TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊ QUANG KHÔI
MSHV: 62031101 KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHÓM
VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG
CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở
VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ
ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC AO CÁ TRA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 Năm 2015
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



i
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của Nghiên cứu sinh Lê
Quang Khôi với sự hướng dẫn của PGS. TS. Trương Trọng Ngôn và GS.TS.
Cao Ngọc Điệp. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực,
chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào
trước đây./.

Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án
PGS. TS. TRƯƠNG TRỌNG NGÔN LÊ QUANG KHÔI

GS. TS. CAO NGỌC ĐIỆP

Cuối cùng, xin được gởi lời biết ơn đến Sở Khoa học và Công nghệ,
Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng và Dịch vụ Khoa học Công nghệ Tiền Giang
đã sắp xếp công việc và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để t
ôi hoàn thành
kế hoạch học tập toàn khóa trong chương trình đào tạo tiến sĩ. Đặc biệt là đối
với gia đình đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ tôi
trong chặng đường cam go để hoàn thành được luận án nghiên cứu này.
Chân thành cám ơn./.
Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

iii
TÓM TẮT
Vi khuẩn tích lũy poly-phosphate (poly-phosphate accumulating bacteria
-PAB) là nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trong xử lý nước thải bằng con
đường sinh học. Chúng tích lũy lượng lớn poly-phosphate nội bào, góp phần
vào quá trình loại bỏ phốt-pho hòa tan trong nước.
Đề tài được thực hiện với mục tiêu khảo sát tính đa dạng di truyền nhóm
vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-phosphate (poly-P) trong chất thải chăn
nuôi heo đã qua xử lý biogas và ao nuôi thâm canh cá tra ở các tỉnh ĐBSCL
bao gồm các khâu phân lập và tuyển chọn, phân tích tính đa dạng di truyền và
ứng dụng vào trong xử lý
phốt-pho hoà tan.
Áp dụng phương pháp truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử hiện
đại để phân lập PAB. Kết quả có 439 dòng vi khuẩn phân lập từ 196 mẫu chất
thải, trong đó có 191 dòng phân lập từ 70 mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá
tra và 248 dòng phân lập từ 126 mẫu chất thải chăn nuôi heo. Qua tiến trình
tuyển chọn và mô tả các đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn có tiềm năng
tích lũy poly-phosphate, kết quả nghiên cứu đã tìm ra đư
ợc 48 dòng vi khuẩn

iv
nucleotide k=116,6 với chỉ số đa dạng nucleotide trung bình Pi=0,16 và có sự
biến thiên từ 0,07 đến 0,3. Sự biến thiên các chỉ số θ và Pi tạo nên các dạng
haplotype khác nhau trong quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P, có 25 haplotype
(kiểu gen) được tạo ra từ 48 trình tự nucleotide. Sự khác nhau về cấu trúc của
các haplotype tạo nên sự đa dạng cao giữa chúng (Hd=0,91). Điều này làm
xuất hiện nhiều kiểu gen có tính biến dị di truyền và khả năng thích nghi với
môi trường sống trong quá trình tiến hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng
tích lũy hàm
lượng poly-P cao. So sánh sự đa dạng di truyền giữa hai quần xã
vi khuẩn phân lập ở hai địa điểm lấy mẫu, kết quả cho thấy tính đa dạng
nucleotide, đa dạng haplotype của các dòng vi khuẩn phân lập trong chất thải
chăn nuôi heo (Pi=0,16, h=14) thấp hơn và tính bảo tồn gen cao hơn các dòng
vi khuẩn phân lập trong chất thải ao nuôi cá tra (Pi=0,18, h=16). Đây là cơ sở
khoa học trong việc lựa chọn nguồn mẫu để phâ
n lập và tuyển chọn các dòng
vi khuẩn tích lũy poly-P.
Thông qua quá trình tuyển chọn ban đầu từ tập hợp 20 dòng vi khuẩn
phân lập được, 2 dòng TGT013L và TGT025L có khả năng làm giảm hàm
lượng phosphate cao nhất trong nước thải tổng hợp từ 17,7 mg/L xuống còn
4,1 và 2,6 mg/L sau 25 giờ thí nghiệm, với hiệu suất loại bỏ phosphat tương
ứng là 76,5% và 85,3% (ở pH khoảng 8,1; chỉ số OD.600 nm khoảng 0,6). Tổ
hợp 2 dòng TGT013L+TGT025L cho hiệu quả loại bỏ phosphate hoà tan
trong nước ao nuôi cá tra xuống còn 0,
5 mg/L với hiệu suất xử lý đạt 85,1%
sau 36 giờ cấy bổ sung vi khuẩn. Kết quả chụp TEM và PCR cho thấy 2 dòng
vi khuẩn này có gen đồng hóa phosphate thành dạng hạt poly-phosphate nội
bào. Chúng được xác định có mối quan hệ gần gũi với Acinetobacter
radioresistens (GU145275) và Kurthia sp. (JQ398850), cùng tỉ lệ tương đồng
với trình tự gen 16S rRNA trên Genbank, 99%. Hai dòng vi khuẩn này có

