BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN CAO SƠN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ
DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN CAO SƠN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ
DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ


Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, Phó hiệu trưởng Trường Đại học Dược Hà
Nội, Trưởng bộ môn Hóa Phân tích - Độc chất và TS. Lê Thị Hồng Hảo, Phó
Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, là hai
người thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ và cho tôi những kiến
thức quý báu để tôi hoàn thành luận án.
Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia học tập và hoàn thành luận án đúng thời
gian quy định.
Các thầy, cô Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất và Phòng Sau đại học, Trường
Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại
Trường.
PGS. Phạm Gia Huệ nguyên Trưởng Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất,
Trường Đại học Dược Hà Nội là người thầy đã đóng góp ý kiến, chỉ dẫn tôi
hoàn thành luận án.
Các anh chị em tại Khoa Độc học dị nguyên và các đồng nghiệp ở Viện Kiểm
nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã động viên, giúp đỡ và chia sẽ với
những khó khăn trong công việc.
Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên
tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án.
Tác giả luận án
Trần Cao Sơn
iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU viii

2.2.3. Thiết bị, dụng cụ 56
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 57
2.3.1. Phương pháp khảo sát thực địa và lấy mẫu 57
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu 58
2.3.3. Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ 58
2.3.4. Phương pháp thẩm định 59
2.3.5. Phân tích mẫu thực 62
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 62
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 63
3.1. KHẢO SÁT TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
TRONG TRỒNG CÂY THUỐC 63

3.1.1. Nguồn cung hóa chất bảo vệ thực vật 63
3.1.2. Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trong trồng cây thuốc tại Hà Nội và một số
vùng lân cận 70

3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI HÓA CHẤT BẢO
VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU 75

3.2.1. Xây dựng các điều kiện sắc ký khối phổ 75
3.2.2. Xây dựng quy trình chiết hóa chất bảo vệ thực vật từ một số dược liệu và sản
phẩm dược liệu 85

3.2.3. Thẩm định các phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong một số
dược liệu và sản phẩm dược liệu 100

3.3. DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 115

3.3.1. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi 116


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
TT Chữ viết tắt Giải thích
1 AOAC
Hiệp hội các cộng đồng phân tích (Association of analytical
communities)
2 APCI
Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical
ionization)
3 APPI
Ion hóa quang học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure photo
ionization)
4 BVTV Bảo vệ thực vật
5 ChE Cholinestase
6 D-SPE Chiết phân tán pha rắn (Dispersive solid phase extraction)
7 ECD Detector bắt điện tử (Electron capture detector)
8 EI Va chạm điện tử (Electron impact)
9 EPA Cục Bảo vệ môi trường Mỹ (Environmental protection agency)
10 ESI Ion hóa phun điện tử (Electrospray ionization)
11 FAO
Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực (Food and agriculture
organization)
12 FDA
Cục dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (Food and drug
administration)
13 FL Huỳnh quang (Fluorescence)
14 GACP
Thực hành tốt trồng và thu hái dược liệu (Good agriculture and
collection practice)
15 GAP Thực hành tốt nông nghiệp (Good agriculture practice)

37 MS Khối phổ (Mass spectrometry)
38 MSPD Phân tán pha rắn mẫu thử (Matrix solid phase dispersion)
39 NCI Ion hóa hóa học âm (Negative chemical ionization)
40 NPD Detector nitơ phosphor (Nitrogen phosphorus detector)
41 PCI Ion hóa hóa học dương (Positive chemical ionization)
42 PDA Chuỗi diod quang (Photo-diod array)
43 PSA Các amin bậc 1 và bậc 2 (Primary secondary amines)
44 PS-DVB Polystyren divinylbenzen
45 SE Chiết dung môi (Solvent extraction)
46 SFE Chiết siêu tới hạn (Supercritical-fluid extraction)
47 SPE Chiết pha rắn (Solid phase extraction)
48 SPME Vi chiết pha rắn (Solid phase microextraction)
49 TPP Triphenyl phosphat
50 UV-VIS Tử ngoại khả kiến (Ultra violet – Visible)
51 WHO Tổ chức Y tế thế giới (World health organization)
52 WTO Tổ chức Thương mại thế giới (World trade organization)
viii

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Phân loại HCBVTV theo mối nguy 4
Bảng 1.2. Số lượng hoạt chất HCBVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng và cấm
sử dụng ở Việt Nam 14

Bảng 1.3. Quy định của Dược điển Việt Nam IV về giới hạn HCBVTV 17
Bảng 1.4. Giá trị MRL mặc định của một số nước 19
Bảng 1.5. Một số ứng dụng của phương pháp QuEChERS để phân tích HCBVTV
trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu 38

