1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng làm ngưng kết hồng cầu,
liên kết với carbohydrate mà không gây đáp ứng miễn dịch. Lectin giữ vai trò quan
trọng như là một phân tử nhận dạng trong sự tương tác giữa chất nền với tế bào hoặc tế
bào với tế bào vì chúng có thể phân biệt sự khác nhau trong cấu trúc cũng như khả
năng liên kết với carbohydrate trên bề mặt tế bào. Những đặc tính này làm cho lectin
trở thành một công cụ hữu ích cho các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: nghiên cứu
miễn dịch học, hóa sinh, sinh học tế bào, xác định và phát hiện nhóm máu, nghiên cứu
tế bào ung thư…[77].
Lectin từ rong biển lần đầu tiên được Boyd phát hiện vào năm 1966 và cho đến
nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về sự phân bố, đặc tính hóa sinh cũng như ứng
dụng của lectin từ rong biển trong nhiều lĩnh vực khác nhau [23,24]. Các nghiên cứu
về lectin từ rong biển cho thấy đặc tính của những lectin này có nhiều khác biệt so với
lectin từ thực vật bậc cao. Hầu hết, các lectin từ rong biển có trọng lượng phân tử thấp,
tồn tại ở dạng monomer, không có ái lực với đường đơn nhưng có ái lực với
glycoprotein (đặc biệt là các glycoprotein từ động vật) và thuộc nhóm protein rất bền
nhiệt và hoạt tính của chúng không đòi hỏi sự có mặt của các cation hóa trị II [43]. Với
những tính chất ưu việt trên, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan tâm trong
các nghiên cứu cơ bản cũng như các ứng dụng của chúng trong tương lai.
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biển
khoảng 3260km, với hơn 1000 loài rong biển đã được tìm thấy. Trong đó, đã xác định
được 151 loài thuộc ngành rong Lục (Chlorophyta), 269 loài thuộc ngành rong Đỏ
(Rhodophyta), 143 loài thuộc ngành rong Nâu (Phaeophyta) và 76 loài thuộc ngành
rong Lam (Cyanophyta) [58]. Đây là nguồn vật liệu vô cùng phong phú cung cấp cho
việc nghiên cứu, điều chế những hợp chất có hoạt tính sinh học cao như lectin.
Với kết quả khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 80 loài rong biển thuộc vùng
biển Ninh Thuận và Khánh Hòa từ năm 2009 đến 2011, chúng tôi nhận thấy, hơn 90%
dịch chiết từ rong được khảo sát cho thấy sự hiện diện lectin. Chúng có khả năng làm
ngưng kết với ít nhất một trong các loại hồng cầu được thử nghiệm. Trong đó, dịch

Ở nước ta có khoảng hơn 1000 loài rong biển, phân bố chủ yếu ở vùng biển các
tỉnh phía Nam và phía Bắc. Với hơn 200 loài được tìm thấy ở cả hai miền Bắc Nam.
Trong đó, có các đối tượng quan trọng là: rong Câu (Gracilaria), rong Mơ
(Sargassum), rong Đông (Hypnea), rong Mứt (Porphyza), và rong Bún
(Enteromorpha) [31].
1.2 TỔNG QUAN VỀ LECTIN
1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin
Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng
đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu. Tuy
nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏ
nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng cho
các mục đích y tế. Năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý gây độc của
các hạt Aprus precatorius, cho đến năm 1887 thì Dixson đã xác định được một dịch
lỏng có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein.
Những protein như vậy, được đề cập dưới tên gọi là hemagglutinin hay agglutinin thực
vật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết từ thực vật. Tuy nhiên, tất cả các nhà
khoa học sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ nhất về hemagglutinin
là từ luận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện tại trường đại học Dorpat
(nay là trường đại học Tartu, Estonia) vào năm 1888. Chất hemagglutinin được
Stillmark tách chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis và được đặt tên là ricin,
một độc tố mà sau đó được xác định là có bản chất protein [34].
Năm 1995, Peuman và Van Dame đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc
liên quan đến chức năng của lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có chứa ít
nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” [47]. Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện
hoạt tính sinh học, Peuman và cộng sự đã phân chia lectin thành 3 loại:
4
• Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm liên
kết đường, do đó không có hoạt tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các hợp
chất liên kết đường. Thuộc về loại này là một số protein của các cây họ Lan
(Orchidaceae).

Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được
trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [6]. Lectin từ họ
Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay (Artocarpus tonkinensis),
Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính NKHC rất cao [2].
Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của
lectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y
(Lichenes) và Rong (Algae). Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và
cộng sự vào năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico của Mỹ [18], từ đó đến nay đã có
hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin trong rong biển ở nhiều quốc gia khác
nhau như: Anh, Nhật, Brazil, Hàn Quốc, Việt Nam…[58].
Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu
khoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực
vật [8].
 Sự phân bố lectin trong giới động vật
Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm. Lectin trong
giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus
polyphemus). Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật
thuộc ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra. Ở Việt Nam, khi khảo sát
30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa xuất hiện 10
loài có chứa lectin [8].
Trong khi đó ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điều
tra cơ bản. Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia),
lớp Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia) cũng có chứa lectin.
Ngoài ra, còn có một số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata)
hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)… Một kết quả nghiên cứu khá thú vị, là ở mô
người như mô cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ
miễn dịch cũng chứa lectin. Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin. Đó
cũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [14].
 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật
Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện là vào năm 1942, khi Hirst và cộng

L.,) là 108 kDa hay lectin từ động vật như sam biển Việt Nam (Tachpleus tridentatus)
có khối lượng phân tử lên đến trên 700 kDa thì khối lượng phân tử của lectin từ rong
biển lại khá thấp, phần lớn trong chúng dao động tập trung trong khoảng từ 15 đến 45
kDa. Các nhà khoa học cho rằng chưa thể tìm thấy được mối liên hệ nào giữa khối
lượng phân tử lectin và hoạt tính của chính nó. Khối lượng phân tử của lectin không
mang tính đặc trưng cho loài hay cá thể và cũng không phụ thuộc vào mức độ tiến hóa
của loài hay cá thể đó [8].
 Cấu tạo phân tử lectin từ rong biển
Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, khi nghiên cứu trình tự
axit amin trong phân tử lectin từ rong biển các nhà khoa học đã nhận thấy: trình tự axit
amin trong phân tử lectin phản ánh mối quan hệ trong quá trình tiến hóa. Khi nghiên
7
cứu cấu trúc bậc nhất chuỗi α của lectin ở 3 loài rong cùng chi Eucheuma là E. serra,
E. amakusaensis và E. cottonii, Kawakubo và cộng sự đã cho biết: trình tự của 20 axit
amin đầu N của có tỷ lệ tương đồng rất cao, thành phần gốc axit amin chủ yếu giàu các
gốc Glx, Asx, Gly và Ser [35, 36].
Có khá nhiều công trình đã chỉ ra rằng hầu hết các dạng lectin từ rong biển
được cấu tạo từ một mạch polypeptide. Chỉ một số ít lectin có cấu tạo từ hai mạch
polypeptide trở lên, mỗi mạch polypeptide tạo thành một tiểu đơn vị, các tiểu đơn vị
này có khối lượng phân tử giống nhau hoặc khác nhau. Ví dụ như lectin từ rong đỏ
Vidalia obtusiloba có cấu trúc dimer, trọng lượng của 2 chuỗi polypeptide lần lượt là
59,6 và 15,2 kDa [22], trong khi đó lectin từ rong xanh Codium fragile lại có cấu tạo
tetramer với khối lượng mỗi đơn phân đều là 15 kDa.
Hori và cộng sự nghiên cứu cấu trúc bậc nhất của 2 đồng phân lectin hypnin A-
1 và hypnin A-2 từ rong đỏ Hypnea japonica cho thấy: chúng có cấu tạo đơn phân chỉ
do một chuỗi polypeptide gồm 90 gốc axit amin tạo thành; trong đó, có 4 gốc cystines
tạo thành 2 cầu nối disulfide: cys
5
-cys
62

