1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ NHƢ HÀ XÁC ĐỊNH SỰ PHÂN BỐ CÁC GENOTYPE CỦA HCV
Ở BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI
BỆNH VIỆN BỆNH NHIỆT ĐỚI TRUNG ƢƠNG
NĂM 2010-2011
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. NGUYỄN VŨ TRUNG
HÀ NỘI - 2012

2

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 10
1.1. Vi rút viêm gan C 10
1.1.1. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút 10
1.1.2. Chu trình tái bản của HCV 12
1.2. Viêm gan vi rút C 14
1.2.1. Khái niệm 14
1.2.2. Đường lây nhiễm 14
1.2.3. Diễn biến tự nhiên 14
1.2.4. Chẩn đoán phòng thí nghiệm 16
1.2.5. Điều trị viêm gan vi rút C 17
1.3. Các đặc trưng của kiểu gen HCV 18
1.3.1. Kiểu gen HCV phân bố theo địa dư 18
1.3.2. Kiểu gen HCV với nguy cơ lây nhiễm 21
1.3.3. Kiểu gen HCV với mô bệnh học 21
1.3.4. Kiểu gen HCV với đáp ứng và dự đoán đáp ứng với điều trị 21
1.3.5. Kiểu gen HCV với thời gian điều trị 22
1.3.6. Kiểu gen HCV với liều lượng thuốc điều trị 22
1.3.7. Kiểu gen hỗn hợp của HCV 22
1.3.8. Gan nhiễm mỡ và mối liên quan đến kiểu gen của HCV 23
1.3.9. Kiểu gen và diễn tiến bệnh viêm gan C mạn tính 23
1.3.10. Kiểu gen và ghép gan trong nhiễm HCV 23
1.4. Tình hình bệnh viêm gan vi rút C và các nghiên cứu 23
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Đối tượng nghiên cứu 25

4

2.2. Vật liệu nghiên cứu 25
2.2.1. Sinh phẩm, hóa chất 25
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị 26

3.3.3. Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và tiền sử phơi nhiễm HCV 55
3.3.4. Đặc điểm kiểu gen HCV giữa 2 nhóm đối tượng có đồng nhiễm
HIV và không đồng nhiễm HIV 56
3.3.5. Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và mức độ biến đổi chức
năng gan 56
3.3.6. Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và tải lượng vi rút 59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

6

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự mồi 25
Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân theo tuổi 39
Bảng 3.2. Đặc điểm tiền sử phơi nhiễm viêm gan C 42
Bảng 3.3. Đặc điểm về tải lượng vi rút của mẫu nghiên cứu 43
Bảng 3.4. Mối liên quan giữa kiểu gen HCV và tuổi 53
Bảng 3.5. Mối liên quan giữa kiểu gen HCV và giới 54
Bảng 3.6. Mối liên quan giữa kiểu gen HCV và tiền sử phơi nhiễm HCV 55
Bảng 3.7. Đặc điểm phân bố kiểu gen HCV giữa 2 nhóm đối tượng có đồng
nhiễm HIV và không đồng nhiễm HIV 56
Bảng 3.8. Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và men gan ALT 57
Bảng 3.9. Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và men gan AST 57
Bảng 3.10. Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và Bilirubin toàn phần 58
Bảng 3.11. Mối liên quan giữa kiểu gen của HCV và tải lượng vi rút 59 7


tính của Tổ chức Y tế Thế giới, tỉ lệ nhiễm HCV trên thế giới khoảng 3,1%, tương
đương 170 triệu người, với số nhiễm mới 3-4 triệu người mỗi năm
[10]

[24]

[57]
.Tổng
chi phí y tế dành cho chẩn đoán và điều trị cũng như phòng viêm gan vi rút C dự
đoán tăng từ 30 tỷ USD vào năm 2009 lên đến hơn 85 tỷ USD vào năm 2024. Nếu
không điều trị, viêm gan vi rút C diễn biến thành biến chứng xơ gan, ung thư gan và
có thể dẫn đến tử vong
[31]