Bảng 1.6. Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV bằng GC-MS 44
Bảng 1.7. Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV bằng LC-MS 48

Bảng 3.20. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu dây thìa canh (n=6) 112
Bảng 3.21. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu trà xanh (n=6) 113
Bảng 3.22. Độ thu hồi của các HCBVTV trên một số nền mẫu thực 115
Bảng 3.23. Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu tươi 116
Bảng 3.24. Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu khô 117
Bảng 3.25. Tần suất phát hiện HCBVTV trong các nhóm sản phẩm khác nhau 119
Bảng 3.26. Đánh giá hàm lượng HCBVTV trong TPCN theo nguồn gốc mẫu 120
Bảng 3.27. Kết quả phân tích HCBVTV trong trà xanh 120
Bảng 4.1. Danh mục HCBVTV được lựa chọn cho nghiên cứu phân tích 125
Bảng 4.2. Tóm tắt các bước chiết HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau bằng
phương pháp QuEChERS 128

Bảng 4.3. So sánh ảnh hưởng nền của phương pháp nghiên cứu với ảnh hưởng nền
theo phương pháp của Raski. 132

Bảng 4.4. Thời gian lưu và điều kiện MS của một số HCBVTV rửa giải gần nhau 134
Bảng 4.5. Đánh giá khả năng phân tích các HCBVTV bằng GC-MS/MS và LC-
MS/MS 136

Bảng 4.6. So sánh độ lặp lại và độ thu hồi với các nghiên cứu khác 140
x

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Các trạng thái vật lý theo nhiệt độ vào áp suất 26
Hình 1.2. Bộ dụng cụ chiết siêu tới hạn 26
Hình 1.3. Dụng cụ chiết pha rắn thông thường (a) và tự động (b) 28
Hình 1.4. Các loại nhóm silanol 29
Hình 1.5. Nguyên tắc của vi chiết sợi rỗng 35
Hình 1.6. Tóm tắt các bước chiết của ba phiên bản phương pháp QuEChERS 37
Hình 2.1. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và sắc ký khí khối phổ sử dụng trong nghiên

xi

Hình 3.21. Quy trình chiết HCBVTV trên nền TPCN 95
Hình 3.22. So sánh độ thu hồi của các HCBVTV khác nhau khi sử dụng các lượng
muối chì acetat khác nhau 96

Hình 3.23. Ảnh hưởng nền với mẫu dược liệu tươi (bồ công anh) 97
Hình 3.24. Ảnh hưởng nền với mẫu TPCN (trà mướp đắng) 98
Hình 3.25. So sánh ảnh hưởng nền của hai kỹ thuật định lượng: không sử dụng nội
chuẩn và có sử dụng nội chuẩn (TPP). 98

Hình 3.26. Ảnh hưởng nền với mẫu chè (có sử dụng nội chuẩn) 99
Hình 3.27. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn của atrazin và
dimethoat theo LC-MS/MS 101

Hình 3.28. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của cypermethrin (4
đồng phân) và permethrin (2 đồng phân) theo GC-MS/MS 102

Hình 3.29. Đường chuẩn phân tích HCBVTV trên một số nền mẫu 106
Hình 3.30. Một số sắc đồ xác định LOD, LOQ thông qua xác định S/N 109
Hình 4.1. Sự phân mảnh của carbendazim 133
Hình 4.2. Sắc ký đồ của hai chất có thời gian lưu gần nhau (trichlorfon và dimethoat)135

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nông nghiệp, có nhiều mối nguy làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và
chất lượng nông sản như sâu bệnh, cỏ dại, chuột, mối mọt, nấm… Dược liệu là một
loại sản phẩm nông nghiệp đặc biệt, do đó cũng có nguy cơ mắc phải các dịch bệnh
nói trên. Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đóng vai trò quan trọng để phòng và

pháp chuẩn để áp dụng phân tích HCBVTV trong rau quả. Sau đó, QuEChERS đã
được nhiều tác giả nghiên cứu và mở rộng áp dụng trên nhiều chỉ tiêu của nhiều đối
tượng khác nhau, trong đó phân tích HCBVTV trong dược liệu là một hướng rất mới
và có triển vọng.
Hiện nay, theo quy định của Dược điển các nước, phương pháp chiết truyền
thống với kỹ thuật chiết bằng dung môi sau đó làm sạch bằng SPE hoặc GPC vẫn là
phương pháp được sử dụng để chiết HCBVTV trong dược liệu. Phương pháp này có
một số hạn chế như khả năng ứng dụng hạn chế trên một nhóm HCBVTV nhất định,
sử dụng lượng dung môi hữu cơ rất lớn và trải qua rất nhiều bước nên chi phí rất tốn
kém.
Với những thực tế như vậy, đề tài “Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo
vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ”
được thực hiện với các mục tiêu như sau:
1. Xác định các HCBVTV thường được dùng tại một số vùng trồng dược liệu ở
phía Bắc.
2. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV trong
dược liệu và một số sản phẩm từ dược liệu.
3. Sơ bộ đánh giá dư lượng HCBVTV trong một số dược liệu và sản phẩm từ
dược liệu.
3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
1.1.1. Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật
Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được chuyển nghĩa từ thuật ngữ tiếng Anh
“pesticide” có nghĩa là thuốc trừ côn trùng gây hại. Tuy nhiên, hiện nay khái niệm này
được mở rộng cho nhiều loại hóa chất được sử dụng trong trồng trọt bao gồm cả thuốc
điều hòa sinh trưởng, thuốc làm rụng lá, thuốc trừ cỏ… [7][108].
Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp Quốc (FAO) đã đưa ra định
nghĩa về HCBVTV như sau: “HCBVTV là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với