có bản chất là protein nên chúng có thể đuợc kết tủa bởi một số tác nhân hóa như:
ethanol, acetone, một số muối trung tính ở nồng độ cao đặc biệt là ammonium
sunphate.
 Sự tương tác của lectin từ rong biển với các loại đường và dẫn xuất của nó
Qua các thí nghiệm về khả năng liên kết với các loại đường ở lectin được tách
chiết từ rong biển, người ta nhận thấy lectin từ rong biển ít liên kết với các loại đường
đơn hay đường đa như ở thực vật bậc cao hay động vật mà ngược lại nó liên kết với
các glycoprotein dạng N-glycan hay O-glycan như: porcine stomach mucin,
lactotransferrin, asialofetuin…[39, 57].
Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác với đường của lectin vẫn còn khá phức
tạp. Mặc dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu sử
dụng lectin. Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đó thì có
thể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein đó
[31]. Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein
để xác định kháng nguyên trên bề mặt màng tế bào hồng cầu. Gần đây, dựa vào các
loại đường ức chế đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế
nhiều loại lectin bằng sắc ký ái lực và hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực lectin
để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học.
 Khả năng gây ngưng kết tế bào
Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật và
người. Đây là dấu hiệu đặc trưng nhất để nhận biết lectin. Số lượng lectin có khả năng
ngưng kết hồng cầu chỉ duy nhất của một nhóm máu là rất ít, vì chúng đồng thời có thể
gây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: thỏ, cừu, gà, dê hay ngựa…. Theo tác giả
Allen và Billantine, trong hơn 800 dạng lectin được nghiên cứu thì chỉ có 90 loài chứa
lectin đặc hiệu nhóm máu, 711 loài chứa lectin không đặc hiệu nhóm máu. Lectin từ
rong biển Ptilota plumosa ngưng kết đặc hiệu với nhóm máu B, trong khi lectin từ
rong Codium fragile chỉ ngưng kết hồng cầu máu A đã xử lý papain mà không thể
9
ngưng kết với các nhóm máu khác của người như O, B hay AB [50]. Các lectin đặc
hiệu nhóm máu này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng.

Bảng 1.2: Nguồn lectin từ rong biển có khả năng diệt côn trùng
Nguồn lectin Loại côn trùng Ảnh hưởng
Liên kết
đặc hiệu
Tác giả
Gracilaria
cornea (rong
Đỏ)
Boophilus
microplus
Làm côn trùng
chậm phát
triển, giảm
trọng lượng
trứng và lượng
trứng nở thành
con…
Fetuin, porcine
stomach mucin
Lima et al
2005 [41].
Gracilaria
ornate (rong
Đỏ)
Callosobruchus
maculatus
Làm côn trùng
chậm phát
triển…
Fetuin, porcine