gene 1 type-IIA and IIC that synthesizes intracellular poly-phosphate granules;
the content of intracellular poly-phosphate varied from 10
-9
to 10
-12
mg/cell.
Based on the partial 16S rRNA genes of these isolates were sequenced
and compared with bacterial 16S rRNA genes in Genbank show that PAB
have a diversity of the composition of species, 22 strains isolated from
intensive catfish ponds included in four classes: Bacilli, Actinobacteria, Beta-
proteobacteria, Gamma-proteobacteria; and 26 strains isolated from piggery
waste-water treated bio-digesters included in four classes: Bacilli,
Actinobacteria, Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria. The strains
which related to Bacillus were dominant bacteria group constituted up to 54%
of all identified isolates, but high potential strains of accumulating poly-
phosphate are Acinetobacter sp. within class Gamma-proteobacteria;
Rhodococcus sp. within class Actinobacteria; Ochrobactrum sp. within class
Alpha-proteobacteria.
The process of analysis and comparison of genetic diversity of 48 isolates
showed 16S rRNA sequences have nucleotide regions of high variability
Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

vi
interspersed with nucleotide regions of low variability. These areas generate
characteristics included nucleotide polymorphisms and diversity among 16S
rRNA sequences of high poly-phosphate accumulating bacteria. Measurement
of the amount of DNA polymorphisms revealed the number of polymorphic
sites among DNA sequences was 82.02 with the mean of the number of
polymorphic sites was θ=0.11 and the variance of θ ranged from 0.06 to 0.17.

intensive catfish ponds that applied microbial biotechnology.
Keyword: Acinetobacter, Kurthia, θ index, Pi index, poly-phosphate, poly-
phosphate accumulating bacteria.
Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

vii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CÁM ƠN ii
TÓM TẮT iii
SUMMARY v
MỤC LỤC
vii
DANH SÁCH BẢNG
xi
DANH SÁCH HÌNH
xii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
xv
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiê
n cứu 2
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu
2
1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2
1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3
1.4 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học

17
2.6.2 Xác định hàm
lượng poly-P nội bào 18
2.7 Cơ chế quá trình trao đổi chất của nhóm
vi khuẩn PAB và sự điều hòa 21
2.7.1 Cơ chế quá trình trao đổi chất của vi khuẩn tích lũy poly-P
21
2.7.2 Quá trình tổng hợp và
điều hòa sự tổng hợp poly-phosphate 23
2.7.2.1 Các enzyme tham gia tổng hợp poly-P 24
2.7.2.2 Các enzyme tham gia phân giải poly-P
24
2.7.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và phosphate
25
2.7.2.4 Ảnh hưởng pH và Mg
2+
trên quá trình đồng hóa và dị hóa 27
2.8 Cơ sở khoa học phân tích sự đa dạng di truyền ở vi khuẩn
28
2.8.1 Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự gen 16S rRNA
28
2.8.1.1 Gen rRNA trong phân tích mối qua
n hệ di truyền của vi khuẩn 28
2.8.1.2 16S Ribosomal RNAs 30
2.8.1.3 Phân tích mối qua
n hệ di truyền dựa trên gen 16S rRNA 30
2.8.2 Gen ppk1 trong phân tích mối quan hệ di
truyền của PAB 32
2.8.3 Phân tích đa dạng di truyền
33

