ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHU THỊ THỦY NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN THANH LONG BẰNG CHẾ PHẨM SINH
HỌC NANO CHITOSAN KẾT HỢP VỚI TINH DẦU NGHỆ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHU THỊ THỦY

NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN THANH LONG BẰNG CHẾ PHẨM SINH
HỌC NANO CHITOSAN KẾT HỢP VỚI TINH DẦU NGHỆ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

1.3.3. Biện pháp bảo quản rau hoa quả tươi sau thu hoạch 28
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Nguyên vật liệu 32
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32
2 1.2. Hóa chất sử dụng 32
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 33
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 34
2

2.2.1. Phương pháp đo độ đục định lượng tế bào nấm men 34
2.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc nấm men 35
2.2.3. Phương pháp tìm nồng độ diệt tối thiểu (MBC) của hỗn hợp nano chitosan
và tinh dầu nghệ cho nấm men 36
2.2.4. Phương pháp kiểm tra khả năng đối kháng nấm mốc của chế phẩm tinh dầu
nghệ và nano chitosan 37
2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính đối kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ
và nano chitosan trên quả thanh long 38
2.2.6 Bảo quản thanh long trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng NCS-TDN. 38
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40
3.1. Đánh giá khả năng đối kháng nấm men của chế phẩm nano chitosan và tinh dầu
nghệ in vitro 40
3.2. Đánh giá khả năng đối kháng nấm mốc của chế phẩm nano chitosan và tinh dầu
nghệ in vitro 43
3.3 Đánh giá khả năng đối kháng nấm của nano chitosan-tinh dầu nghệ in vivo trên
thanh long 46
3.4. Đánh giá khả năng bảo quản thanh long bằng chế phẩm nano chitosan và tinh
dầu nghệ 48
3.4.1. Bảo quản thanh long ở nhiệt độ phòng 48
3.4.2. Bảo quản thanh long ở nhiệt độ lạnh (10

4

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 1.1: Giá trị dinh dƣỡng trong 100g quả thanh long.
Bảng 2.1: Độ chuẩn Mc Farland ở bƣớc sóng 550nm.
Bảng 2.2: Sơ đồ thí nghiệm xác định tính đối kháng nấm men của NCS-TDN.
Bảng 3.1: Kết quả đo OD ở bƣớc sóng 550nm của mẫu TL1.
Bảng 3.2: Khả năng ức chế sinh trƣởng nấm men của NCS-TDN.
Bảng 3.3: Hoạt tính đối kháng nấm mốc của NCS-TDN.
Bảng 3.4: Khả năng ức chế nấm của NCS-TDN trên thanh long.
Bảng 3.5: Kết quả thanh long đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Bảng 3.6: Kết quả thanh long bảo quản lạnh 10±2
0
C.
Bảng 3.7: Kết quả phân tích hàm lƣợng dinh dƣỡng của thanh long sau khi bảo quản
lạnh 30 ngày.
Sơ đồ 2.1: Nghiên cứu khả năng bảo quản thanh long sau thu hoạch của chế phẩm
NCS-TDN. 5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitosan đƣợc điều chế từ chitin.
Hình 1.2: Hình thái cây nghệ
Hình 1.3: Cấu trúc của các hợp chất curcumin trong tinh dầu nghệ.
Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất trong tinh dầu nghệ.
Hình 1.5: Vị trí và các cơ chế trong tế bào vi khuẩn đƣợc cho là điểm hoạt tính của tinh

hạt nano chitosan. Cùng với tinh dầu nghệ, nano chitosan là chất có khả năng kháng
nấm và vi khuẩn mạnh.
Quả tƣơi và rau rất dễ bị hỏng và mẫn cảm đối với các bệnh sau thu hoạch, hạn
chế thời gian bảo quản và đƣa chúng ra thị trƣờng. Ngoài ra, hƣ hỏng sau thu hoạch
gây thất thu kinh tế đáng kể trên toàn thế giới. Nhƣ đã biết, các loại thuốc diệt nấm
tổng hợp đƣợc sử dụng từ lâu nhƣ phƣơng thức chính để kiểm soát các bệnh sau thu
hoạch. Nhƣng hiện ngƣời ta lo ngại về ảnh hƣởng của các chất này đến sức khỏe ngƣời
tiêu dùng cũng nhƣ sự xuất hiện của các nguồn bệnh kháng thuốc. Vì vậy cần có các
biện pháp thay thế để kiểm soát nguồn bệnh sau thu hoạch có hiệu quả, dƣ lƣợng thấp,
ít độc hoặc không độc đối với cơ thể không đích.
Trong sản phẩm rau hoa quả của Việt Nam, quả Thanh Long đang chiếm vị trí
quan trọng trong xuất khẩu, mang lại hiệu quả kinh tế cao. Vì vậy việc sử dụng các
chất hoạt tính sinh học tự nhiên để bảo quản quả Thanh Long không những có ý nghĩa
kinh tế, mà còn mở ra phƣơng pháp mới trong ngành bảo quản sau thu hoạch ở nƣớc ta.
7

