Cl
2

0.4
Na
2
O + Fe
2
O
3
+

Al
2
O
3

0.2
P
2
O
5

Các chất màu của rỉ đường mía bao gồm:
- Caramel: xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân saccharose kèm theo loại trừ
nƣớc và không chứa một chút nitơ nào. Khi pH không đổi, tốc độ tạo chất caramen tỷ lệ
thuận với nhiệt độ phản ứng.
-
Phức chất polyphenol-Fe
2+:
có màu vàng xanh, không bị loại hết trong giai
đoạn làm sạch và tồn tại trong mật rỉ

- Melanodin: đây là sản phẩm ngƣng tụ của đƣờng khử và acid amin mà chủ
yếu là acid aspartic. Sản phẩm ngƣng tụ quen biết nhất là acid fuscazinic đóng vai trò
quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đƣờng.
- Melanin: đƣợc hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acidamin thơm
nhờ xúc tác của enzym polyphenol oxydaza khi có mặt của oxy và Cu
+2
.
- Các acid amin thơm thƣờng bị oxy hóa là tiroxin và brenzcatechin. Các
melanin thƣờng bị loại hết ở giai đoạn làm sạch nƣớc đƣờng nên chỉ tìm thấy một lƣợng
rất nhỏ trong rỉ đƣờng.
- Chất keo: đƣợc hình thành bởi potein và pectin. Các chất này ảnh hƣởng rất
nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao bọc quanh tế bào, ngăn cản
Vitamin
Hàm lượng (mg%)
Thiamin
0.5
Riboflavin
0.12

I
100000
Rất tốt, không cần xử lý
II
100000- 1000000
Trung binh, cần thanh
trùng
III
1000000- 5000000
Nhiễm nặng cần xử lý
nghiêm ngặt



Mật rỉ
Xử lý
Chuẩn bị
Môi trƣờ ng
Thanh trùng

Hóa học: giảm nồng độ chất khô.
Vật lý: giảm độ nhớt.
Hoá lý: tăng độ hoà tan các chất.
c. Thực hiện:
Pha loãng với nƣớc theo tỉ lệ V
mật rỉ
: V
nƣớc
= 1 : 3
1.2 Xử lý dịch pha loãng:
Truớc tiên, ta phải tẩy màu và tách các keo có trong mật rỉ
1.2.1. Acid hoá:
a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men và tiêu diệt vi sinh vật
b. Biến đổi:
Hóa học: đƣờng saccharose chuyển thành glucose và fructose dƣới sự xúc tác
của acid; pH giảm về 2.8-3.0
Hóa lý: hệ keo bị phá vỡ
Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt do nhiệt độ cao và pH thấp.
c. Thực hiện:
Lƣợng acid sunfuric đậm đặc thêm vào là 5% khối lƣợng dung dịch. Trong giai đoạn
này, ta đun dung dịch đến 90-95
o
C trong 6 giờ. Sau đó ta tiến hành ly tâm thu dịch trong.
d. Thiết bị và thông số công nghệ:
- Nồi phản ứng .
và nắp. Trên thiết bị có các khớp nối để nạp các chất tải nhiệt, chảy tràn sản phẩm, để nối
ống quá áp, nối khớp đầu ống nguyên liệu, khảo sát chất liệu, các khớp nối để nạp và thải
chất tải nhiệt và sản phẩm, van an toàn, nhiệt kế. Sau khi nạp vào thiết bị một lƣợng nƣớc
nhất định.Tiến hành đun nóng môi trƣờng đến một nhiệt độ đã cho bằng phƣơng tiện điều
chỉnh tự động.
Tần số trộn của máy khuấy 0,2 ÷ 0,33 vòng/s, phụ thuộc vào dạng cơ cấu trộn
và các tính chất của các cấu tử đem trộn.
Khi thiết kế máy trộn dạng tuabin, số vòng quay 3 ÷ 3,3 vòng/s, dạng khung 0,33
÷ 1 vòng /s.
Dẫn động máy trộn đƣợc thực hiện nhờ động cơ điện qua hộp giảm tốc.
1.2.2. Ly tâm thu dịch trong:
a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men
b. Biến đổi:
Hóa học: tạp chất bị loại bỏ, giữ lại chất hòa tan
Hóa lý: tách pha rắn khỏi pha lỏng
Vật lý: tăng độ trong, giảm khối lƣợng riêng dung dịch
c. Thiết bị và thông số công nghệ:
Hình 7:Thiết bị ly tâm lọc
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 14

Thiết bị ly tâm lọc hoạt động theo nguyên tắc: khi hệ thống quay với tốc độ cao
tạo ra lực ly tâm mạnh và đẩy các thành phần pha lỏng và rắn ra sát thành thiết bị nhƣ
hình vẽ, thành thiết bị có gắn vải lọc để các cấu tử chất hoà tan đi qua và giữ lại các thành
phần pha rắn.