45
3.2 Phương phá
p nghiên cứu 47
3.2.1 Chuẩn bị mẫu
47
3.2.1.1 Đối với mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá tra
47
3.2.1.2 Đối với mẫu chất thải trại heo [sau
hầm ủ biogas] 48
3.2.2 Phân lập vi khuẩn
49
3.2.3 Định tính hạt pol
y-P nội bào 50
2.2.4 Xác định hàm
lượng poly-P nội bào 50
3.2.5 Nhận diện ge
n ppk1 51
3.2.6 Định danh PAB
52
3.2.7 Phân tích sự đa dạng vi khuẩn tích lũy poly-P
53
3.2.8 Thí nghiệm k
iểm tra sơ bộ khả năng loại bỏ phosphate hòa tan 54
3.2.9 Thí nghiệm
theo dõi sự biến đổi pH, OD.600nm 54
3.2.10 Thí nghiệm k
iểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate qui mô 10 lít 56
3.2.11 Thí nghiệm k
iểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate qui mô 500 lít 57
3.2.12 Đánh giá hiệu quả xử l

4.3 Kết quả tuyển c
họn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P 104
4.3.1 Kết quả kiểm tra
hiệu suất loại bỏ phosphate của 20 dòng vi khuẩn 104
4.3.2 Sự biến đổi chỉ số pH và hàm
lượng PO
4
3-
theo thời gian 105
4.3.3 Sự biến đổi chỉ số O
D.600 nm và hàm lượng PO
4
3-
theo thời gian 106
4.3.4 Kết quả loại bỏ phos
phate trong nước ao nuôi cá tra 110
4.3.4.1 Sự biến đổi hàm lượng P
O
4
3-
theo thời gian qui mô 10 lít 110
4.3.4.2 Sự biến đổi hàm lượng P
O
4
3-
theo thời gian qui mô 500 lít 112
4.3.4.3 Đánh giá hiệu quả xử l
ý PO
4
3-

n tích AGH006L, BTT006L, TGT013L, TGT025L 163
PL5.2: Kết quả phân tích TGT025, DC, TGT013, TGT013L+TGT025L
167
PL5.3: Kết quả phân tích TGT025, DC, TGT013, TGT013L+TGT025L
168
Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

xi
DANH SÁCH BẢNG

Bảng Tên bảng Trang
2.1: Các chất sử dụng và điều kiện ly trích poly-P (Eixler et al., 2005) 20
2.2: Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk1 (He et al., 2007) 25
2.3: Thành phần của ribosome của tế bào nhân sơ và nhân thật 29
2.4: Hóa chất thường dùng để trầm hiện ortho-phosphate. 36
2.5: Acid béo hòa tan được hình thành trong bể kỵ khí 40
2.6: Cấu trúc phân tử các đơn vị cấu tạo nên PHAs 40
3.1: Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk1 (He et al., 2007) 47
3.2: Trình tự primer nhận diện 16S rDNA vi khuẩn PAB 47
4.1: Mật số vi khuẩn dị dưỡng (CFU/mL) 61
4.2: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn 63
4.3: Tỷ lệ phần trăm về đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn 65
4.4: Tổng hợp kết quả kiểm tra hàm lượng poly-P nội bào 66
4.5: Đặc điểm sinh học PAB phân lập từ chất thải ao nuôi cá tra 67
4.6: Đặc điểm sinh học PAB phân lập trong chất thải chăn nuôi heo 70
4.7: Hàm lượng poly-P nội bào vi khuẩn phân lập từ ao nuôi cá tra 75
4.8: Hàm lượng poly-P nội bào vi khuẩn từ chất thải chăn nuôi heo 76
4.9: Kết quả định tên vi khuẩn phân lập trong nước ao nuôi cá tra 82
4.10: Kết quả định tên vi khuẩn phân lập trong chất thải chăn nuôi heo 85

