1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Nguyễn Thanh Quân
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN
GEN BÔNG CỎ (Gossypium arboreum L.) PHỤC VỤ
LẬP BẢN ĐỒ GEN KHÁNG BỆNH XANH LÙN
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành : Sinh học Thực nghiệm
Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Giảng viên hƣớng dẫn:
TS. NGUYỄN THỊ THANH THỦY

Hà Nội, năm 2011

1
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……………………………………
1
1. Tính cp thit c 
1
2. Mc tiêu và ni dung nghiên cu c tài

23
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP……………………
25
2.1. VT LIU NGHIÊN CU
25
2.1.1. Vật liệu thực vật
25
2.1.2. Các cặp mồi SSR
26
U VÀ K THUT S DNG.
26
2.2.1. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn các giống bông cỏ
26
2.2.2. Phương pháp đánh giá đặc tính nông sinh học, tiềm nămg năng suất
của các giống bông
27
2.2.3. Phương pháp phân tích đa hình di truyền bằng chỉ thị SSR
30
2.2.4. Các phương pháp xử lý số liệu chính trong nghiên cứu
34

2
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………
35
3.1. THU THP CÁC DÒNG, GING BÔNG TI T
CAO, CHNG TT VÀ GING KHÁNG BNH
35
A CÁC GING BÔNG C NHM
NH NGUN GEN LÀM VT LIU CHO VIC LAI
TO QUN TH 

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………
61
Ting Vi
61
Ting Anh
62
Tài liu t 
64
PHỤ LỤC……………………………………
65
DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. c có din tích bông ln nht th gi-2010
10

3
Bảng 1.2. c có sng bông cao nht th gi-2010
11
Bảng 1.3. Tình hình sn sut bông vi ti Vi-2010
13
Bảng 2.1. Mã s tn gc ca 30 ging bông c thu thp
25
Bảng 2.2. Các nhóm mi SSR s dng trong nghiên cu
26
Bảng 2.3. Bng s liu cao cây
28
Bảng 2.4. Thành phm chit
31
Bảng 2.5. Thành phm ra I (wash buffer I)
31

4
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Loài bông c châu Á (Gossypium arboreum L.).
4
Hình 1.2. Các loài bông thu th
7
Hình 1.3. Phân b t nhiên ca các loài bông nh b
8
Hình 1.4.  SSR gia hai cá th có motif (AT)
n

19
Hình 2.1. Các cp bnh xanm
27
Hình 2.2. Ching thit b 
30
Hình 3.1. Gieo trng
35
Hình 3.2. Cây bông nhim và kháng bnh 
38
Hình 3.3. Ruc tính nông sinh hc ca các gi.
39
Hình 3.4. Bi t s c tính nông sinh hc chính ca các
dòng/ging bông nghiên c
47
Hình 3.5. Kt qu kim tra DNA ca mt s ging bông trên gel agarose

Acid ribonucleic
bp
Base pair
CAPS
Cleaved Amplification Polymorphism Sequence
cs
C


CTAB
Cetyl trimethylammonium bromide
cM
Centimorgan
CV
coefficient of variation
dNTPs
Deoxy nucleotide triphosphates
EthBr
Ethidium bromide
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
EST
Expressed sequence tag
ISSR
Inter-simple sequence repeat
Kb
Kilo base
LSD
0,05


cn nhii. Bông vi quan trng mang li li nhun
cho hàng triu nông dân  c phát trin. Sn phm
c bin nguyên liu ch yu cho ngành công
nghip dt may. Hin nay, vi s phát trin ca xã hi ý thc rõ giá tr
ca bn thân bng vip vi thc bit là thi trang qun áo. Con
i s dng qun áo, vi vóc hàng ngày không ch gi  
m hin s ng cp xã hi. Qua nh
t trm, mau khô, to s thông thoáng, mát v mùa hè và m vào mùa
ng ca vi cotton, cây bông thc s là cây trng hu ích và quan tri vi
cuc sng ci.
Cho n nay, bông vn là nguyên lin ca công nghip d
thay th c. Phát trin ngh trng bông v   thành ngành kinh t nông
nghip trm  nhiu quc gia vi sn phm i giá tr kinh t
cao.           n kinh t th gii
khong 500 t USD vi vic s dng khong 115 triu ki
2007). Tuy nhiên, sng bông v thuc vào nhiu yu t trong
u t ngoi cnh và ging là hai yu t quan trng nht. Hin nay
i bnh hi bông do virus c công bnh xanh
lùn hay còn gi là bnh xanh lá (cotton blue disease) là loi bnh xut hin t sm
và gây hi nghiêm trng cho sn xut bông (Correae et al., 2005). Bt hin
và làm gim s  khá nhiu c trên th gi
là loi bnh gây hi ln nht cho cây bông  c ta hin nay.
Theo d kin ca chính ph  , nông nghic ta phi
c 20% s rng din tích trng bông lên 0,5 triu ha
(B Nông nghip và Phát tring hn ch do
giá bông không t, chng bông thu hoch thp do sâu bnh,