[57]
. Tỉ lệ nhiễm HCV dẫn đến xơ gan là 15-20% sau 20
năm. Tỷ lệ ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm HCV chiếm khoảng 1,4-3,3% mỗi
năm, trong đó, tử vong là 2,6-4%
[57]
. Ở Việt Nam 510% dân số nhiễm HCV
[12]
.
Viêm gan vi rút C là một bệnh nguy hiểm vì triệu chứng lâm sàng thường
không rõ ràng, 90% trường hợp không có triệu chứng, trong khi đó hậu quả của
bệnh để lại thường rất nặng nề. Có 50%-80% viêm gan vi rút C chuyển thành mạn
tính, 20%-25% bệnh nhân mạn tính diễn tiến qua xơ gan và ung thư gan
[4]

[30]
. Do

HCV bằng kỹ thuật giải trình tự gen vùng core của HCV giúp chẩn đoán và điều trị
bệnh. Qua hơn 1 năm triển khai chúng tôi đã thu được các kết quả nhất định. Vì vậy
chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định sự phân bố các genotype của HCV bằng kỹ
thuật giải trình tự gen ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bệnh
Nhiệt đới Trung ương năm 2010-2011” với các mục tiêu sau:
1. Xác định các kiểu gen của HCV ở bệnh nhân đến khám và điều trị tại Bệnh
viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương bằng kỹ thuật giải trình tự gen.
2. Đánh giá mối liên quan giữa kiểu gen HCV với một số đặc điểm về dịch tễ
học và cận lâm sàng.
CHƢƠNG 1

10

TỔNG QUAN
1.1. Vi rút viêm gan C
1.1.1. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút
Vi rút viêm gan C được phát hiện năm 1989 do nhóm nghiên cứu của M.
Houghto ở Chiron California Mỹ kết hợp với nhóm nghiên cứu của D.W.Bradley ở
CDC. Sau nhiều năm nghiên cứu, lần đầu tiên trong lịch sử ngành Vi sinh học, một
tác nhân gây bệnh mới được khám phá bằng kỹ thuật sinh học phân tử trước khi có
được các hiểu biết về hình thái vi rút, cấu trúc protein, tính kháng nguyên, trước cả

NC) có tính ổn định rất cao, gồm khoảng 341-344 nucleotide
[4]

[37]

[44]
. Giữa các sợi
HCV riêng biệt, giữa các kiểu phụ và kiểu gen khác nhau thì độ tương đồng về trình
tự 5’-NC tối thiểu hơn 90%. Vì vậy, khu vực này thường được áp dụng để xác định
nhiễm HCV bằng kỹ thuật PCR. Ngược lại, trình tự của NS5B, khu vực core hoặc
E1 thay đổi nhiều hơn, nhưng được coi là tiêu chuẩn vàng sử dụng để xác định và
phân biệt các kiểu gen HCV
[47]

[50]
. Hình 2: RNA của HCV
[58]
Tương tự như tất cả vi rút khác, HCV không thể tự tái bản vì nó không có
đầy đủ các nguyên liệu cần thiết. Vì vậy, để tái bản, vi rút phải nhiễm vào tế bào vật
chủ và sử dụng bộ máy sao chép của tế bào, bao gồm các enzyme và protein. Sau
khi nhiễm vào tế bào vật chủ, các bước tái bản của HCV sẽ xảy ra trong tế bào chất.
Hệ gen của HCV mã hoá cho tối thiểu 10 protein vi rút khác nhau, bao gồm các
Protein cấu trúc
Protein không cấu trúc
Gen mã hoá polyprotein
Protein kháng
interferon

1.1.2. Chu trình tái bản của HCV
[42] Hình 3: Chu trình sống của HCV
Thể golgi
Nhân
Tế bào
gan
Tế bào chất
Vi rút HCV mới
Vi rút HCV