2.7: Sự hiện diện các hạt
poly-P 21
2.8: Hiệu quả trích pol
y-P bằng nước lạnh, nước nóng và NaOH 21
2.9: Các đặc điểm
sinh hóa chính trong quá trình EBPR 22
2.10: Chuyển hoá acetate và glycogen thành PHB bởi
PAB 22
2.11: Mối tương qua
n giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm lượng COD 26
2.12: Sơ đồ mô
tả sự đồng vận chuyển MgHPO
4
/H
+
27
2.13: Ribosome của prokaryote và eukaryote
29
2.14: Ribosomal RNA operon của E.c
oli 29
2.15: Các ribosomal RNAs genes của eukaryotes
30
2.16: Giản đồ cho 16S rRNA nằm trên tiểu đơn vị nhỏ của ribos
ome 31
2.17: Biểu đồ các bước phân tích mối quan hệ di truyền
32
2.18: Chỉ số đa dạng Shannon (H
′
) và chỉ số độ đồng đều (J
′

n pH chất thải ao nuôi nuôi cá tra và mật số 62
4.3: Hình dạng và kích t
hước các dòng vi khuẩn phân lập 68
4.4: Khuẩn lạc PAB phân lập trong chất thải ao nuôi cá tra
69
4.5: Khuẩn lạc PAB phân lập trong chất thải chăn nuôi heo
71
4.6: Hình dạng và cấu trúc bên trong P
AB trong nước ao nuôi cá tra 73
4.7: Hình dạng và cấu trúc bên trong P
AB trong chất thải nuôi heo 74
4.8: Phổ điện di (1) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA
77
4.9: Phổ điện di (2) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA
78
4.10: Phổ điện di (3) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA
78
4.11: Phổ điện di (4) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA
78
4.12: Phổ điện di (5) sản phẩm PCR của
gen 16S rRNA, gen ppk1 79
4.13: Phổ điện di
sản phẩm PCR của gen ppk1 trên gel agarose 1,2 % 79
4.14: Phổ điện di
sản phẩm PCR của gen ppk1 trên gel agarose 1,2 %. 80
4.15: Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 22 dòng vi khuẩn
81
4.16: Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 26 dòng vi khuẩn
84
4.17: Tỉ lệ các lớp vi khuẩn phâ

4.30: Sự biến thi
ên chỉ số Pi trong vùng có vị trí từ 100 đến 866 102
4.31: Biến đổi pH theo thời g
ian của 5 dòng vi khuẩn 106
4.32: Phương trình tuyến tính giữa O
D.600 nm và mật số vi khuẩn 107
4.33: Sự biến đổi h
àm lượng PO
4
3-
và chỉ số OD.600 nm 108
4.34: Hiệu suất loại bỏ phos
phate của 5 dòng vi khuẩn sau 25 giờ 109
4.35: Biến đổi hàm lượng P
O
4
3-
theo thời gian 111
4.36: Hiệu suất loại bỏ phos
phate của 2 dòng vi khuẩn 111
4.37: Biến đổi hàm lượng P
O
4
3-
theo thời gian giữa 2 nghiệm thức 112
4.38: Sự biến đổi chỉ tiêu pH
trong nước bể ao nuôi cá tra 114
4.39: Sự biến đổi h
àm lượng PO
4