7
ng kháng, chi phí sn xut cao dn thua l n khích
c vic m rng din tích trc.

trong tng bông ca Vin nghiên cu Bông và Phát trin Nông nghip

8
Nha H, Ninh Thun.
3.2. Địa bàn nghiên cứu của đề tài
 tài nghiên cu ca chúng  c thc hin ti Vin Di truyn Nông
nghip và Vin Nghiên cu Bông và Phát trin Nông nghip Nha H.
 tài nghiên cu này n tài khoa hc cChọn tạo
giống bông kháng bệnh xanh lùn bằng chỉ thị phân tử
ngh Sinh hc Nông nghip do Vin Di truyn Nông nghip ch trì và Vin Nghiên
cu Bông và Phát trin Nông nghip Nha H phi hp thc hin.
3.3. Thời gian nghiên cứu của đề tài
 c tin hành t tháng 01 09 n tháng 04 

9
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BÔNG VẢI (Gossypium L.)
1.1.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc phân bố
   d liu ITIS (Integrated Taxonomic Information System), cây
c phân lo
Gii thc vt  Plantae
Ngành ht kín  Magnoliophyta
Lp hai lá mm  Magnoliopsida
B bông  Malvales
H bông  Malvaceae
Chi bông  Gossypium

G. barbadense L.
a) Gossypium hirsutum L.
Loài G. hirsutum  c gi là bông lui, là loài bông t bi (song
ng bi) khác ngun A, D có b nhim sc th 2n = 2x = 52 (Jiang, 2004). Bông
lui có ngun gc t Trung Mc trng lan rng ra kh gii,
si chim trên 90% sng toàn th gii. Bông luc
trng nhiu nht là  M    , Trung
Quc, Braxin, Achentina, Nam Phi và châu Úc.
 Vit Nam, bông lui du nhc ta khong cui th k u th
K XX. Phn ln các ging thum m
khai thác và sn xut bông hàng hóa. V c du nhp vào bng nhiu
ng khác nhau, ch yu thông qua các n tr ca các t chc
quc t. Qua quá trình thc nghim cho thy loài này có kh ng rng,
phù hp vu kin thi tit  c ta. Vi tit cao và cht
t, các ging bông này dn dn thay th các ging bông c 
Quang Quyn, 2004). Bông lui có nhiu loài ph  G. hirsutum ssp.

11
Mexicanum, G. hirsutum ssp. Punctatum (Achum và Thonn), G. hirsutum ssp.

b) Gossypium barbadense L.
Loài G. barbadense c gi là bông h
lui, bông h o là loài bông t b  ng bi) khác ngun A, D có b
nhim sc th 2n = 2x = 52. Bông h o có ngun gc t Nam Mc
trng nhiu  Nga, M, Ai Cp và mt s c khác. Bông hi o cung cp
khong 10% s gii và hin nay din tích trng bông hi
c m rng do phm chc bit tt.
 Vit Namy tài liu nào nói v loài bông hc trng
ph bin trong sn sut và bt ngun t ng gi dng cây lâu
 n hoang và b gi-1945 mi du nhp mt s


Hình 1.2. Các loài bông thu thập đƣợc: (a) bông luồi, (b) hải đảo, (c) bông cỏ

1.1.2. Xuất xứ và sự đa dạng genome cây bông
Cây bông (Gossypium L.) bao gm khong 45 loài nh bi và 5 loài t bi
vi cách thc di truyn phc tp. Nhóm bông nh b c chia làm 8 nhóm
genome t n nay, các loài bông nh bi có 3
nhóm bông chính: nhóm bông châu Phi có kiu genome A, B, E, và F có xut x t
châu Phi và châu Á; nhóm bông có kiu genome D có ngun gc xut x t các
nc châu M; nhóm bông th 3 có kiu genome C, c tìm thy  châu
Úc (Wendel & Cronn, 2003).
Tt c 50 loài bông, k c hai loài bông t bi t nhiên Gossypium hirsutum
và Gossypium barbadenseu có ngun gc t các loài bông t tiên châu Phi A
genome và các loài bông D genome.
T tiên ca các loài bông t bi còn tn tn nay là các loài bông nh
bi Gossypium herbaceum (A1) và Gossypium arboreum (A2), và Gossypium
raimondii (D5) Ulbrich (Brubaker & cs., 1999). Quá trình t bi hóa xy ra khong
n 2 trio ra 5 loài bông t bi.
Trong các loài bông, ch c trng ly si bao gm hai dng
nh bi genome A (2n=2x=26) là G. herbaceum (A1); G. arboreum (A2) và hai

13
dng t bi (so ng bi) khác ngun A, D (2n=2x=52) là G. hirsutum và
G.barbadense.

