BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN CAO SƠN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ
DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN CAO SƠN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG
HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ
DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

kiến thức quý báu để tôi hoàn thành luận án.
Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi tham gia học tập và hoàn thành luận án đúng thời
gian quy định.
Các Thầy, Cô Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất và Phòng Sau đại học, Trường
Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại
Trường.
PGS. Phạm Gia Huệ nguyên Trưởng Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất,
Trường Đại học Dược Hà Nội là người thầy đã đóng góp ý kiến, chỉ dẫn tôi
hoàn thành luận án.
Các anh chị em tại Khoa Độc học dị nguyên và các đồng nghiệp ở Viện Kiểm
nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã động viên, giúp đỡ và chia sẽ với
những khó khăn trong công việc.
Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên
tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án.
Tác giả luận án
Trần Cao Sơn
ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iii
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ............................................................................ viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ....................................................................... x
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1. HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT ...................................................................... 3

2.3.3. Phương pháp xử lý mẫu ................................................................................... 60
2.3.4. Phương pháp phân tích bằng sắc ký khối phổ ................................................... 60
2.3.5. Phương pháp thẩm định ................................................................................... 61
2.3.6. Phương pháp phân tích mẫu thực ..................................................................... 64
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 64
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 65
3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI HÓA CHẤT BẢO
VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU............. 65
3.1.1. Khảo sát lựa chọn hóa chất bảo vệ thực vật được sử dụng trong dược liệu ....... 65
3.1.2. Khảo sát các điều kiện phân tích HCBVTV bằng sắc ký khối phổ.................... 76
3.1.3. Xây dựng quy trình chiết HCBVTV từ dược liệu và sản phẩm dược liệu ......... 85
3.1.4. Thẩm định các phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong một số
dược liệu và sản phẩm dược liệu .............................................................................. 100
3.2. DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾN TỪ DƯỢC LIỆU ....................................................... 115
3.2.1. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu tươi ................................. 115
3.2.2. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô.................................. 116
3.2.3. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong thực phẩm chức năng có thành phần
thảo dược ................................................................................................................. 117
3.2.3. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong trà xanh .......................................... 120
Chương 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 122

iv


4.1. VỀ VIỆC XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI HÓA CHẤT
BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU . 122
4.1.1. Về khảo sát hoá chất bảo vệ thực vật được sử dụng trong dược liệu ............... 122
4.1.2. Lựa chọn đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu .............................................. 124
4.1.3. Về phương pháp xử lý mẫu ............................................................................ 126

Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical
ionization)

3

APPI

Ion hóa quang học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure photo
ionization)

4

BVTV

Bảo vệ thực vật

5

ChE

Cholinestase

6

D-SPE

Chiết phân tán pha rắn (Dispersive solid phase extraction)

7



FDA

Cục dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (Food and drug
administration)

13

FL

Huỳnh quang (Fluorescence)

14

GACP

Thực hành tốt trồng và thu hái dược liệu (Good agriculture and
collection practice)

15

GAP

Thực hành tốt nông nghiệp (Good agriculture practice)

16

GC

Sắc ký khí (Gas chromatography)

Hóa chất bảo vệ thực vật

22

HLB

Cân bằng thân nước, thân dầu (Hydrophilic lipophilic balance)

23

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

vi


TT Chữ viết tắt

Giải thích

24

IAC

Sắc ký ái lực miễn dịch (Immunoaffinity chromatography)

25

IS

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantification)

31

LD50

Liều chết trung bình (Median lethal dose)

32

LPME

Vi chiết pha lỏng (Liquid phase microextraction)

33

MAE

Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction)

34

MRL

Giới hạn dư lượng tối đa (Maximum residue limit)

35


NPD

Detector nitơ phosphor (Nitrogen phosphorus detector)

41

PCI

Ion hóa hóa học dương (Positive chemical ionization)

42

PDA

Chuỗi diod quang (Photo-diod array)

43

PSA

Các amin bậc 1 và bậc 2 (Primary secondary amines)

44

PS-DVB

Polystyren divinylbenzen

45


UV-VIS

Tử ngoại khả kiến (Ultra violet – Visible)

51

WHO

Tổ chức Y tế thế giới (World health organization)

52

WTO

Tổ chức Thương mại thế giới (World trade organization)