nhập vào tế bào vật chủ của virus. Thêm vào đó, những lectin này thường chịu được
nhiệt độ cao, pH thấp, không có mùi, có khả năng liên kết với nhiều loại glycoprotein
trên bề mặt lớp vỏ của virus. Vì vậy, lectin từ rong biển đang là mục tiêu được quan
tâm trong các nghiên cứu cơ bản và những ứng dụng của chúng trong tương lai.
1.3 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước và nước ngoài
 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Công trình khoa học đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự vào
năm 1966, ông đã phát hiện rong biển cũng có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng
cầu ở người [31]. Kể từ đó có rất nhiều công trình công bố sự có mặt của lectin trong
rong biển:
• Năm 1988, Hori đã khảo sát hoạt tính ngưng kết hồng cầu của 31 loài rong biển
trên hồng cầu người và động vật. Từ kết quả nghiên cứu đạt được ông đã cho rằng hoạt
tính ngưng kết hồng cầu đóng một vai trò quan trọng trong chức năng sinh lý của tế
bào rong biển. Và hoạt tính này có thể tồn tại ở nhiều loài rong biển khác nhau [29].
• Tại Tây Ban Nha, Fábregas được xem là một trong những người tiên phong
trong việc nghiên cứu lectin từ rong biển. Từ năm 1985 đến năm 1992, ông và cộng sự
đã khảo sát sự có mặt của lectin ở hơn 90 loài rong biển thuộc 3 dòng rong: rong đỏ,
rong nâu và rong lục. Trong đó, hoạt tính ngưng kết hồng cầu từ rong đỏ là phổ biến
nhất [31,23].
• Những năm gần đây, nghiên cứu về lectin từ rong biển đang được khảo sát ở
nhiều địa điểm khác nhau trên thế giới với quy mô ngày càng lớn hơn: từ Nam Mỹ,
Châu Âu, Châu Á cho đến các vùng Nam cực. Hơn thế nữa, không chỉ dừng lại ở việc
khảo sát sự có mặt của lectin trong rong biển mà những tính chất cơ bản của nó cũng
đã được chú tâm đến [25,15].
Tuy nhiên, cho đến nay số lượng lectin được tinh sạch cũng như khảo sát đặc
tính hóa sinh vẫn còn rất khiêm tốn, đặc biệt là khi so sánh với lectin từ thực vật bậc
cao [31]. Hầu hết trong số đó là các lectin từ rong biển mà chủ yếu là ở một số dòng
12
rong đỏ như: Bryothamnion seaforthii, B. triquetrum; Solieria filiformis [22];
Pterocladiella capillacea [57] ….Trong số đó, có một vài lectin từ dòng rong đỏ đã

Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó trong quá trình tách
chiết như nồng độ dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết…thì các yếu tố còn lại
được cố định. Yếu tố nào khảo sát xong thì sẽ được cố định ở giá trị tối ưu để tiếp tục
khảo sát đến các yếu tố khác.
 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong E.denticulatum bằng dung dịch đệm phosphate
(PBS 0,05M 0,85% NaCl) với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:2, 1:4, 1:6, 1:8,
1:10, 1:12, 1:14, ở nhiệt độ 4
o
C và thời gian chiết là 3 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ
6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.
Xác định hàm lượng protein, hoạt độ tổng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR)
của từng DC. So sánh, chọn ra tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) thích hợp.
 Khảo sát dung môi chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong E.denticulatum trên 3 hệ dung môi: nước cất,
phosphate (PBS 0,05M 0,85% NaCl) và ethanol 30% với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi
14
(w/v) thích hợp đã khảo sát ở trên, nhiệt độ chiết 4
o
C và thời gian chiết 3 giờ. Sau đó,
ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.
Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng DC. So sánh, chọn ra
loại dung môi chiết thích hợp.
 Khảo sát nồng độ dung môi chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong E.denticulatum với hệ dung môi thích hợp đã
được xác định ở trên với các nồng độ khác nhau, với tỷ lệ nguyên liệu : dung môi
(w/v) thích hợp, nhiệt độ chiết 4
o
C và thời gian chiết 3 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ
6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.

4
)
2
SO
4
ở nhiệt độ tủa 4
o
C, thời gian tủa 4 giờ.
Hệ tác nhân tủa khảo sát gồm:
15
- Tủa bằng ethanol được làm lạnh, với các tỷ lệ DC : ethanol (v/v): 1:1, 1:2,
1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7.
- Tủa bằng muối (NH
4
)
2
SO
4
, nồng độ tủa theo % bão hòa (NH
4
)
2
SO
4
: 60, 65,
70, 75, 80, 85 và 90%.
- Tủa bằng acetone được làm lạnh, với các tỷ lệ DC : acetone (v/v): 1:1, 1:2,
1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7.
Chế phẩm kỹ thuật (CPKT) được thu nhận bằng cách ly tâm dịch sau tủa ở 4
o