Với đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu bảo quản Thanh long bằng chế phẩm sinh
học nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ ” sẽ đóng góp thêm một phƣơng pháp bảo
quản rau hoa quả an toàn và hiệu quả.
Mục tiêu của đề tài:
 Thử nghiệm in vitro chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ với vi sinh vật
gây hỏng quả Thanh Long để tìm nồng độ ức chế vi sinh vật tối thiểu MBC.
 Thử nghiệm chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ trên quả để kéo dài thời
gian bảo quản thanh long, đảm bảo thanh long còn tƣơi, không bị vi sinh vật làm
hỏng quả.
Nội dung nghiên cứu:
 Xác định hoạt tính đối kháng nấm của chế phẩm nano chitosan kết hợp với tinh
dầu nghệ.
 Nghiên cứu thăm dò ứng dụng nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ trong
bảo quản quả thanh long.

Chitosan cũng đƣợc tìm thấy trong tự nhiên, chẳng hạn nhƣ trong thành tế bào
của nấm thuộc lớp Zygomycetes [43], tảo xanh Chlorella sp., nấm men và động vật
nguyên sinh cũng nhƣ lớp biểu bì trong côn trùng [ 47]. Gần đây trong công nghệ lên
men cho thấy nấm (Aspergillus niger) có thể cung cấp một nguồn thay thế chitosan.
1.1.2. Phương pháp điê
̀
u chê
́
nano chitosan từ chitosan.
Công nghệ nano là một công nghệ rất quan trọng trong khoa học, chủ yếu là do
ứng dụng rộng rãi của nó trong một phạm vi rộng lớn bao gồm các ngành kỹ thuật, y
học, hóa học và sinh học. Việc sử dụng các biopolymer nhƣ polysaccharide trong công
nghệ nano ngày càng đƣợc quan tâm, là trọng tâm các nghiên cứu của các nhà khoa
học trên toàn thế giới.
Trong 30 năm qua, kỹ thuật điều chế nano chitosan đã đƣợc phát triển dựa trên
công nghệ chitosan vi hạt. Nano chitosan có thể đƣợc chế tạo bằng một vài phƣơng
pháp khác nhau. Trƣớc kia, ngƣời ta dùng sodium sulphate nhƣ chất để tủa. Năm 1994,
một số tác giả đã sử dụng glutaraldehyde nhƣ chất liên kết để liên kết chéo các nhóm
amino tự do của chitosan, sau đó nhũ tƣơng hóa (emulsifier), tạo hạt 5-fluorouracil (5-
FU) chitosan với kích thƣớc trung bình 0,8 ± 0,1µm [42]. Phƣơng pháp này hiện vẫn
đƣợc dùng. Nhìn chung, kỹ thuật chế tạo hạt nano chitosan đã đƣợc phát triển dựa trên
kỹ thuật vi hạt chitosan. Có ít nhất 4 phƣơng pháp: sự đông đặc ion hóa (ionotropic
gelation); vi nhũ tƣơng (microemulsion), khuếch tán dung môi nhũ tƣơng
(emulsification solvent diffusion) và tổ hợp đa điện phân (polyelectrolyte complex).
10

Hai phƣơng pháp thƣờng sử dụng là ionotropic gelation và tự lắp ráp polyelectrolyte
[50].
Phương pháp Ionotropic gelation
Nano chitosan chuẩn bị bằng kỹ thuật gel ionotropic lần đầu tiên đƣợc Calvo và