DTT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Đồng Tháp
DTH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Đồng Tháp
ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long
EBPR: Enhanced biological phosphorus removal-Tăng cường sự loại bỏ phốt-
pho bằng sinh học
EDX: Phân tích sự phân tán năng lượng tia X
EELS: Electron energy loss spectroscopy-quang phổ phân tán năng lượng điện tử
GAOs: Glycogen accumulating organisms-vi khuẩn tích lũy glycogen
HAc: Hydroxy-Acetate
HGH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi he
o ở Hậu Giang
HGT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Hậu Giang
KGH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Kiên Giang
KGT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Kiên Giang
LAH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Long An
Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

xvi
N: Nitơ
P: Phốt-pho
PAB: Poly-phosphate accumulating bacteria-vi khuẩn tích lũy poly-P
Poly-P: Poly-phosphate
ppk1: Gen poly-phosphate kinase 1
PHAs: Poly-hydroxyalkanoates
PHB: Poly-hydroxybutyrate
SCFAs: Short chain fatty acids-axid béo mạch ngắn
SEM: Scanning electron microscopy-Kính hiển vi điện tử quét
STT: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra ở Sóc Trăng
STH: Ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải chăn nuôi heo ở Sóc Trăng

trình phân hủy tảo sẽ làm cho môi trường nước ao bị ô nhiễm, thiếu oxy cung
cấp cho hoạt động hô hấp của cá, cá sẽ suy yếu và dễ nhiễm bệnh.
Để xử l ý phốt-pho hòa tan, một số biện pháp được sử dụng là xử lý bằng
hóa học và sinh học. Trong biện pháp xử lý bằng sinh học, nhóm
vi khuẩn có
khả năng hấp thu và tồn trữ P như nguồn phốt-pho nội bào giữ vai trò quan
trọng và chúng được xem như là vi khuẩn tích lũy poly-phosphate. Loại bỏ
phốt-pho hoà tan dạng PO
4
3-
thông qua hoạt động vi khuẩn ngày càng được
ứng dụng bởi vì các đặc tính hữu dụng của chúng là dễ ứng dụng, hiệu quả về
mặt kinh tế và thân thiện với môi trường sống (Mino et al., 1998).
Các nghiên cứu trên thế giới về thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy
poly-phosphate bằng cách sử dụng các phương pháp mô tả truyền thống và kỹ
thuật sinh học phân tử hiện đại cho thấy quần xã vi khuẩn tích lũy pol
y-
phosphate có sự đa dạng về thành phần loài kể cả trong các hệ thống xử lý
nước thải và trong các ao-hồ tự nhiên. Sự hiện diện của các loài và thành phần
phần trăm của chúng trong môi trường cũng có sự khác nhau giữa 2 hệ sinh
thái: nhân tạo (hệ thống xử lý nước thải) và tự nhiên (ao-hồ). Tuy nhiên, chúng
chủ yếu thuộc các lớp Bacilli, Alpha-proteobacteria, Beta-proteobacteria,
Gamma-proteobacteria và Actinobacteria (Crocetti et al., 2000; Ahn et al.,
2007; Bond et al., 1995, Beer et al., 2006; Szabó et al., 2011). Việc phân lập,
định danh vi khuẩn tích lũy poly-P bằng kỹ thuật sinh học ph
ân tử có vai trò
quan trọng không chỉ để ứng dụng chúng trong quá trình xử lý phốt-pho hòa
tan mà còn hỗ trợ trong việc đánh giá sự phân bố và tính di truyền quần thể
của chúng.
Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