này mà không làm ảnh hƣởng đến khả năng lên men đối với các nguồn cacbon thông
thƣờng.
2.1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng nitơ:
Nguồn nittơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH
3
,NH
4
+
.Sau khi đồng hóa gốc
NH
4
+
trong môi trƣờng sẽ tích lũy các anion vô cơ (SO
4
2-
,HPO
4
2-
,Cl
-
…) làm hạ
thấp rất nhiều trị số pH của môi trƣờng,ta phải điều chỉnh pH của môi trƣờng nuôi
cấy.
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 15
Đa số vi khuẩn không có khả năng sinh tổng hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa
nitơ từ nguồn dinh dƣỡng vô cơ. Vì vậy, để đảm bảo cho sự phát triển của mình, vi khuẩn
lactic phải dùng nguồn nitơ có sẵn trong môi trƣờng dƣới dạng các acid amin. Tuy nhiên
để vi khuẩn phát triển bình thƣờng thì ngoài nguồn nitơ của acid amin thì vi khuẩn lactic

Lactobacillus arabinosus
Leuconostoc menssenteroides
Streptococcus faecalis
Riboflavin
Lactobacillus casei
Streptococcus lactic

Acid pantothenic

Lactobacillus casei
Leuconostoc menssenteroides
Streptococcus faecalis
Panteterin.pantetin

Lactobacillus acidophyllus
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus casei

Acid lipoic

Streptococcus lactic
Streptococcus faecalis
Lactobacillus fermenti
Thiamin

Streptococcus lactic
Lactobacillus plantarum
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 16

+ Ca : có vai trò quan trọng đáng kể trong việc xây doing cấu trúc tinh vi của tế
bào,vai trò cầu nối trung gian giữa các thành phần quan trọng của tế bào sống.
+ Zn : tham gia vào nhiều quá trình enzyme, có tác dụng đáng kể trong việc
hoạt hóa các enzyme.
+ Mn : chứa trong một số enzyme hô hấp, có vai trò trong việc hoạt hóa một số
enzyme. Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 17
Bảng 6: Thành phần môi trường nuôi cấy

Casein peptone, tryptic digest
10.00
g/l
Cao thịt (Meat extract)
10.00
g/l
Cao nấm men (Yeast extract)
5.00

4
x 7 H
2
O
0.20
g/l
MnSO
4
x H
2
O
0.05
g/l
Điều chỉnh sao cho pH
khoảng 6.2 - 6.5.

 Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến sự sinh trƣởng và phát triển của
vi khuẩn lactic
Sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic chịu tác động của các yếu tố môi
trƣờng nhƣ:
Nhiệt độ:
-Hoạt động trao đổi chất là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này
phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố ảnh hƣởng sâu sắc đến các quá trình sống
của tế bào
-Các tế bào sinh dƣỡng của vi khuẩn lactic bị chết ở nhiệt độ cao, protein bị biến
tính
-Nhiệt độ thấp có thể làm bất hoạt quá trình vận chuyển các chất hòa tan qua màng

giảm hàm lƣợng cơ chất cacbon và nguồn nitơ của môi trƣờng
Trong thực tế, tuỳ thuộc vào giống VSV, thành phần hoá học của môi trƣờng và
mức độ nhiễm VSV trong các nguyên liệu pha chế môi trƣờng mà các nhà sản xuất sẽ đề
xuất chế độ thanh trùng với giá trị nhiệt độ và thời gian thích hợp, thƣờng áp dụng chế độ
thanh trùng dao động trong khoảng 80 - 90 C trong 30 - 60 phút.

 Phƣơng pháp thực hiện: thiết bị ống lồng ống
 Thông số công nghệ
nhiệt độ 85-90
0
C a. Cấu hình nhiều kênh ; b. Cấu hình nhiều ống
Hình 8 : Thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 19

4) Nhân giống
a. Yêu cầu
Số lƣợng tế bào trong môi trƣờng nuôi lên giá trị cao nhất, trong khoảng thời
gian ngắn nhất, với những chi phí thấp nhất về nguyên liệu và năng lƣợng.
Sinh khối thu đƣợc phải có hoạt tính lên men cao, tỷ lệ tế bào chết càng thấp
càng tốt.
Trong quá trình nhân giống cần đảm bảo cho giống đƣợc thuần khiết, điều này rất
quan trọng vì nếu giống có lẫn các vi sinh vật lạ thì trong quá trình lên men sẽ gây hƣ
hỏng và làm sản phẩm không đạt yêu cầu và đôi khi còn có hại cho ngƣời tiêu thụ.
b. Cơ sở khoa học của quá trình nhân giống
Chọn môi trƣờng với thành phần cơ chất thích hợp để nuôi vi sinh vật.