Hình 1.3. Phân bố tự nhiên của các loài bông nhị bội.
Hin nay, các ging bông trng ph bin trong sn xuu là bông t bi có
ngun gc lai gia hai nhóm genome A và D. Trong k có các loài bông
thuc nhóm genome A cho bông ly si còn nhóm genome D thì không (Chen & cs.,
2007). Vì th, nghiên cu genome, lp b di truyn cây bông nh bi A và D là

i tiêu nên sn xut cao, chng sn phm tt.
1.2.2.2. Hiện trạng sản xuất
V bông 2009-2010, tng din tích bông trên th gii là 33,5 triu ha, trong
n chim 70% dic phát trin ch chim
có 30% dic có din tích trng bông ln nht th gic lit kê
 b du vi din tích là 8,7 triu ha, tip theo là M 5,6
triu ha, Trung Quc 4,8 triu ha và Pakistan 3,1 tri
din tích bông trên th gic trng  c min Nam và din tích trng ca
c châu Á là , Trung Qum khong 50% din tích
bông th gii (ISAAA, 2010).

Bảng 1.1. Các nƣớc có diện tích bông lớn nhất thế giới năm 2009-2010
STT
Nước
Diện tích (triệu ha)
1

8,730
2
M
5,596

15
3
Trung Quc
4,824
4
Pakistan
3,125
5

Nước
Sản lượng (triệu tấn)
Năng suất xơ (kg/ha)
1
Trung Quc
5,320
1.103
2
M
4,420
790
3

2,508
287
4
Pakistan
1,853
593
5
Uzbekistan
1,055
726
6
Th 
0,880
1.345
7
Brazil
0,750

tr thành ngành trm trong khong 2 thp k gc tin vào
công cuc Công nghip hóa, hii hóa. Ch  n 2010, Dt
May Vit Nam  thành t kim ngch xut khu ln nht c c
vi doanh thu 11,5 t ó trng bông và kéo su
ca chui dng trên 300%

17
t 1,2 triu cc si vi tng sng 120.000 tn lên 3,75 triu ct 420.000
tng bông li din ra theo chic l
2000, sng bông c t 18.000 t còn 13,000 tn 
tc còn khong 70% s N
ng khong 20% nhu cu kéo s l này ch còn 1,3% - 
mt du hiu r    c bit giá bông th gi   t cách bt
n) ch a ti s ng
nh ca ngành si Vit Nam nói riêng và toàn ngành dt may nói chung.
1.2.2.1. Hình thức tổ chức, chế độ sản xuất bông tại Việt Nam
n xuc tp trung  ng quc
doanh. Lúc by gi sn xu các yu t  m bo cho s thành
 thut, h thng qun xu
hiu qu. Vì vy, ch         ng v  a
n lý và t n nay sn xut bông chuyn sang hình thc trng
trong nông dân. Hình thc này có hiu qu và phù hp vu kin  Vit Nam.
t trái ca hình thc này là nguyên liu không nh do ph thuc vào
giá c th ng và nông dân t do la chn, quynh trng cây nào có li trên
t ca mình.
Quy mô sn xut bông  Vit Nam còn phân tán, nh l trong h nông dân,
rt ít nhóm kinh t, m i hóa còn rt thc bip
trung ln nên rt khó áp dng các tin b k thung b  t và
chng bông ht. S h sn xut bông t cp t túc chic
thiu s chim 15-20% tng s h sn xut bông.

Năng suất
(tạ/ha)
2000
18,6
18,8
10,1
2001
27,7
33,6
12,1
2002
34,1
40,0
11,7
2003
27,8
35,1
12,6
2004
28,0
28,0
10,0
2005
25,8
33,5
13,0
2006
20,9
28,6
13,7