5
2
Nghiên điều kiện tối ưu để thu nhân
lectin
12/2012 –
2/2013
- nt- 10
3
Tinh sạch và xác định tính chất của
lectin bao gồm đặc tính liên kết
carbohydrate của lectin và ảnh
hưởng của pH, nhiệt độ và cation
hóa trị hai đến hoạt tính của lectin.
2/2013 –
4/2013
- nt- 25
4
Đánh gía khả năng của lectin kháng
một số vi khuẩn gây hại cho người
4/2013-
5/2013
5
5 Xử lý số liệu và viết báo cáo
5/2013-
6/2013
- nt-
6 Bảo vệ
3 Địa điểm thực hiện:
Viện Nghiên Cứu Công và Ứng dụng Công nghệ Nha trang.
Phòng Công nghệ sinh học biển.

chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước
nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực
dương của điện trường. Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường
so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng
phân tử khác nhau đã biết.
 Đổ gel
 Gel phân tách 12,5% (Separating gel)
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch:
Acrylamide/Bis (15,5:1) 3,8 mL
19
Tris – HCl 3M; pH 8.8; 0,8 % SDS 5 mL
Glycerine 2 g
Nước cất 4,2 mL
APS 10% 50 µL
TEMED 5 µL
Sau khi cho TEMED vào, khuấy nhẹ, tiến hành đổ gel (tránh tạo bọt khí). Sau
đó nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp mặt gel để mặt gel được phẳng. Chờ
gel đông (khoảng 2 giờ).
 Gel cônông độ (Stacking gel)
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch khác:
Acrylamide/Bis (15,5:1) 1 mL
Tris – HCl 3M; pH 6,8; 0,8 % SDS 3,1 mL
Nước cất 8,4 mL
APS 10% 100 µL
TEMED 10 µL
Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đỗ hết nước bên trên. Tiến
hành đỗ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn.
Đồng thời đưa lược vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn
gel). Sau khi gel trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung
dịch điện di vào buồng điện di.

• L-fucose
• D-xylose
• D-glucosamine
• D-gluconic acid
• p-nitrophenyl-D-galactoside
• p-nitrophenyl-D-glucoside
• p-nitrophenyl-D-mannoside
• Transferrin
• Fetuin
• Yeast mannan
• Porcine thyroglobulin
• Asialo-porcine thyroglobulin
• Bovine thyroglobulin
• Asialo-bovine thyroglobulin
• Bovine submaxillary mucin
• Asialo-bovine submaxillary mucin
• Porcine stomach mucin
 Tiến hành
- Sử dụng đĩa 96 giếng đáy chữ V. Cho 25µL NaCl 0,85% vào các giếng.
- Cho 25µL dung dịch đường hoặc glycoprotein vào giếng số 1 và số 2, rồi pha
loãng 2 lần theo từng hàng bắt đầu từ giếng số 2.
- Cho 25µL dung dịch lectin vào mỗi giếng. Lắc nhẹ và giữ ở nhiệt độ phòng
trong 1 giờ.
- Sau 1 giờ, cho 25µL huyền phù hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin vào mỗi giếng.
Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, đọc kết quả.
 Đọc kết quả
- Nếu hoạt độ NKHC của lectin không thay đổi: lectin không có khả năng liên
kết với đường hoặc glycoprotein được kiểm tra.
Khoảng cách từ gel phân tách đến dung môi (vạch màu Brommophenol)
blue