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Phân loại HCBVTV theo mối nguy.............................................................. 4
Bảng 1.2. Số lượng hoạt chất HCBVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng và cấm
sử dụng ở Việt Nam ................................................................................................... 14
Bảng 1.3. Quy định của Dược điển Việt Nam IV về giới hạn HCBVTV .................... 17
Bảng 1.4. Giá trị MRL mặc định của một số nước ..................................................... 19
Bảng 1.5. Một số ứng dụng của phương pháp QuEChERS để phân tích HCBVTV
trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu .................................................................. 38
Bảng 1.6. Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV bằng GC-MS .................. 44
Bảng 1.7. Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV bằng LC-MS................... 48
Bảng 2.1. Một số HCBVTV được nghiên cứu trong luận án [113][129] .................... 50

Bảng 3.21. Độ lặp lại và độ thu hồi trên nền mẫu trà xanh (n=6).............................. 112
Bảng 3.22. Độ thu hồi của các HCBVTV trên một số nền mẫu thực ........................ 114
Bảng 3.23. Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu tươi .................................. 115
Bảng 3.24. Kết quả phân tích HCBVTV trong dược liệu khô................................... 116
Bảng 3.25. Tần suất phát hiện HCBVTV trong các nhóm sản phẩm khác nhau........ 118
Bảng 3.26. Đánh giá hàm lượng HCBVTV trong TPCN theo nguồn gốc mẫu ......... 119
Bảng 3.27. Kết quả phân tích HCBVTV trong trà xanh ........................................... 120
Bảng 4.1. Danh mục HCBVTV được lựa chọn cho nghiên cứu phân tích ................ 125
Bảng 4.2. Tóm tắt các bước chiết HCBVTV trong các nền mẫu khác nhau bằng
phương pháp QuEChERS ........................................................................................ 128
Bảng 4.3. So sánh ảnh hưởng nền của phương pháp nghiên cứu với ảnh hưởng nền
theo phương pháp của Raski. ................................................................................... 132
Bảng 4.4. Thời gian lưu và điều kiện MS/MS của một số HCBVTV rửa giải gần nhau134
Bảng 4.5. Đánh giá khả năng phân tích các HCBVTV bằng GC-MS/MS và LCMS/MS .................................................................................................................... 136
Bảng 4.6. So sánh độ lặp lại và độ thu hồi với các nghiên cứu khác ......................... 140
Bảng 4.7. Kết quả thử nghiệm liên phòng phân tích HCBVTV ................................ 141

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Các trạng thái vật lý theo nhiệt độ vào áp suất ............................................ 26
Hình 1.2. Bộ dụng cụ chiết siêu tới hạn ..................................................................... 26
Hình 1.3. Dụng cụ chiết pha rắn thông thường (a) và tự động (b)............................... 28
Hình 1.4. Các loại nhóm silanol ................................................................................. 29
Hình 1.5. Nguyên tắc của vi chiết sợi rỗng................................................................. 35
Hình 1.6. Tóm tắt các bước chiết của ba phiên bản phương pháp QuEChERS ........... 37
Hình 2.1. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ và sắc ký khí khối phổ sử dụng trong nghiên
cứu ............................................................................................................................ 58
Hình 3.1. Hiểu biết về HCBVTV của nhân viên kinh doanh ...................................... 65

Hình 3.25. So sánh ảnh hưởng nền của hai kỹ thuật định lượng: không sử dụng nội
chuẩn và có sử dụng nội chuẩn (TPP). ....................................................................... 99
Hình 3.26. Ảnh hưởng nền với mẫu chè (có sử dụng nội chuẩn) ................................ 99
Hình 3.27. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn của atrazin và
dimethoat theo LC-MS/MS...................................................................................... 100
Hình 3.28. Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn của cypermethrin (4
đồng phân) và permethrin (2 đồng phân) theo GC-MS/MS ...................................... 101
Hình 3.29. Đường chuẩn phân tích HCBVTV trên một số nền mẫu ......................... 105
Hình 3.30. Một số sắc đồ xác định LOD, LOQ thông qua xác định S/N ................... 108
Hình 4.1. Sự phân mảnh của carbendazim ............................................................... 133
Hình 4.2. Sắc ký đồ của hai chất có thời gian lưu gần nhau (trichlorfon và dimethoat)135