13

- Gắn vào tế bào vật chủ: HCV gắn vào tế bào chủ nhờ các tương tác giữa lớp
vỏ protein của vi rút (protein E1 và E2) với các phân tử là thụ thể bề mặt khảm trên
màng ngoài tế bào đích.
- Xâm nhập vào tế bào chủ và cởi lớp vỏ bọc, giải phóng RNA vi rút, HCV đi
vào tế bào đích chủ yếu do cơ chế ẩm bào nhờ thụ thể. Khi HCV gắn lên bề mặt thụ
thể, các tế bào đồng hóa thụ thể sẽ hình thành một túi màng mỏng chứa HCV. Sau

vật chủ, giải phóng ra ngoài và lây nhiễm cho các tế bào mới
[7]
.
1.2. Viêm gan vi rút C
1.2.1. Khái niệm
[57]

Viêm gan vi rút C là bệnh do vi rút viêm gan C gây nên. Nhiễm vi rút viêm
gan C (HCV) có thể dẫn đến viêm gan cấp tính và mạn tính.
1.2.2. Đƣờng lây nhiễm
[36]

HCV lây chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp với máu người bệnh. Đường lây
nhiễm vi rút C chủ yếu gồm: Sử dụng chung kim tiêm ở những người nghiện ma
túy. Dùng chung dao cạo, bàn chải răng, dụng cụ cắt móng tay với người bị nhiễm
vi rút viêm gan C, kim chích xăm mình hoặc xỏ lỗ tai không đảm bảo vô trùng;
Người nhận máu, chế phẩm máu hoặc các bộ phận cơ thể từ một người cho nhiễm
HCV; Phơi nhiễm ở nhân viên y tế (1 - 3%); Nguy cơ lây nhiễm vi rút viêm gan C
qua quan hệ tình dục hiếm hơn so với viêm gan B (5 - 10%); Mẹ truyền sang con
xảy ra tại thời điểm sinh với những bà mẹ có HCV RNA (+), khoảng 6%; Không rõ
đường lây nhiễm chiếm 30 - 40% trường hợp.
Một người nhiễm HCV, có thể nhiễm đồng thời vi rút viêm gan A, B.
1.2.3. Diễn biến tự nhiên
[57]

Sau khi bị nhiễm HCV, thời gian ủ bệnh thường kéo dài từ 2 đến 26 tuần,
trung bình từ 6 đến 10 tuần.
Giai đoạn cấp tính: Bệnh nhân nhiễm HCV ở giai đoạn cấp tính thường
không có biểu hiện bệnh lý hoặc chỉ có những biểu hiện bệnh nhẹ (rất khó quan sát


thành xơ gan 15 - 20% sau 20 năm, tỉ lệ càng tăng nếu thời gian nhiễm càng lâu,
71% bệnh nhân xơ gan nếu nhiễm hơn 60 năm. Trong nhóm bệnh nhân xơ gan do
HCV, mỗi năm 1,4 - 3,3% chuyển sang ung thư gan và 2,6 - 4% tử vong
[57]
.
1.2.4. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Chẩn đoán viêm gan C, ngoài các xét nghiệm đánh giá chức năng gan, siêu âm
gan, sinh thiết gan các xét nghiệm tìm HCV giữ một vai trò rất quan trọng
[38] [48]
.
1.2.4.1. Phƣơng pháp gián tiếp - tìm kháng thể anti-HCV
Có thể tìm thấy kháng thể anti-HCV ở 70% trường hợp khi bắt đầu có triệu
chứng và khoảng 90% trong vòng 3 tháng sau. Tuy nhiên, nhiều người bị viêm gan
C nhưng không có triệu chứng. Anti-HCV không xác định được là đang nhiễm cấp
tính, đã lành bệnh (đào thải hết vi rút) hay chuyển sang giai đoạn mạn tính.
Tìm kháng thể anti-HCV có thể sử dụng các kỹ thuật như miễn dịch điện hoá
phát quang hoặc kỹ thuật miễn dịch ELISA.
1.2.4.2. Phƣơng pháp trực tiếp - tìm HCV RNA
Phát hiện trực tiếp vi rút trong máu, một bằng chứng của nhiễm HCV và vi
rút đang tăng sinh. Có thể phát hiện HCV-RNA trong vòng 1 đến 2 tuần sau khi
nhiễm vi rút.
1.2.4.3. Các phƣơng pháp xác định kiểu gen
a. RT-PCR: Kỹ thuật PCR phiên mã ngược được phát triển và ứng dụng đối với
các vi rút có vật liệu di truyền là RNA từ những năm 1990. Đây là kỹ thuật chẩn
đoán nhanh, nhạy, đặc hiệu cho từng type huyết thanh, tuy nhiên do độ nhạy cao
nên rất dễ xảy ra dương tính giả nếu không kiểm soát được tạp nhiễm của các tác
nhân ngoại lai.

