Sổ tay Chuyển giao công nghệ phục vụ phát triển nông thôn miền núi Kỹ thuật Nhân giống
khoai tây sạch bệnh bằng
phơng pháp nuôi cấy mô (In Vitro) Diện tích trồng khoai tây ở nớc ta đã có thời gian đạt trên 11 vạn ha,
nhng sau đó cứ giảm dần. Đến nay diện tích khoai tây hàng năm biến động
trong phạm vi 2,5 đến 3,3 vạn ha. nguyên nhân chính là do trồng khoai tây
cha có hiệu quả kinh tế cao; đầu t lớn (trong đó có khâu giống quá tốn kém
lại có biểu hiện thoái hoá), đặc biệt giống bị nhiễm bệnh virus rất nặng. Tỷ lệ
bệnh virus hại khoai tây ở nớc ta khoảng 20 - 70% và bệnh này lây lan rất
nhanh. Nếu vụ thứ nhất chỉ có 0,63% cây bệnh thì vụ thứ 4 tỷ lệ bệnh lây lan
tự nhiên đã là gần 22%, sau 10 năm có thể đạt tới 48,3%. Năng suất khoai tây
bị giảm 28 - 70% do nhiễm bệnh virus gây ra, chủ yếu là bệnh xoắn lá lùn.
Do đó, việc liên tục sản xuất các giống khoai tây sạch bệnh để cung cấp
cho sản suất đại trà là 1 yêu cầu bức xúc của ngời nông dân. Nhân giống
khoai tây bằng phơng pháp nuôi cấy mô là 1 trong những cách tích cực nhất,
khoa học nhất để nhân nhanh giống khoai thây sạch bệnh.
I. Tạo nguồn vật liệu sạch virus để nuôi cấy in vitro:
Công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật là 1 công cụ hữu hiệu gần nh là duy
nhất để tạo ra nguồn giống cây sạch virus.
I.1. Nguyên lý, kỹ thuật làm sạch virus qua nuôi cấy mô phân sinh
đỉnh (meristem).
Trong thực tế, sự phân bố của virus vào tế bào mô của những cây bị bệnh
không đồng nhất nh nhau mà phụ thuộc vào khả năng sinh trởng và phân
chia của tế bào. Kết quả nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới đều
thống nhất ở cây nhiễm bệnh, bộ phận mô phân sinh đỉnh hoàn toàn không có
virus (mô này nằm ở đỉnh chồi, kích thích khoảng 0,1 - 0,2mm, chuyên làm

C trong 1 - 2 tuần.
I.2.3. Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý hoá chất:
Ngời ta đa vào môi trờng nuôi cấy meristem có kích thớc lớn 0,5 -
1mm các hoá chất nh: 2-Thiouracil, Ribavirin Vidarabin để làm tăng khả
năng kháng virus của tế bào, mô thực vật.
I.2.4. Quy trình làm sạch virus đợc tiến hành theo sơ đồ:
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Vùng

2
Sổ tay Chuyển giao công nghệ phục vụ phát triển nông thôn miền núi - Xác định virus
- Xử lý nhiệt độ cao 36 - 37
0
C
- Tiếp tục xử lý nhiệt độ cao 39- 40
0


Xét nghiệm virus:
- Cây chỉ thị
- Kính hiển vi Điện tử Duy trì độ sạch bệnh:
- Huyết thanh - Nhà màn cách ly, vùng cách ly.
- ELISA - Thanh lọc, vệ sinh.

Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Vùng

3
Sổ tay Chuyển giao công nghệ phục vụ phát triển nông thôn miền núi II. Các bớc tiến hành kỹ thuật nuôi cấy meristem.
II.1. Bớc 1: Chuẩn bị mẫu.
- Lấy củ khoai tây đã có mầm trồng vào chậu đất mùn hoặc cát để đợc
vô trùng và đặt trong điều kiện nhiệt độ, ánh sáng bình thờng.
- Khi mầm cao 10 - 15cm, cắt lấy phần ngọn dài 3 - 4cm.
- Rửa ngọn bằng nớc xà phòng loãng.
- Dùng vòi nớc chảy để rửa nớc xà phòng, sau đó đợc rửa lại bằng
nớc cất rồi đặt vào buồng cấy để thực hiện các thao tác tiếp theo.
II.2. Bớc 2: Khử trùng mẫu trong buồng cấy vô trùng.
- Tráng lại mẫu bằng cồn 70
0
, sau đó rửa sạch bằng nớc cất vô trùng 2
- 3 lần.
- Khử trùng bằng HgCl
2
0,1% trong 5 - 7 phút.
- Rửa mẫu 2 - 3 lần bằng nớc cất. Sau đó đặt mẫu lên giấy lọc đã vô