việc sản xuất chế phẩm sinh học xử lý phốt-pho hòa tan.
Ứng dụng các dòng vi khuẩn phân lập được để xử lý phốt-pho hòa tan
trong nước ao cá tra ở qui m
ô phòng thí nghiệm.
1.2.2 Nội dung
nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P từ các nguồn thải của trại chăn nuôi
heo và ao cá tra của 13 tỉnh ĐBSCL từ đó tuyển chọn các dòng có hiệu quả
tích lũy poly-P cao.
Xây dựng cây phả hệ các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P được phân lập
dựa trên trình tự gen 16S rRNA từ đó phân tích sự đa dạng di truyền dựa trên
các chỉ số đa dạng sinh học.
Đánh giá khả năng xử lý phốt-pho hòa tan trong nước ao cá tra của các
dòng vi khuẩn tíc
h lũy poly-P phân lập được thông qua qui mô thử nghiệm chế
phẩm này (ở phòng thí nghiệm với qui mô là 500 lít).
Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

3
1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Luận án nghiên cứu có tính hệ thống về vi khuẩn tích lũy poly-P hiện
diện trong chất thải chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra, bao gồm các khâu phân
lập, tuyển chọn, đánh giá tính đa dạng sinh học và ứng dụng vào trong xử lý
phốt-pho hòa tan trong nước ao cá tra. Trên cơ sở kết quả nghiên cứu, các
dòng vi khuẩn phân lập được xem như là các đại diện của PAB trong chất thải
chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra ở các tỉnh ĐBSCL
.
Quá trình phân lập dựa vào cơ chế trao đổi chất đặc biệt trong quá trình
tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn tích lũy poly-P, cho phép điều chỉnh

1.4 Cách tiếp cận và giả thuyết k
hoa học
Quá trình phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P được dựa trên các quy trình
phân lập của Fuhs và Chen (1975); Sidat et al., (1999); Nakamura et al.,
(1991) và đặc tính sinh học đặc biệt là vi khuẩn tích lũy poly-P có khả năng
Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

4
hấp thu các acid béo mạch ngắn (short chain fatty acids-SCFAs) như acetate
và đồng hóa chúng thành poly-hydroxyalkanoates (PHAs). PHAs được xem
như là nguồn carbon nội bào cần thiết cho tế bào vi sinh vật sống sót trong
điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng (Mino et al., 1998). Chính vì vậy, các
khuẩn lạc có hình thái khác nhau trên môi trường phân lập (có nguồn carbon)
sẽ được chọn và cấy chuyển sang môi trường thiếu nguồn carbon (môi trường
cấy chuyền), chỉ có những vi khuẩn có đặc tính trên mới có thể tăng trưởng và
phát triển được. Thao tác trên được lặp đi lặp lại và luân phiên giữa hai môi
trường phâ
n lập và cấy chuyền cho đến khi chọn được dòng vi khuẩn thuần.
Vi khuẩn tích lũy poly-P là vi khuẩn có khả năng hấp thu lượng lớn
phosphate ngoại bào và đồng hóa thành poly-P nội bào. Do đó, để chứng minh
nguồn vi khuẩn phân lập thuộc nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P và đồng thời
xác định được khả năng hoạt động của chúng, cần phải kiểm tra hàm lượng
pol
y-P nội bào. Hiện nay chưa tìm thấy phương pháp xác định trực tiếp hàm
lượng poly-P nội bào. Trong Luận án, việc kiểm tra các đặc tính sinh hoá của
các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập thông qua việc áp dụng các
phương pháp có sự kết hợp giữa định tính và định lượng như: định tính hạt
poly-P bằng phương pháp chụp tế bào dưới kính hiển vi điện tử truyền quét
thông qua xử l ý sinh khối theo Boswell et al., (2001). Định hàm lượng poly-P