LD
50
trên chuột (mg/kg cân nặng)
Đường uống Đường ngoài da
Ia Cực độc < 5 < 50
Ib Độc tính cao 5-50 50-200
II Độc trung bình 50-2000 200-2000
III Độc nhẹ > 2000
U Không có mối nguy độc cấp > 5000

1.1.2.2. Phân loại theo công dụng
Dựa vào công dụng của HCBVTV, người ta có thể phân loại như sau [7]:
 Hóa chất diệt trừ sinh vật gây hại: được gọi theo nhóm sinh vật gây hại như:
- Hóa chất trừ sâu (insecticides)
- Hóa chất trừ nấm (fungicides)
- Hóa chất trừ cỏ (herbicides)
- Hóa chất trừ chuột (rodenticides)
- Hóa chất trừ ốc sên (molluscicides)
- Hóa chất trừ nhện (acaricides)
- Hóa chất trừ vi khuẩn (bactericides)…
 Hóa chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR – plant growth regulators) là các hóa
chất sử dụng để kích thích, làm chậm hoặc ức chế sự phát triển của thực vật.
 Hóa chất dùng trong bảo quản, xử lý hay chế biến sau thu hái.
Trên cơ sở cách phân loại này, Alan Wood đã giới thiệu một trang điện tử trực
tuyến giới thiệu bộ sưu tập đầy đủ các loại HCBVTV được sử dụng [134].
1.1.2.3. Phân loại theo cấu tạo hóa học
Đây là cách phân loại được sử dụng phổ biến trong việc triển khai xây dựng các
phương pháp phân tích, vì các HCBVTV có cấu tạo tương tự thường có tính chất
giống nhau do đó phương pháp chiết và phân tích cũng giống nhau. Hơn nữa, từng
nhóm HCBVTV tác động đến sinh vật và con người theo các nguyên lý tương tự nhau.

Lindan (-HCH)
Endrin Endosulfan sulfat
Các HCBVTV nhóm clor hữu cơ nói chung có phổ tác dụng rộng, rất an toàn
với cây trồng ở liều thông dụng nhưng lại độc với các loài động vật máu nóng. Các
chất này có thể tích lũy trong cơ thể sinh vật gây độc mạn tính, chúng cũng rất bền
trong môi trường, hiệu lực tồn dư lâu dài [23][68].

6

Cơ chế gây độc của HCBVTV nhóm clor hữu cơ phụ thuộc vào dạng cấu tạo
của chúng. DDT và các HCBVTV có cấu trúc tương tự DDT là những chất rất độc trên
hệ thần kinh. Chúng có tác dụng trên thần kinh ngoại biên thông qua ức chế các kênh
vận chuyển Na
+
qua màng tế bào thần kinh dẫn đến tê liệt và có thể dẫn đến tử vong.
Còn một số loại HCBVTV có cấu trúc dị vòng hoặc vòng chứa nhiều clor như aldrin,
dieldrin, heptachlor, endrin… tác động thông qua việc gắn với các vùng pícrotoxinin
của acid γ-aminobutyric dẫn đến ức chế ion Cl
-
vào trong tế bào thần kinh. Hậu quả là
gây nên trạng thái kích thích thần kinh [27][44][60][71].
Mặc dù các HCBVTV clor hữu cơ có tác dụng diệt trừ mạnh đối với nhiều loại
sâu hại nhưng do vấn đề ô nhiễm môi trường và dư lượng HCBVTV trong nông sản,
sự tích lũy và tính độc cao đối con người và các loài động vật, mà ngày nay đa số các
HCBVTV clor hữu cơ đã bị cấm sử dụng.
1.1.3.2. Nhóm phosphor hữu cơ (organophosphorus)
HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ chủ yếu là các hợp chất của phospho hóa trị
5, chúng là các ester hoặc amid của acid phosphoric hoặc dẫn xuất của acid
phosphoric. Công thức cấu tạo chung của các hợp chất phosphor hữu cơ như sau [23]:
R