PLGA) [7]. Phƣơng pháp này đƣợc dựa trên một phần sự trộn lẫn của dung môi hữu cơ
bằng nƣớc. Nhũ tƣơng thu đƣợc sau khi trộn chất hữu cơ vào dung dịch chitosan có
chứa một chất ổn định (poloxamer) khuấy cơ, tiếp theo là đồng nhất áp suất cao. Nhũ
tƣơng này sau đó đƣợc pha loãng với một số lƣợng lớn nƣớc để khắc phục sự trộn lẫn
dung môi hữu cơ trong nƣớc. Sự kết tủa polymer xuất hiện nhƣ là kết quả của sự
khuếch tán dung môi hữu cơ vào trong nƣớc, dẫn đến hình thành của các hạt nano.
Phƣơng pháp này phù hợp cho các loại thuốc kỵ nƣớc và cho thấy tỷ lệ ngậm thuốc
cao. Những nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp này bao gồm điều kiện xử lý khắc
nghiệt (ví dụ, việc sử dụng các dung môi hữu cơ) và lực cắt cao đƣợc sử dụng khi điều
chế các hạt nano.
Phương pháp polyelectrolyte complex (PEC)
Màng polyelectrolyte hoặc tập hợp nhóm polyelectrolyte là một thuật ngữ để mô
tả màng đƣợc hình thành bằng cách tự lắp ráp của polyme mang cation và DNA
plasmid. Cơ chế của PEC hình thành liên quan đến việc trung hòa điện tích giữa cation
polymer và DNA dẫn phá vỡ phân tử ƣa nƣớc. Một số polyme cation (tức là gelatin,
polyethylenimine) cũng có tính chất này. Nói chung, kỹ thuật này cung cấp phƣơng
pháp chuẩn bị đơn giản. Các hạt nano đƣợc hình thành một cách tự nhiên sau khi bổ
12

sung các DNA vào chitosan hòa tan trong dung dịch axit axetic, theo khuấy cơ học ở
nhiệt độ phòng. Kích thƣớc phức hợp có thể đƣợc thay đổi từ 50 nm đến 700 nm. [7]
1.1.3. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật của chitosan
Khả năng đối kháng vi sinh vật của chitosan đƣợc sử dụng rộng rãi, tuy nhiên,
cơ chế đối kháng vi sinh vật chính xác của nó cho đến nay vẫn chƣa đƣợc xác định rõ
ràng.
Một vài cơ chế tác động kháng khuẩn của chitosan đã đƣợc đƣa ra: (i) tạo phức
với các nguyên tố vết hoặc các chất dinh dƣỡng thiết yếu, nhƣ vậy ức chế sinh trƣởng
của vi khuẩn; (ii) có thể tƣơng tác với các nhóm anion trên bề mặt tế bào và tạo ra các
phức hợp điện phân với các hợp chất trên bề mặt vi khuẩn, tạo ra một lớp không thấm
quanh tế bào, ngăn cản sự vận chuyển của các chất hòa tan cần thiết vào trong tế bào.

(MW = 9300) xếp chồng lên nhau trên thành tế bào và ức chế sự tăng trƣởng của vi
khuẩn E. coli. Họ cho rằng hoạt tính kháng khuẩn có liên quan đến việc kìm hãm các
hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn bằng cách ngăn chặn cung cấp chất dinh dƣỡng
qua màng tế bào [52].
Rõ ràng, các cơ chế hoạt động không loại trừ lẫn nhau, kể từ lúc chitosan ức chế
hoạt động của vi sinh vật, và cuối cùng có thể dẫn đến một quá trình giết hại.
1.1.4. Ứng dụng nano chitosan
Các hạt nano chitosan chủ yếu đƣợc ứng dụng trong y học nhƣ chất mang và
phân phối thuốc. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu tạo hạt nano trên cơ sở
polysacarit, đặc biệt là chitosan. Nói chung, những hạt nano này mới chỉ đƣợc khảo sát
về tính chất hóa lý và khả năng mang thuốc, đƣợc ứng dụng trong sinh y, cụ thể là ứng
14

dụng dẫn thuốc còn hầu nhƣ chƣa đƣợc nghiên cứu cho những ứng dụng khác (ngoại
trừ nghiên cứu về axit glutamic ứng dụng cho mục đích làm chất mang thuốc paclitaxel
củaViện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) [3].
Trên thế giới đã có nhiều công bố ứng dụng hạt nano trong y học. Hạt có kích cỡ
nano có thể đƣợc tiêm tĩnh mạch vì đƣờng kính của mao mạch máu là khoảng 4 nm.
Các hạt có đƣờng kính lớn hơn 100 nm nhanh chóng đƣợc hấp thụ bởi hệ thống lƣới
nội mô (RES) trong gan, lá lách, phổi và xƣơng tủy, trong khi các hạt có kích cỡ nhỏ
hơn có xu hƣớng lƣu thông kéo dài một thời gian. Tạo ra hạt nano với điện tích bề mặt
ƣa nƣớc nhƣng trung lập là một phƣơng pháp khả thi để giảm đại thực bào và do đó
nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc. Thuốc hứa hẹn nhất đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi
là những chất chống ung thƣ. Sau khi tiêm tĩnh mạch, nhiều hạt nano chitosan tích tụ
trong một số khối u. Nano chitosan kìm hãm sự phát triển của khối u và nâng cao tỷ lệ
sống của chuột có khối u sau khi đƣợc điều trị [6]. Ngoài ra, hạt nano chitosan có kích
thƣớc nhỏ hơn 100 nm đƣợc dùng nhƣ thuốc kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm và
thuốc chống ký sinh trùng [6].
Có giả thuyết cho rằng các hạt nano có thể bảo vệ thuốc không bị phân giải bởi
enzyme trong đƣờng tiêu hóa. Pan và cộng sự báo cáo rằng tác dụng hạ đƣờng huyết