xi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nông nghiệp, có nhiều mối nguy làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và
chất lượng nông sản như sâu bệnh, cỏ dại, chuột, mối mọt, nấm… Dược liệu là một
loại sản phẩm nông nghiệp đặc biệt, do đó cũng có nguy cơ mắc phải các dịch bệnh
nói trên. Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) đóng vai trò quan trọng để phòng và
loại trừ các loại dịch bệnh cho các sản phẩm nông nghiệp nói chung và dược liệu nói
riêng. Hiện nay, khi trồng hầu hết các loại dược liệu cần phải sử dụng HCBVTV nhằm
tăng năng suất và chất lượng dược liệu.
Khi được sử dụng, HCBVTV có thể tồn dư trong sản phẩm. Nếu HCBVTV
được dùng đúng theo quy định, mức tồn dư này là an toàn cho người sử dụng. Theo
quy định, mỗi loại HCBVTV đều có giá trị giới hạn dư lượng tối đa (MRL). Tuy
nhiên, việc lạm dụng hoặc sử dụng không đúng cách các loại HCBVTV dẫn đến tồn
dư HCBVTV trong sản phẩm tăng lên vượt quá MRL. Khi đó, HCBVTV sẽ gây ra các
tác dụng không mong muốn cho người sử dụng.
Việc xác định mức dư lượng HCBVTV trong dược liệu và các sản phẩm từ

kém.
Với những thực tế như vậy, đề tài “Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo
vệ thực vật trong một số dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ”
được thực hiện với các mục tiêu như sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV trong
dược liệu và sản phẩm từ dược liệu.
2. Sơ bộ đánh giá dư lượng HCBVTV trong một số dược liệu và sản phẩm chế
biến từ dược liệu.

2


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT
1.1.1. Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật
Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được chuyển nghĩa từ thuật ngữ tiếng Anh
“pesticide” có nghĩa là thuốc trừ côn trùng gây hại. Tuy nhiên, hiện nay khái niệm này
được mở rộng cho nhiều loại hóa chất được sử dụng trong trồng trọt bao gồm cả thuốc
điều hòa sinh trưởng, thuốc làm rụng lá, thuốc trừ cỏ… [7][113].
Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp Quốc (FAO) đã đưa ra định
nghĩa về HCBVTV như sau: “HCBVTV là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với
mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ
trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn
của thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế
biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức
ăn chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện
hay các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng. HCBVTV còn được dùng làm
tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân
làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm. Cũng có thể dùng HCBVTV cho cây
trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trong quá

Không có mối nguy độc cấp

LD50 trên chuột (mg/kg cân nặng)
Đường uống
Đường ngoài da
2000
> 5000

1.1.2.2. Phân loại theo công dụng
Dựa vào công dụng của HCBVTV, người ta có thể phân loại như sau [7]:
Hóa chất diệt trừ sinh vật gây hại: được gọi theo nhóm sinh vật gây hại như:
- Hóa chất trừ sâu (insecticides)
- Hóa chất trừ nấm (fungicides)
- Hóa chất trừ cỏ (herbicides)
-

Hóa chất trừ chuột (rodenticides)
Hóa chất trừ ốc sên (molluscicides)
Hóa chất trừ nhện (acaricides)
Hóa chất trừ vi khuẩn (bactericides)…

Hóa chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGR – plant growth regulators) là các hóa
chất sử dụng để kích thích, làm chậm hoặc ức chế sự phát triển của thực vật.
Hóa chất dùng trong bảo quản, xử lý hay chế biến sau thu hái.

các nguyên tử clor. Trong phân tử các hợp chất này có thể tồn tại vòng benzen hoặc dị
vòng (chứa dị tố O, N, hay S). Các chất này thường là các dẫn xuất clor của một số
hợp chất hữu cơ như diphenyl ethan, cyclodien, benzen, hexan… [7][14][113]
Về mặt cấu tạo, HCBVTV nhóm clor hữu cơ được xếp vào 4 nhóm nhỏ [135]:
-

Nhóm diphenyl aliphatic: DDT, dicofon, methoxychlor…
Nhóm hợp chất benzen: lindan, hexaclorocyclohexan (HCH), pentaclorophenol…
Nhóm hợp chất cyclodien: endrin, dieldrin, heptachlor, aldrin, endosulfan sulfat…
Nhóm hợp chất polycloroterpen: toxaphen, polyclorocamphen…
Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm clor hữu cơ:

Aldrin

Methoxychlor

4,4-DDT

Lindan (γ-HCH)

Endrin
Endosulfan sulfat
Các HCBVTV nhóm clor hữu cơ nói chung có phổ tác dụng rộng, rất an toàn
với cây trồng ở liều thông dụng nhưng lại độc với các loài động vật máu nóng. Các
chất này có thể tích lũy trong cơ thể sinh vật gây độc mạn tính, chúng cũng rất bền
trong môi trường, hiệu lực tồn dư lâu dài [28][73].
5