P
OCH
3
O
CH
3
O
Trichlorfon

7


 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothionat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothiolat
Profenofos
 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothionothiolat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorodithiolat
Edifenphos
 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphoroamidat

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphoroamidothionat

8

 Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphoroamidothiolat

Các HCBVTV nhóm phosphor hữu cơ có đặc điểm chung là phổ tác dụng rộng,
an toàn với cây trồng, diệt được nhiều sâu hại, tác dụng diệt côn trùng nhanh, có độc

Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm pyrethroid. Deltamethrin

α-Cypermethrin
Cyfluthrin

Permethrin
Ngày nay, các hợp chất nhóm pyrethroid thường được sử dụng phối hợp với
một số HCBVTV nhóm khác nhằm tăng tác dụng BVTV. Ngoài việc được sử dụng
làm HCBVTV trong nông nghiệp, các chất nhóm pyrethroid còn được sử dụng nhiều
để làm các thuốc diệt côn trùng (ruồi, muỗi, gián…) trong nhà [108].
Các chất nhóm pyrethroid là các chất độc đối với dẫn truyền thần kinh do tác
dụng luôn giữ kênh Na
+
mở trong màng tế bào thần kinh gây ảnh hưởng đến sự dẫn
truyền các xung thần kinh làm mất cảm giác, tê liệt, ở liều cao có thể gây tử vong. Khi
tiếp xúc trong thời gian dài có thể gây ngộ độc gan. Các chất này thường ít độc qua
đường tiếp xúc và qua hô hấp. Liều độc của các chất nhóm pyrethroid cũng thấp hơn
nhiều loại HCBVTV khác [44][55][60][68][71].
1.1.3.4. Nhóm carbamat
HCBVTV nhóm carbamat là các ester của acid carbamic (H
2
N-COOH) và dẫn
xuất của acid carbamic. Đại diện cho nhóm này như: aldicarb, carbofuran, carbaryl,
fenobucarb, isoprocarb… Ngày nay, các hợp chất carbamat được sử dụng rất phổ biến
và được phối hợp với các HCBVTV khác để tăng cường phổ tác dụng [23][108][130].
Các HCBVTV nhóm carbamat có đặc điểm chung là phổ tác dụng hẹp, hiệu lực
thuốc ngắn, ít tan trong nước, tan nhiều dung môi hữu cơ, bị kiềm phân hủy. Không

ong mật. Nguyên nhân là do các chất này phá huỷ hệ thống miễn dịch tự nhiên của ong
mật nhạy cảm với nhiều trường hợp nhiễm trùng gây chết [52]. Hiện nay, ở Việt Nam
các chất này vẫn được phép sử dụng làm HCBVTV trong nông nghiệp [2].
Một số HCBVTV nhóm neonicotinoid có công thức cấu tạo như sau:

Imidacloprid

Acetamiprid

Thiamethoxam

Dinotefuran

Clothianidin
11

Nhóm HCBVTV này có độc tính thấp hơn các nhóm clor hữu cơ, phosphor hữu
cơ và carbamat. Tuy nhiên, một số sản phẩm chuyển hoá của nhóm này lại cho thấy có
độc tính cao đối với chim và cá. Cơ chế gây độc là do các sản phẩm này này gắn với
các receptor của acetylcholin, gây độc thần kinh trung ương. Đường tiếp xúc qua da có
độc tính thấp, có thể gây đỏ và ngứa mắt nhẹ. Chưa có các bằng chứng về gây ngộ độc
cấp tính trên người. Các nghiên cứu cũng cho thấy các chất này phân hủy nhanh trong
đường tiêu hóa và loại trừ qua phân, nước tiểu trong vòng 48 giờ [52][60][71].
1.1.3.6. Nhóm macrocyclic lacton
Các hợp chất nhóm macrocyclic lacton là các sản phẩm được lên men tự nhiên
từ các loài vi khuẩn Streptomyces giống nấm. Một số hợp chất đại diện của nhóm này
gồm abamectin, ivermectin, emamectin, spinosad…có công thức cấu tạo như sau
[108][130][134]:
Abamectin (B
1a


Azoxystrobin
(Nhóm strobin) Carboxin
(Nhóm carboxamid) Tebuconazol
(Nhóm azol)
Ngoài ra, có thể kể đến một số HCBVTV thuộc các nhóm khác như nhóm thuốc
có nguồn gốc thực vật (allicin, nicotin, pyrethrin, rotenone…), diamid
(chlorantraniliprole, cyantraniliprole) và nhiều HCBVTV không được phân loại vào
một nhóm cụ thể nào [134].