thân rễ Curcuma longa. Sự có mặt của tumerone (a, b), curdione, curzerenone, mono-
và di-demethoxycurcumin đã đƣợc tìm thấy trong thân rễ. Tinh dầu (5,8%) thu đƣợc
bằng cách chƣng cất hơi nƣớc phần thân rễ có chứa thành phần phellandrene(1%),
sabinene (0,6%), cineol (1%), borneol (0,5%), zingiberene (25%) và sesquiterpines
(53% ) [10].

Hình 1.3: Cấu trúc của các hợp chất curcumin trong tinh dầu nghệ
Kelkar và Sanjeev Rao [32] báo cáo rằng tinh dầu nghệ đƣợc điều chế bằng
phƣơng pháp chƣng cất hơi nƣớc dễ bay hơi chủ yếu là một hỗn hợp của sesquiterpene
xeton và rƣợu. Malingre [38] báo cáo thành phần chiết của C.longa gồm p-cymene, b-
sesquiphellandrene, turmerone, ar-turmerone và rƣợu sesquiterpene (Hình 1.4).
17 Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất trong tinh dầu nghệ
Chen và cộng sự [11] so sánh thành phần của các loại dầu dễ bay hơi của thân rễ
và củ nghệ nguồn gốc Trung Quốc C. Longa gồm: Turmerone (24%), ar-turmerone
(8,4%) và curdione (11,58%) (Hình 1.4) là các hợp chất quan trọng trong cả hai loại
dầu. Tuy nhiên, ar-curcumene đã đƣợc tìm thấy trong dầu thân rễ là 12,2%, nhƣng nó
đã không đƣợc báo cáo trong dầu củ. Gopalan và Ratnambal [21] so sánh các thành
18

phần chính của dầu nghệ sản xuất từ giống cây trồng khác nhau. Có sự thay đổi đáng
kể trong các thành phần chính phụ thuộc vào giống và nguồn gốc sản xuất. Dầu lá nghệ
Việt Nam chứa chủ yếu là α-phellandrene (24,5%), 1,8-cineole (15,9%), p-cymene
(13,2%) và β-pinene (8,9%). Cooray và cộng sự [13] cho biết các thành phần chính của
dầu thân rễ đƣợc sản xuất từ một giống nghệ duy nhất đƣợc trồng ở Sri Lanka, và nó đã
đƣợc báo cáo rằng ar-turmerone (24,7-48,9%) và turmerone (20-39%) là những hợp
chất chính. McCarron và cộng sự [36] đã sử dụng phƣơng pháp phân tích GC-MS để so
sánh hợp chất monoterpene hydrocarbon của các loại dầu sản xuất từ lá và rễ của C.

giảm rõ rệt: lƣợng cholesterol tổng, triglyceride và LDL giảm từ 55-40% ở động vật thí
nghiệm. Ngoài ra, dịch chiết này còn làm giảm nguy cơ xơ cứng động mạch. Các tác
giả cho rằng uống dịch chiết nghệ ức chế oxy hóa LDL và có hiệu quả giảm cholesterol
ở thỏ thí nghiệm [29].
Chống dị ứng và làm lành vết thương: dịch chiết thô của thân rễ nghệ có hoạt
tính ức chế cycloxygenase (COX) tốt trong thử nghiệm sinh học in vitro.
Antivenom activity: Phân đoạn có chứa ar-turmerone chiết từ C. longa trung hòa
hiệu quả gây chết và hoạt tính xuất huyết của nọc rắn ở chuột. Trong nghiên cứu này,
ar-turmerone có khả năng thủ tiêu hoạt tính xuất huyết của nọc độc Bothrops và
khoảng 70% hiệu quả gây chết của nọc độc Crotalus. Những nghiên cứu miễn dịch học
chứng minh rằng ar-turmerone ức chế sự tăng sinh và hoạt tính giết tự nhiên của
lyphocytes ngƣời [18;29]
Hoạt tính kháng khuẩn: Tinh dầu nghệ đƣợc thử với các chủng Staphylococcus
albus, Staphylococcus aureus và Bacillus typhosus, kết quả cho thấy sinh trƣởng của
Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus bị ức chế ở các nồng độ khác nhau. Đối
với vi khuẩn đƣờng ruột, sinh trƣởng của lactobacili bị ức chế bởi tinh dầu nghệ ở nồng
độ 4,5-90μl/100 ml, Dịch chiết alcohol cũng có hiệu quả ức chế (10–200 mg/ml) nhƣng
không bằng tinh dầu. Một số tác giả đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của dầu
nghệ. Jayaprakasha và cs. (2002) báo cáo hoạt tính kháng khuẩn của dầu nghệ đƣợc
20