0
C. Sau 24 giờ, kiểm tra sự tạo thành vòng vô khuẩn, đo đường kính
vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tùy thuộc vào đường kính vòng vô
khuẩn lớn hay nhỏ.
 Vi khuẩn thí nghiệm
Các vi khuẩn dùng trong thí nghiệm khảo sát hoạt độ kháng khuẩn của lectin từ
rong E.denticulatum
Kí hiệu Vi khuẩn
T1 Staphylococcus hominis
T2 Bacillus cereus
T3 Pseudomonas aeruginosa
22
T4 Enterobacter aerogenes
T5 Enterobacter cloacae
T6 Proteus mirabilis
T7 Klebsiella pneumoniae
T8 Clostridium perfringens
T9 Serratia liquefaciens
T10 Acinetobacter baumannii
T11 Vibrio parahaemolyticus
T12 Vibrio harveyi
5. Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu [28]
Hồng cầu được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt độ NKHC của
lectin là hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin.
 Tiến hành:
- Cho 25µL NaCl 0,85% vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V.
- Thêm 25µL mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ ngưng kết hồng cầu vào
giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha là
1/2
n

tổng
: tổng hàm lượng protein.
6. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm
1951 [5], dùng Albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất
chuẩn.
 Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở protein có khả năng phản ứng với
thuốc thử Folin tạo phức chất có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng
độ protein trong một phạm vi nhất định. Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang
điện ở bước sóng 750nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được
hàm lượng protein ở nồng độ vài chục micro gram (µg).
 Hóa chất
Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na
2
CO
3
(2%) pha trong 1000mL nước
cất.
Dung dịch B: 0,5g CuSO
4
.5H
2
O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1%)
hoặc trong dung dịch Natri-Kali Tactrat 1%.
Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước khi sử
dụng).
Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng.
Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1mg/mL.
 Các bước tiến hành

from the red alga Kappaphycus striatum (Carrageenophyte). Phytochemistry 72: 855-
861.
7. Kawakubo A, Makino H, Ohnishi J, Hirohara H, Hori K (1997) The marine red
alga Eucheuma serra J. Agardh, a high yielding source of two isolectins. J Appl
Phycol 9: 331-338
8. Li Y, Cleveland B, Klots I, Travis B, Richardson BA, Anderson D, Montefiori D,
Polacino P, Hu S (2008). Removal of a single N-linked glycan in human
immunodeficiency virus type 1 gp120 results in an enhanced ability to induce
neutralizing antibody responses. J Virol 82: 638–651.
9. Miyoshi E, Nakano M (2008) Fucosylated haptoglobin in a novel marker for
pancreatic cancer: Detailed analysis of oligosaccharide structures. Proteomics 8:
3257-3262.
25
10. Mori T, O’Keefe BR, Sowder RC II, Bringans S, Gardella RS, Berg S, Cochran P,
Turpin JA, Buckheit RWJr, McMahon JB, Boyd MR (2005) Isolation and
characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga
Griffithsia sp. J Biol Chem 280:9345-9353.
11. Pinto VPT, Debray H, Dus D, Teixeira EH, Oliveira TM, Carneiro VA, Teixeira
AH, Filho GC, Nagano CS, Nascimento KS, Sampaio AH, Cavada BH (2009) Lectins
from the red marine algal species Bryothamnion seaforthii and Bryothamnion
triquetrum as tools to differentiate human colon carcinoma cells. Advances in
Pharmacological Sciences. Doi:10.1155/2009/862162.
12. Okuyama S, Nakamura-Tsurura S, Tateno H, Hirabayashi J, Matsubara K, Hori K
(2009). Strict binding specificity of small-sized lectins from the red alga Hypnea
japonica for core (alpha1-6) fucosylated N-glycans. Biosci Biotechnol Biochem 73:
912-920.
13. Ritchie G, Harvey DJ, Feldmann F, Stroeher U, Feldmann H, Royle L, Dwek LA,
Rudd PM (2010). Identification of N-linked carbohydrates from severe acute
respiratory syndrome (SARS) spike glycoprotein. Virology 399: 257- 269.
14. Sato Y, Morimoto K, Hirayama M, Hori K (2011a). High mannose-specific lectin