17


viêm gan C và mỗi kiểu gen có thể có đáp ứng điều trị khác nhau. Thời gian điều trị
có thể thay đổi tùy theo kiểu gen và nồng độ HCV RNA vào từng thời điểm: tuần 4,
12, 24, 48 và 6 tháng sau khi ngưng thuốc, giảm tác dụng phụ và giá thành điều trị.

18

Chính vì vậy, việc xác định kiểu gen HCV là rất quan trọng trước khi quyết định
điều trị.
Phác đồ điều trị viêm gan C được áp dụng hiện nay là kết hợp kháng vi rút
interferon và ribavirin. Tuy nhiên, interferon có nhiều tác dụng phụ không mong
muốn, một số kiểu gen HCV đáp ứng không tốt với interferon, vì vậy không đạt
được kết quả điều trị như mong muốn hoặc nhiều bệnh nhân phải ngừng điều trị do
các tác dụng phụ.
Hiện nay, các nhà khoa học đã tìm ra các loại thuốc kháng vi rút viêm gan C
mới, có thể có hiệu quả hơn và dung nạp tốt hơn các phương pháp điều trị hiện có.
Hai thuốc mới như telaprevir và boceprevir gần đây đã được cho phép sử dụng ở
một số nước.
1.3. Các đặc trƣng của kiểu gen HCV
1.3.1. Kiểu gen HCV phân bố theo địa dƣ
[57]

Các nghiên cứu trình tự và xác định kiểu gen chứng minh các kiểu phụ liên
quan khá chặt chẽ và phân bố theo địa dư như sau: Kiểu 1a thường gặp ở Bắc, Nam
Mỹ và Australia; Kiểu 1b thường gặp ở Châu Âu và Châu Á; Kiểu 2a thường gặp ở
Nhật và Trung quốc; Kiểu 2b thường gặp ở Mỹ và Bắc Âu; Kiểu 2c thường gặp ở
Tây và Nam Âu; Kiểu 3a thường gặp ở Australia và Nam Á; Kiểu 4a thường gặp ở
Ai cập; Kiểu 4c thường gặp ở miền trung Châu Phi; Kiểu 5a thường gặp ở Nam Phi;
Kiểu 6 thường gặp ở Châu Á (hình 5, hình 6, hình 7).

19


21 Hình 7: Tỷ lệ kiểu gen HCV tại Việt Nam
[60]

1.3.2. Kiểu gen HCV với nguy cơ lây nhiễm
[36]

Kiểu gen 1b thường gặp ở bệnh nhân được truyền máu, kiểu gen 3a thường
gặp ở đối tượng tiêm chích ma túy. Hiện nay nhiễm vi rút C kiểu gen 3a gia tăng do
số người tiêm chích ma túy tăng lên, còn những người nhiễm HCV kiểu gen 1b thì
giảm do tiến bộ trong kỹ thuật truyền máu.
1.3.3. Kiểu gen HCV với mô bệnh học
[46]