nucleotide (θ) và sự đa dạng nucleotide (Pi) vùng gen 16S rRNA của nhóm vi
khuẩn tích lũy poly-P và tìm sự khác nhau giữa hai quần xã vi khuẩn tích lũy
poly-phosphate phân lập được trong chất thải ao nuôi cá tra và chăn nuôi heo.
Sự biến thiên các chỉ số θ và Pi tạo nên các dạng haplotype khác nhau. Sự
khác nhau về cấu trúc của các haplotype tạo nên sự đa dạng gen giữa chúng.
Điều này làm xuất hiện nhiều kiểu gen có tính biến dị di truyền và khả năng
thích nghi với môi trường sống trong quá trì
nh tiến hóa của các dòng vi khuẩn
có khả năng tích lũy poly-P. Đây là cơ sở khoa học trong việc lựa chọn nguồn
mẫu để phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P có khả năng
thích nghi cao với môi trường.
Quá trình tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P có khả năng loại bỏ phốt-
pho hòa tan cao trong nước ao cá tra được thực hiện qua nhiều công đoạn với
cách bố trí thí nghiệm
phù hợp, mang tính khoa học cao. Số liệu được thu
thập, xử lý và so sánh bằng các phương pháp phân tích và phần mềm thống kê
đáng tin cậy (phân tích ANOVA với phép thử Turkey để tìm ra sự khác biệt trị
số trung bình giữa các nghiệm thức bằng phần mềm phân tích thống kê
Minitab 16).
1.5 Kết cấu của luận án
Luận
án có 3 phần: Phần đầu (16 trang được đánh số từ i đến xvi). Phần
chính luận án gồm 5 chương: Chương 1: Giới thiệu (5 trang với 5 tiểu mục,
được đánh số từ 1 đến 5); Chương 2: Tổng quan tài liệu (38 trang với 9 tiểu
mục được đánh số từ 6 đến 43); Chương 3: Phương tiện và phương pháp
nghiên cứu (17 trang với gồm 2 tiểu mục và 6 thí nghiệm ứng dụng, đư
ợc
đánh số từ 44 đến 60); Chương 4: Kết quả và thảo luận (59 trang với 3 tiểu
mục được đánh giá số từ 61 đến 119); Chương 5: Kết luận và đề nghị (2 trang
với 2 tiểu mục được đánh số từ 120 đến 121). Phần cuối [72 trang bao gồm

2
PO
4
-
và H
3
PO
4
.

Hình 2.1: Cấu trúc phân tử: (a) ortho-phosphate, (b) poly-phosphate (Ahlgren, 2006)
Thể ortho-phosphate thường gặp nhất trong nước là HPO
4
2-
và H
2
PO
4
-
,
số lượng của mỗi loại tùy vào pH của môi trường. Trong hầu hết các hệ thống
xử lý nước thải, HPO
4
2-
, H
2
PO

Hình 2.2: Cấu trúc chuỗi pyro-phosphate (Ahlgren, 2006)
Poly-phosphate dạng vô cơ là polymer đầu tiên được xác định bởi Wiame
(1947) như là một trong những thành phần hạt quan trọng được tích lũy trong
nội bào (Hình 2.3).
(a) (b)
Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

7

Hình 2.3: Ảnh chụp TEM hạt poly-P màu đen trong vi khuẩn Pseudomonas putida
CA-3 (Tobin et al., 2007)
Poly-P là những phân tử mang điện âm mạnh và tạo phức với nhiều ion
kim loại. Phức hợp của poly-P với những kim loại như Ba
2+
, Pb
2+
, Mg
2+
là
những hợp chất kém hòa tan. Điều này có thể gây kết tủa phức hợp poly-
phosphate-kim loại trong tế bào như là những hạt nhỏ poly-P và bắt màu khi
nhuộm (Bonting et al., 1993). Ngày nay, poly-P được nhận biết như là bio-
polymer hiện diện hầu hết trong các sinh vật: vi khuẩn, nấm, thực vật và động
vật (Dawes và Senior, 1973). Poly-P là chuỗi thẳng bao gồm gốc phosphate
nối với nhau bằng cầu nối giàu năng lượng phospho-alhydride (Hình 2.4) và
chiều dài từ 3 tới 1000 gốc phosphate (Kulaev, 1979).

Hình 2.4: Cấu trúc của phân tử ATP (adenosin triphosphate)
(ngày 25/12/2013)