tách từ dịch mẹ sau khi đã tách lấy curcumin [30]. Dầu nghệ đƣợc phân đoạn bằng
chƣng cất chân không thu đƣợc 2 phân đoạn, Các phân đoạn này đƣợc thử với một số
chủng nấm nhƣ Aspergillus flavus, A. parasiticus, Fusarium moniliforme và
Penicillium digitatum bằng phƣơng pháp nảy mầm bào tử. Phân đoạn nhận đƣợc dƣới
chân không ở 110-120
0
C có hiệu quả hơn. Kết quả phân tích GC/MS cho thấy trong
phân đoạn này chủ yếu là turmerone thơm, turmerone và curlone cùng với các hợp chất
oxy hóa khác [8;51]. Theo Dhingra và cs. (2007), tinh dầu nghệ (Curcuma longa L, )

khuẩn của chúng không do một cơ chế đặc biệt nào mà có một vài đích trong tế bào
(hình 1.5).

Hình 1.5: Vị trí và các cơ chế trong tế bào vi khuẩn đƣợc cho là điểm hoạt
tính của tinh dầu: phân hủy thành tế bào; làm hƣ hại màng tế bào; làm hỏng protein
màng; các thành phần tế bào bị rò rỉ; tủa tế bào chất; và lực đẩy proton bị suy yếu [48].
22

Một đặc điểm quan trọng của tinh dầu là tính kỵ nƣớc, cho phép chúng phân cắt
lipid của màng tế bào vi khuẩn và mitochondria, làm xáo trộn cấu trúc và làm chúng dễ
bị thẩm thấu hơn. Mặc dù một số lƣợng chất nhất định nào đó bị mất đi nhƣng tế bào
vẫn không bị chết, nhƣng khi mất nhiều hoặc các phân tử quan trọng và ion bị mất đi tế
bào sẽ bị chết.
Nhìn chung, tinh dầu chứa các hợp chất phenol cao nhƣ carvacrol, eugenol và
thymol, có hoạt tính kháng nguồn bệnh thực phẩm cao. Rất có lý cho rằng cơ chế hoạt
tính của chúng tƣơng tự nhƣ các phenolics khác đó là làm xáo trộn màng tế bào chất,
gián đoạn lực đẩy proton, dòng electron, vận chuyển chủ động và làm tủa các chất
trong tế bào.
Cấu trúc hóa học của các thành phần trong từng loại tinh dầu tác động đến cơ
chế hoạt động và hoạt tính của chúng. Tầm quan trọng của sự có mặt của các nhóm
hydroxyl trong các hợp chất phenolic đã đƣợc chứng minh. Các thành phần của tinh
dầu cũng tác động lên protein gắn trong màng tế bào chất. Các enzyme nhƣ ATPases
đƣợc biết nằm trong màng tế bào chất và đƣợc bao quanh bởi các phân tử lipid. Các
phân tử lipophilic hydrocacbon có thể tích tụ trong lớp lipid kép và làm hỏng tƣơng tác

biệt là ở miền tây đảo Java); miền nam Trung Quốc, Đài Loan và một số khu vực khác.
Quả của thanh long có ba loại, tất cả đều có vỏ giống nhƣ da và có một chút lá.
Chúng có tên gọi khoa học nhƣ sau:
 Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus, ruột trắng với vỏ hồng hay đỏ.
 Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus, ruột đỏ với vỏ hồng hay đỏ.
 Hylocereus megalanthus, trƣớc đây đƣợc coi là thuộc chi Selenicereus, ruột trắng
với vỏ vàng.

Trích đoạn Phƣơng pháp nghiên cứu

---