3
38,0gr
3 MgSO
4
. 7H
2
O 7,4gr
4 KH
2
PO
4
3,4gr
Lấy 50ml/lít Pha chung
5 CaCl
2
. 2H
2
O 8,8gr Lấy 50ml/lít Pha riêng
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Vùng

4
Sổ tay Chuyển giao công nghệ phục vụ phát triển nông thôn miền núi II Vi lợng

1 H
3
BO
3

. 7H
2
O 5,56gr
2 Na
2
EDTA 7,46gr
Lấy 5ml/lít Pha chung
IV Vitamin

1 Axit Nicotinic (B5) 50,0mg
2 Thiamin HCl 50,0mg
3 Riboflavin 5,0mg
4 Ca-pantothenate 25,0mg
5 Axit Folic 0,5mg
6 Biotin 50,0mg
7 Adenin 4000,0mg
Lấy 20ml/lít Pha chung
V Đờng Saccaroza
25,0gr 25gr/lít
VI Agar
6,5gr 6,6gr/lít
Kinetin
0,01ppm
VII
GA3
3,0ppm
Bổ sung sau khi
đã khử trùng môi
trờng


- Vệ sinh, cắt bỏ bớt phần dập hỏng (mẫu nuôi cấy có kích thớc 0,5 -
0,7mm).
- Cắt các đoạn chồi mầm có kích thớc 0,5 - 0,7mm để nuôi cấy .
- Cấy vào môi trờng có agar, nên dùng ống nghiệm, mỗi ống nghiệm
cấy 01 mẫu.
- Sau 15 - 20 ngày chuyển những mẫu không bị nhiễm bệnh hoặc không
bị chết sang môi trờng mới (môi trờng nhân nhanh) còn gọi là môi trờng
MS (Murashige and Skoog - 1962) gồm có thành phần nh sau:
TT Tên hoá chất
Lợng pha 1 lít
dung dịch mẹ
Lợng lấy cho
1 lít môi
trờng nuôi
cấy
Ghi chú
1 2 3 4 5
I Đa lợng

1 NH
4
NO
3
30,0gr
2 KNO
3
38,0gr
3 MnSO
4
. 7H

4 KI 83,0mg
5 CuSO
4
. 5H
2
O 2,5mg
6 MoO
4
Na
2
. 2H
2
O 25,0mg
7 CoCl
2
. 6H
2
O 2,5mg
Lấy 10ml/lít Pha chung
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Vùng

6
Sổ tay Chuyển giao công nghệ phục vụ phát triển nông thôn miền núi III Sắt

1 FeSO
4
. 7H

trờng). Sau 12 - 15 ngày cấy chuyển 1 lần.
- Chú ý nên cấy chuyển luân phiên giữa môi trờng đặc và lỏng để đảm
bảo cả hệ số nhân và chất lợng cây giống.
- Điều kiện phòng nuôi cấy:
+ Nhiệt độ phòng nuôi: 20 - 22
0
C.
+ Quang chu kỳ: 16 giờ sáng/8 giờ tối.
+ Cờng độ ánh sáng: 4000 Lux.
- Môi trờng sử dụng cho nhân nhanh có thể sử dụng 1 trong các môi
trờng dới đây:
+ MS + 2% Saccaroza + 10% nớc dừa (môi trờng lỏng).
+ MS + 2% Saccaroza + 10% nớc dừa + 6 - 6,5gr agar (môi trờng
đặc).
IV. Sản xuất khoai tây sạch bệnh trong ống nghiệm:
Củ bi (microtuber) đợc tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy (in
vitro) từ những cây sạch bệnh nên là củ siêu sạch.
IV.1. Tiêu chuẩn để tạo củ trong ống nghiệm:
Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Vùng

7
Sổ tay Chuyển giao công nghệ phục vụ phát triển nông thôn miền núi Muốn cây hình thành đợc nhiều củ thì cây phải đợc sinh trởng tối đa
về thân lá. Bộ lá càng lớn thì củ càng to. Sau khi cấy 25 - 30 ngày cây đạt tiêu
chuẩn tạo củ phải đảm bảo: Cao 7 - 10cm, có khoảng 8 - 10 lá.
IV.2. Môi trờng tạo củ trong ống nghiệm:
MS + 12% đờng.
IV.3. Các bớc tạo củ trong ống nghiệm:

Sổ tay Chuyển giao công nghệ phục vụ phát triển nông thôn miền núi V.2. Bồn mạ và phơng pháp tạo bồn mạ khoai tây:
Bồn mạ khoai tây là nơi trồng cây nuôi cấy mô với mật độ lớn. Bồn mạ
có thể đợc làm bằng khay gỗ, khay nhựa không quá lớn để dễ dàng di
chuyển.
- Kích thớc của bồn: dài 50cm x rộng 40cm x sâu 10cm. Trồng 150
cây/khay. Phía dới khay là hộp xốp hoặc thùng đựng dung dịch dinh dỡng
theo dạng thuỷ canh.
- Cách tạo bồn mạ: Cây trong bồn đợc lấy ra nhẹ nhàng bằng panh, sau
đó dùng thuốc rửa sạch môi trờng (agar, đờng) còn bám dính vào rễ. Rửa
từng cây và thật nhẹ nhàng để tránh dập nát. Rửa đợc 10 bình (khoảng 100
cây lại thay nớc 1 lần).
V.3. Giá thể ra cây thích hợp.
V.3.1. Giá thể thích hợp là yêu cầu đầu tiên của việc đa cây in vitro ra
bồn mạ. Giá thể phải đảm bảo: sạch nấm bệnh, tơi xốp, dễ thoát nớc, thông
thoáng. Giá thể tốt nhất đợc làm chủ yếu bằng trấu hun, vỏ trấu, than củi, củi
khô, gạch hoặc đá, ống kim loại hình trụ đờng kính 10 - 12cm, cao 0,7 - 1m.
- Dùng gạch hoặc đá để dựng ống hình trụ, cao so với mặt đất 15cm.
- Xếp củi xung quanh và đốt cho than củi cháy.
- Rắc vỏ trấu xung quanh cho cháy từ từ. Khi lớp trấu đầu đã cháy hết
thì tiếp tục bổ sung các lớp trấu mới cho đến khi đống trấu hun cao đến miệng
ống trụ kim loại.
- Quá trình hun khoảng 10 phút đảo 1 lần cho trấu cháy hết, đảo đều 3 -
5 lần là đợc.
- Khi hun xong tãi mỏng đống trấu cho chóng nguội.
V.3.2. Chuẩn bị giá thể để trồng cây:
Giá thể (trấu hun) cần đợc rửa sạch trớc khi trồng cây, sau đó cho vào
khay, độ dày 7 - 8cm. Khay có kích thớc 50cm x 40cm chia thành 11 hàng

2
PO
4
250gr
4 MgSO
4
. 4H
2
O 510gr
Pha chung
1 Fe chelat 6,3gr FeSO
4
+ 9,3gr EDTA Pha riêng
1 MnSO
4
. 4
2
O 2,5gr
2 H
3
BO
3
2,5gr
3 Zn SO
4
0,5gr
4 CuSO
4
. 5H
2


V.3.4. Khai thác bồn mạ:
ở những vùng mát mẻ, có 12 giờ chiếu sáng/ngày nh Đà Lạt có khả
năng nhận cây nuôi cấy mô ở trong bồn mạ bằng cắt ngọn liên tục nhiều lần
để giảm giá thành sản phẩm. Tuy nhiên, ở các tỉnh phía Bắc, khoai tây đợc
trồng trong vụ Đông nhiệt độ thấp và ngày ngắn nên việc cắt ngọn nhiều lần
khó đảm bảo những điều kiện tối u. Để khai thác bồn mạ hợp lý cần thực
hiện.
- Xác định thời gian và số lần cắt ngọn:
+ Sau khi trồng ở bồn mạ 15 ngày, cây có 5 lá trở lên có thể tiến hành
cắt ngọn.
+ Mỗi ngọn cắt phải có 2 lá hoàn chỉnh và phần gốc còn lại của cây phải
có 2 đốt và 2 lá hoàn chỉnh. Dùng dao lam đã khử trùng (nhúng vào cồn và hơ
lên ngọn lửa đèn cồn) để cắt ngọn. Sau mỗi lần cắt 1 lần khử trùng dao lam.
+ Sau cắt lần 1 khoảng 15 ngày có thể cắt ngọn 2 lần, sau 15 ngày nữa
thì cắt lần 3.
+ Chỉ nên cắt ngọn 3 lần.
- Giá thể giâm ngọn cắt:
Giá thể thích hợp nhất là trấu hun trộn đều với mùn theo tỷ lệ 1: 1. Sau
đó phun nớc đủ ẩm 75% để giâm ngọn cắt.
Cần giữ ẩm cho bộ lá trong 5 ngày kể từ giâm ngọn bằng cách dùng
bình phun để phun mù bên trên không gian mặt giá thể, không đợc phun vào
giá thể.
- Xác định tuổi cây để cắt ngọn:
+ Không cắt ngọn quá muộn khi cây đã có lá kép, nh vậy dễ hình
thành củ ngay sau khi giâm ngọn cắt.
+ Chỉ cắt ngọn khi cây có lá đơn.
- Tăng số ngọn trồng trực tiếp cây in vitro ra đất sau khi cắt ngọn:
Khi cây ở bồn mạ đợc 2 tuần tuổi có thể trồng trực tiếp trong nhà màn
cách ly với mật độ 20 cây/m