Cơ chế gây độc của HCBVTV nhóm clor hữu cơ phụ thuộc vào dạng cấu tạo

Cl
Cl

O

C HC

O

CH3

O

CH3

P

Cl OH

Trichlorfon

6


Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothionat

Một số HCBVTV thuộc nhóm Phosphorothiolat

Profenofos


hoặc hạn chế sử dụng ở Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới.
1.1.3.3. Nhóm pyrethroid
HCBVTV nhóm pyrethroid là những chất hữu cơ có cấu trúc tương tự các
pyrethrin tự nhiên có mặt trong một số loại hoa cúc (Chrysanthemum
cinerariaefolium và Chrysanthemum coccineum) [28][113][135].
Có hai thế hệ HCBVTV nhóm pyrethroid đã được sử dụng [135]:
- Thế hệ thứ nhất được phát triển từ những năm 60 của thế kỷ XX (ví dụ như
tetramethrin, resmethrin, bioallethrin …) với mục tiêu thay thế các hợp chất nhóm clor
hữu cơ. Tuy nhiên, do đặc tính rất kém ổn định trong môi trường dưới tác dụng của
ánh sáng nên các HCBVTV này hiện không còn được sử dụng rộng rãi.
- Thế hệ thứ hai được phát triển từ giữa những năm 70 của thế kỷ XX (ví dụ như
permethrin gồm 2 đồng phân, cypermethrin gồm 4 đồng phân, deltamethrin,
cyfluthrin, λ-cyhalothrin…) có độ ổn định trong môi trường tốt hơn thế hệ thứ nhất do
8


đó được sử dụng nhiều trong nông nghiệp. Tuy nhiên, các chất thế hệ thứ hai có độc
tính cao với động vật có vú và con người.
Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV nhóm pyrethroid.

Deltamethrin

α-Cypermethrin

Permethrin

Cyfluthrin

Ngày nay, các hợp chất nhóm pyrethroid thường được sử dụng phối hợp với
một số HCBVTV nhóm khác nhằm tăng tác dụng BVTV. Ngoài việc được sử dụng

Carbofuran

Methomyl

Fenobucarb

Indoxacarb

1.1.3.5. Nhóm neonicotinoid
Neonicotinoid là nhóm HCBVTV gây kích thích thần kinh có cấu trúc tương tự
nicotin được sử dụng từ những năm 80 của thế kỷ XX. Đại diện cho nhóm này gồm
các chất như imidachloprid, acetamiprid, thiamethoxam, dinotefuran… [135][139].
Gần đây, một số nước hạn chế sử dụng những chất của nhóm này vì có nhiều
bằng chứng cho thấy nguy cơ gây hội chứng CDD (rối loạn sụt giảm bầy đàn) đối với
ong mật. Nguyên nhân là do các chất này phá huỷ hệ thống miễn dịch tự nhiên của ong
mật nhạy cảm với nhiều trường hợp nhiễm trùng gây chết [57]. Hiện nay, ở Việt Nam
các chất này vẫn được phép sử dụng làm HCBVTV trong nông nghiệp [2].
Một số HCBVTV nhóm neonicotinoid có công thức cấu tạo như sau:

Acetamiprid

Imidacloprid

Thiamethoxam

Dinotefuran
10

Clothianidin


[65][76].
1.1.3.7. Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật khác
Một số HCBVTV có cấu tạo khác biệt do đó không được xếp vào các nhóm
HCBVTV chính nêu trên. Dưới đây là công thức cấu tạo của một số HCBVTV thuộc
các nhóm nhỏ nhưng đang được sử dụng phổ biến [139].

Acetochlor
(Nhóm chloroacetanilid)

Atrazin
(Nhóm triazin)

Carboxin
(Nhóm carboxamid)

Carbendazim
(Nhóm benzimidazol)

Tebuconazol
(Nhóm azol)

Azoxystrobin
(Nhóm strobin)
Ngoài ra, có thể kể đến một số HCBVTV thuộc các nhóm khác như nhóm thuốc
có nguồn gốc thực vật (allicin, nicotin, pyrethrin, rotenone…), diamid
(chlorantraniliprole, cyantraniliprole) và nhiều HCBVTV không được phân loại vào
một nhóm cụ thể nào [139].
12