Người mắc kiểu gen 1b có nguy cơ bị HCC hơn những bệnh nhân mang các
kiểu gen khác do những người nhiễm kiểu gen 1b thường sớm hơn những người
nhiễm kiểu gen 2 và 3 vài thập kỷ. Điều này cũng có thể áp dụng cho kiểu gen 4 ở
vùng Trung Đông.
1.3.4. Kiểu gen HCV với đáp ứng và dự đoán đáp ứng với điều trị
[15]

Thông tin về kiểu gen rất quan trọng nó được sử dụng để dự đoán kết quả
điều trị. Tỉ lệ đáp ứng kéo dài khi sử dụng Peginterferon kết hợp với Ribavirin
thường cao hơn ở kiểu gen 2, 3 so với kiểu gen 1.
Khác
Tổng


[15]

Một người có thể nhiễm hơn 1 loại kiểu gen. Số liệu về kiểu gen hỗn hợp thì
hầu như chưa được nghiên cứu nhiều, nhưng một vài số liệu cho thấy, nó có thể ảnh
hưởng tới đáp ứng điều trị và diễn tiến bệnh viêm gan vi rút C. 23

1.3.8. Gan nhiễm mỡ và mối liên quan đến kiểu gen của HCV
[15]

Tình trạng gan nhiễm mỡ thường thấy ở bệnh nhân viêm gan vi rút C. Gan
nhiễm mỡ góp phần vào diễn tiến của bệnh và đáp ứng kém với điều trị, mặc dù cơ
chế chưa được hiểu một cách rõ ràng. Những người nhiễm HCV kiểu gen 3 có khả
năng bị gan nhiễm mỡ nhiều hơn và kiểu gen 3 là một yếu tố nguy cơ độc lập và
đóng vai trò trực tiếp trong sự phát triển gan nhiễm mỡ.
1.3.9. Kiểu gen và diễn tiến bệnh viêm gan C mạn tính
[15]

Về liên quan giữa kiểu gen và diễn tiến bệnh gợi ý rằng kiểu gen 1b liên
quan với mức độ diễn tiến bệnh nặng hơn so với kiểu gen 2, 3. Nhưng cần có nhiều
nghiên cứu hơn để xác nhận điều này.
1.3.10. Kiểu gen và ghép gan trong nhiễm HCV
[15]

Kiểu gen 1 (đặc biệt là kiểu gen 1b) liên quan đến quá trình xơ hóa nhanh
hơn ở những bệnh nhân đã ghép gan.
1.4. Tình hình bệnh viêm gan vi rút C và các nghiên cứu
Hiện nay, các số liệu về sự lây truyền HCV trong cộng đồng cho thấy vi rút

[57]

Năm 1996, nhóm tác giả P. Simmonds thuộc đại học Edinburgh, Anh đã giải
trình tự gen để phân tích biến thể của vi rút viêm gan C ở các nước Đông Nam Á
[38]
.
Năm 2004, nhóm tác giả Tatsunori Nakano Nhật cũng giải trình tự gen phân
tích biến thể vi rút viêm gan C tìm hiểu lịch sử con đường lây nhiễm
[35]
.
Năm 2005, nhóm tác giả Hồ Tấn Đạt tại trung tâm Y khoa MEDIC, thành
phố Hồ Chí Minh nghiên cứu và xác định kiểu gen HCV của 327 bệnh nhân viêm
gan C cho thấy kiểu gen 1 chiếm 58,4%, kiểu gen 6 chiếm 23,9% và kiểu gen 2
chiếm 13,1%
[4]
.
Năm 2010, Tomoaki Tanimoto cùng cộng sự đã nghiên cứu 486 trường hợp
nhiễm HCV trên nhóm tiêm chích ma tuý tại Hải Phòng. Kết quả cho thấy tại vị trí
5’UTR-core kiểu gen 6e chiếm ưu thế 32,5%, tại vị trí NS5B kiểu gen 1a chiếm ưu
thế 42,6%
[54]
. 25

CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

A5
5’-TACGCCGGGGTCAKTRGGGCCCA-3’
684-660 [24bp]
R = A hoặc G; M = A hoặc C; K = G hoặc T; HC-J4/83 (số truy cập. D13558).