Nam hin nay.
T nh-1985, bnh xanh lùn c phát hin lu tiên ti Nha
H (Ninh Thun), i ca bn.
Dch bu tiên xy ra ti Ninh Thui Nha H trên 80 ha trng
bông b bnh vi t l 50-100%, gây thit hi trên 50% s
dch bnh xy ra ti huyn Tuy Phong (Bình Thun), 450 ha trng bông b bnh vi
t l 90-100%, nhi     c, thit hc tính trên 80% sn
ng bông, gây n thu nhp ca nhiu nông dân trc
ng xuyên xut hin và gây hi nng cho các vùng trng bông
n, Bình Thuc. T n nay, bt
hin c  c Lt hi ln và làm mt hoàn
toàn 14 ha bông  huyc Lc) huy
vi 20 ha không cho thu honh là mt trong nhng tr ngi chính trong vic
 rng dit bông ca ngành bông Vit Nam.
 Vit Nam, nghiên cu bc bu t i Vin
Nghiên cu bông và Cây có si (nay là Vin Nghiên cu Bông và Phát trin Nông
nghip Nha H). Kt qu cho thy triu chng bnh xanh lùn bông  Vit Nam
ginh xanh lá và cun lá  Châu Phi, Nam M và Thái Lan. ng
lan truyn ca bnh trong t nhiên  nh côn trùng môi gii là rp bông (Aphis
gossypii) mà vic phòng tr, tiêu dit chúng là không th thc hic (Nguyn
Th Thanh Bình, 1999).
Hin nay, vic s dng ging kháng là s la chn tt trong công tác
qun lý bi quyt các v ng do s dng

20
thuc tr sâu và ngun gen kháng bn vng nht vn là nguc chn lc t
nhiên t các ging kháng.
Ti Vit Nam, công tác chn to ging bông t cao, cht,
chng chu vi sâu bu kin ngoi ct c nhiu kt qu kh
quan. Nhiu ging bông do Vin nghiên cu Bông và PTNN Nha H chn t

RFLP gm các mu dò (probe) là nhn ADN (hoc s d
lai vi ADN ca h gen cn phân tích. Ch th c phân chia thành các ch th
RGA, STS, CAPi ch th PCR nói trên
có mt loi mn ADN sc ph
bin khong t c s dn khu trong phn
ng chu tng hp nhân to ra nhn ADN mi (Lã
Tucs., 2004)
1.3.2.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
u nha th k 20, k thuc bin là
loi ch th mi  ch th ADN th h u tiên, vi nht tri so vi
nhng ch th hình thái và ch th c s d
dng di truyRFLP là mt k thut nhn dng ADN bng
cách lai axit nucleic. Bn cht ca k thut này là da trên s phân ct ADN bng
enzym gii hn và s lai (liên kt) gi    sung trên hai s  
nucleic (si ADN hoc mARN). Khi x lý ADN bng enzym gii hn s c
nhng mnh ADN nh c khác nhau, nhng mc
n di và cho lai vi mu dò, nu chúng b sung vi mu dò thì s cho phn ng lai.
Kt qu ca phn ng lai là chúng ta có th c s a các mu
ADN khác nhau.
RFLP là ch th ng tri do có th phát hic các alen khác nhau ca
mt locus trong h gen nhân, h gen ti th hay h gen lc lp bng mt mc
hiu, chính vì th, k thut lai axit nucleic này còn t quan trng trong
lp b gen, phân lnh s bn sao ca mt gen, phân tích cu trúc và
ch
1.3.2.2. Chỉ thị PCR (Polymerase Chain Reaction)
n ng trùng phân hay phn ng chui polymerase. Bn
cht c tng hp nhân to tn ADN mi, vi s tham gia
ca các thành phn chính gm: ADN khuôn, dNTP, mi (primer), enzym

22

k da trên trình t nhn bit ca enzyme gii hn; (ii) cp mc thit k b
sung vi trình t adapter gn vào s c s d n DNA gia hai v trí
nhn bit gii hn di phân tách sn phm PCR.
Do kt hc nhm ca RFLP và RAPD nên k thut AFLP có
nhin, nh, kh ng dng rng. V n, AFLP

23
là ch th tri và v trí nhim sc th cnh, do vy nu dùng ch
th này  lp b gen  qun th F
2
thì cn phi s dng kt hp vi các ch th
c v trí nhim sc th c Microsatelite.
c) Chỉ thị Microsatelite
Khi nghiên cu genom ca mt s sinh vt n ra nhng
n ADN có chiu dài khác nhau phân b mt cách ngu nhiên mà trình t ca nó
bao gm các nhóm nucleotide ging nhau nhc li nhiu ln; ng
có s t quá 5 nucleotide ví d 
n
hoc (AAT)
n
. Và  cây
bông vi, t hic gm GA, GT, CAT, CTT. Nhng
n ADN lp lc g
SSLPs (single sequence length polymorphism), SSRs (simple sequence repeats),
STRs (short tADNom repeats). n ADN nhc li này có trình t u rt
n; bi vy mà trình t  u cn nhc li
c s d thit k mi cho PCR.
Ch th m ln so vi các ch th ADN khác là:
- c hin mc thit k da trên vùng trình t
n có tính bo th cao cn ln phm nhân gen ca phn