Trang 20
SƠ ĐỒ TỔNG QUÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI SINH VẬT CHO SẢN XUẤT
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 21
 Trong phân xưởng
Vi khuẩn lactic đã đƣợc nuôi cấy riêng ở phân xƣởng nhân giống. Khi lƣợng
giống đảm bảo về số lƣợng tế bào( khoảng x*10
6
tế bào/1ml), tiến hành lên men.
5. Nuôi cấy:
Ngƣời ta chuyển giống vào thùng lên men với tỷ lệ giống là 2.5- 3%. Trong sản
xuất lactic, ngƣời ta thƣờng sử dụng các loại vi khuẩn lactic đồng hình , trong đó vi
khuẩn lactic lactobacillus đƣợc sử dụng nhiều hơn cả.
- Đối với vi khuẩn này ,ngƣời ta thƣờng duy trì nhiệt độ trong suốt quá trình lên men
là 40
0
C , pH duy trì ở 5-6, thời gian lên men 1-8 ngày, tuy nhiên,những điều kiện lên men
trên có thể thay đổi tuỳ theo giống vi khuẩn lactic mà ta sử dụng để sản xuất.
- Trong quá trình lên men ngƣời ta tiến hành khuấy trộn liên tục môi trƣờng. Nhiều
trƣờng hợp, ngƣời ta tiến hành thổi khí, khi thổi khí lƣợng acid lactic tạo ra cao hơn nhiều
so với không thổi khí.
a. Phƣơng pháp thực hiện:
Dùng thiết bị lên men bề sâu, gián đoạn:
Thiết bị lên men có thể tích 63 m
3
: Dạng thiết bị lên men này là một xilanh

2
.
Bề mặt làm việc bên trong 45 m
2
gồm ống xoắn 9 có đƣờng kính 600 mm với số
vít 23 khi tổng chiều cao của ruột xoắn 2,4 m.
Thiết bị lên men đƣợc tính toán để hoạt động dƣới áp suất dƣ 0,25 MPa và
để thanh trùng ở nhiệt độ 90-95
0
C, cũng nhƣ để hoạt động dƣới chân không. Trong
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 23
quá trình nuôi cấy vi sinh vật, áp suất bên trong thiết bị 50 kPa; tiêu hao không khí
tiệt trùng đến 1 (m
3
/phút). Chiều cao cột chất lỏng trong thiết bị 5 ÷ 6 m khi chiều
cao của thiết bị hơn 8 m.
Để tiện lợi cho việc thao tác và tránh những sai lầm cần dán vào thiết bị sơ
đồ chỉ dẫn thao tác .
Để đảm bảo tiệt trùng trong suốt quá trình (giữ đƣợc hơi), các trục của cơ
cấu chuyển đảo phải có vòng bít kín. Các vòng bít kín đƣợc tính toán để hoạt động
ở áp suất 0,28 MPa và áp suất dƣ không nhỏ hơn 2,7 kPa, nhiệt độ 30 ÷ 250
0
C và
số vòng quay của trục đến 500 vòng/ phút. Nhờ các vòng đệm này mà ngăn ngừa
đƣợc sự rò rỉ môi trƣờng hay sự xâm nhập không khí vào khoang thiết bị ở vị trí
nhô ra của trục.
Vòng bít kín khi tiếp xúc với môi trƣờng làm việc đƣợc chế tạo bằng thép
X18H10T và X17H13M2T, cũng nhƣ bằng titan BT-10. Thời gian hoạt động ổn

26- Cung cấp khí thải từ thiết bị; 27- Cung cấp nước; 28- Van rót;
29- Van để rót nước từ áo; 30- Van để nạp nước lạnh;
31- Ống nhánh để nạp nước lạnh; 32- Lược; 33- Ap kế;
34- Van an toàn; 35- Cảm biến nhiệt độ;
36, 37- Các dụng cụ thứ cấp để đo nhiệt độ và độ pH;
38- Cảm biến pH met; 39- Thiết bị lên men; 40- Cơ cấu để làm sạch không khí

Hình10 . Sơ đồ chỉ dẫn thao tác của thiết bị lên men
 Thông số công nghệ
- pH 4.5
- nhiệt độ 30-32
o
C
Cơng nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 25
b. Các biến đổi xảy ra trong quá trình nuôi cấy
 Các biến đổi sinh học
Giai đoạn thích nghi (pha lag):
 Vi khuẩn chưa có sự phân chia nhưng có sự tăng rõ rệt về thể tích và
khối lượng tế bào do quá trình tổng hợp các chất, trước hết là các chất
cao phân tử (protein, enzyme, acid nucleic…) diễn ra mạnh mẽ.
 Hình thành các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp cơ chất và các
enzyme nằm trong quá trình chuyển hoá glucide.
Giai đoạn tăng trưởng (pha log):
 Vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo cấp luỹ thừa, nghóa là sinh khối
và số lượng tế bào tăng rất nhanh.
 Ở giai đoạn này xảy ra hàng loạt các biến đổi quan trọng để tạo sinh
khối tế bào: sự tổng hợp enzyme tiếp tục được xúc tiến, sự chuyển hoá
các hợp chất cacbonhydate, sự chuyển hoá các hợp chất chứa Nitơ…