TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





ĐỀ CƯƠNG
THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
Nghiên cứu, chọn lọc cá thể F2 của một số tổ hợp lúa nếp
chứa gen kháng bệnh bạc lá, gen thơm, waxy
bằng chỉ thị phân tử DNA
Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS. Phan Hữu Tôn
Ths. Nguyễn Văn Hùng
Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng
Khoa Công nghệ sinh học - Trường
ĐHNN HN
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thanh Phong
Mã sinh viên : 540341
Lớp : CNSH A- K54
HÀ NỘI - 2013
ii
PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trên thế giới cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong 3 cây lương thực
quan trọng nhất không thể thiếu được trong đời sống hàng ngày của con
người. Lúa là loại cây phổ biến được gieo trồng ở tất cả các châu lục và
khoảng trên 100 nước, nhưng tập trung chủ yếu ở châu Á (chiếm 90 % về
diện tích).

lúa kháng bệnh bạc lá và những giống lúa mang một trong các gen này có
mức độ kháng cao, phổ kháng rộng.
Như vậy, việc đánh giá nguồn gen lúa nếp đặc biệt là gen thơm, gen
waxy, gen kháng bạc lá không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống
lúa đặc sản mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống lúa
chất lượng cao. Đặc biệt với công tác chọn tạo giống hiện nay, việc lai tạo
nhiều dòng bố mẹ có gen mục tiêu mong muốn để tạo con lai có sự phối trộn
nhiều gen hữu ích đã trở nên dễ dàng hơn. Các con lai thế hệ F2 luôn mang
các phẩm chất quý: kháng sâu bệnh, chống lốp đổ…ngày càng phổ biến.
Đồng thời, với sự phát triển của các kỹ thuật chỉ thị phân tử DNA đặc
biệt là kỹ thuật PCR thì việc tìm và phát hiện một đoạn DNA liên quan đến
một tính trạng nào đó trở nên đơn giản và chính xác. Có thể đánh giá ngay ở
giai đoạn cây non tiết kiệm được rất nhiều thời gian và công sức.
Xuất phát từ cơ sở trên, để chọn tạo các dòng giống lúa nếp chất lượng
cao, kháng bệnh bạc lá, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu, chọn lọc cá
thể F2 của một số tổ hợp lúa nếp chứa gen kháng bệnh bạc lá, gen thơm,
waxy bằng chỉ thị phân tử DNA”.
2
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
- Khảo sát các đặc điểm nông sinh học của tập đoàn giống lúa nếp
nghiên cứu.
- Khảo sát, đánh giá gen mùi thơm, gen waxy.
- Khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá và khả năng mang gen kháng
bạc lá Xa4, Xa5, Xa7 trong tập đoàn mẫu giống lúa nếp.
- Tuyển chọn một số mẫu giống triển vọng để khảo nghiệm và những
mẫu giống có phẩm chất tốt, khả năng kháng bạc lá và năng suất cao
1.2.2 Yêu cầu
- Sử dụng chỉ thị phân tử xác định gen chính quy định mùi thơm, gen
waxy và gen kháng bệnh bạc lá lúa Xa4, Xa5, Xa7 của các thế hệ F2 dòng/

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1 Thí nghiệm đồng ruộng
a. Bố trí thí ngiệm ngoài đồng ruộng
+ Thời vụ: Vụ xuân năm 2013
+ Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô 1 giống
+ Các tổ hợp được bố trí tuần tự không nhắc lại
+ Mỗi giống cấy 5 m
2
+ Hàng cách hàng 20 cm
+ Cây cách cây 11 cm, cấy 1 dảnh
+ Bón phân và chăm sóc như đại trà
b. Theo dõi một số chỉ tiêu nông sinh học
Tiến hành theo phương pháp của IRRI.
* Thời kì mạ
- Gieo riêng từng dòng, cắm thẻ ở mỗi dòng, che nilon chống rét và
chống chuột.
5
- Khi mạ được 3 lá thì bắt đầu đánh dấu số lá: lá thứ 3 đánh dấu một
chấm sơn trắng, lá thứ 5 đánh dấu 2 chấm, lá thứ 7 đánh dấu 3 chấm, theo
dõi đến khi ra lá đòng ghi số liệu số lá/ thân chính.
- Mỗi dòng đánh dấu 20 cây, chọn cấy 10 cây để theo dõi.
- Theo dõi khả năng đẻ nhánh của cây mạ ở mỗi dòng.
- Theo dõi màu sắc lá mạ ở mỗi dòng.
- Theo dõi tình hình nhiễm sâu bệnh trên ruộng mạ, ghi tên sâu hoặc
bệnh, cho điểm để đánh giá mức độ gây hại.
- Theo dõi khả năng chịu rét của cây mạ trên đồng ruộng.
- Đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây mạ thông qua chỉ
tiêu: chiều cao cây mạ, chiều rộng gân mạ.
* Thời kì lúa
 Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng

 Theo dõi sâu bệnh tự nhiên.
Hàng tuần đi quan sát, thấy dòng nào xuất hiện sâu bệnh gây hại, ghi tên
sâu, bệnh- mô tả mức độ sau 3 ngày quan sát lại nếu thấy mức độ tăng lên thì
phun thuốc phòng trừ - ghi loại thuốc, nồng độ - thời gian ngừng gây hại sau
phun - chỉ tiêu nào cho điểm thì ghi điểm.
 Đánh giá độ thuần và kiểu hình:
Khi lúa trỗ xong tiến hành đánh giá:
- Đếm số cây phân ly:
+ Thời gian trỗ sớm muộn,
+ Cao - thấp
+ Kiểu lá
+ Kiểu đẻ nhánh
+ Kiểu bông.v v
- Cho điểm kiểu hình theo IRRI
 Phân loại và tuyển chọn dòng tốt.
- Phân loại theo thời gian từ gieo đến trỗ.
< 60 ngày
61- 70 ngày
71- 80 ngày
81- 90 ngày
91- 100 ngày
101- 110 ngày
7
111- 120 ngày
> 120 ngày
- Phân loại theo chống chịu sâu bệnh : Nhẹ - trung bình- nặng.
- Phân loại theo độ thuần và kiểu hình.
Cuối cùng chọn ra khoảng 10-20 dòng tốt. Các dòng này được lấy mẫu để
theo dõi các chỉ tiêu.
 Theo dõi các dòng có triển vọng.

B: Số hạt chắc/ bông chính.
C: Khối lượng 1000 hạt.
D: Mật độ cấy (số khóm/m
2
).
Với mỗi giai đoạn quan sát, tiến hành lập bảng.
- Công thức tính giá trị trung bình:
X
=
n
Xi
- Công thức tính phương sai: S
2
=
1
)(
2
1
−
−
∑
=
n
XXi
n
i
- Hệ số biến động: CV(%) =
X
S
x100

của gạo sau khi xử lý (theo phương pháp của Little và cs). Đánh giá nhiệt hoá
hồ và độ phân huỷ theo thang điểm IRRI (1996).
*Phân tích hàm lượng amylase
Định lượng amylose theo phương pháp của H. Seko, 2003: hạt lúa
được bóc vỏ, xát trắng, nghiền nhỏ. Lấy 100 mg bột đã nghiền, bổ sung vào
1ml Ethanol 95%, 9 ml NaOH 1N. Đun sôi ở 100
o
C trong 10 phút và định
mức cho đủ 100 ml. Lấy 5 ml dung dịch hoà tan, cho thêm 1 ml CH
3
COOH
1M, 2 ml dung dịch iodine. Định mức cho đủ 100 ml, giữ ấm ở 30
o
C trong
thời gian 20 phút rồi đo OD ở bước sóng 620 nm trên máy đo quang phổ và
đọc giá trị. Đối chiếu bảng quy đổi tìm ra hàm lượng amylose. Phân nhóm
hàm lượng amylose theo tiêu chuẩn IRRI (1988).
e. Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo
* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
10
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae được nuôi cấy trên môi trường
Wakimoto.
Thành phần môi trường gồm:
+ Khoai tây: 300g
+ Đường saccarose: 15g
+ Pepton: 5g
+ Agar: 17g
+ Na
2
HPO

vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh bạc lá ( mỗi chủng vi khuẩn dùng một
kéo vô trùng) cắt lên đầu lá lúa một đoạn dài khoảng 2-5 cm và lây nhiễm vào
giai đoạn lúa làm đòng-trỗ, mỗi chủng một cây, trên một cây cắt toàn bộ các
lá xanh trên đó.
Trước khi lây nhiễm, tiến hành làm thí nghiệm để xác định khả năng
duy trì độc tính của các chủng vi khuẩn trong quá trình bảo quản bằng cách
lây thử trên dòng mẫn cảm IR24. Sau 5 ngày thấy đầu lá héo xanh và tái đi
chứng tỏ các chủng vi khuẩn này có độc tính có thể dùng để lây nhiễm được.
* Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
11
Sau khi lây nhiễm được 20 ngày tiến hành đo chiều dài vết bệnh theo
phương pháp do giáo sư Satoru Taura đề xuất.
Dựa vào chiều dài của vết bệnh để đánh giá tính kháng của các giống
như sau:
+ Chiều dài vết bệnh < 8cm: kháng bạc lá (R)
+ Chiều dài vết bệnh từ 8-12cm: nhiễm vừa (M)
+ Chiều dài vết bệnh >12cm: nhiễm nặng (S)
3.2.2.2 Thí nghiệm trong phòng
a. Chiết tách DNA
Quy trình chiết tách DNA tổng số theo Zheng và cs (1995) có cải tiến.
+ Bước 1: thu ngắt mẫu lá khoẻ dài khoảng 2 cm bỏ vào ống nghiệm có
dung tích 1.5 ml, đánh dấu tên giống rồi bỏ vào tủ lạnh.
+ Bước 2: các mẫu lá được cắt nhỏ 0.5 cm rồi bổ vào cối sứ sạch.
+ Bước 3: nhỏ 400 µl dung dịch chiết xuất DNA vào cối rồi lấy chày
nghiền nhỏ mẫu lá.
+ Bước 4: nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dung dịch chuyển sang màu
xanh đen chứng tỏ tế bào lá đã vỡ và diệp lục được giải phóng ra.
+ Bước 5: đổ thêm 400 µl dung dịch chiết xuất DNA vào và trộn lẫn rồi
chuyển dung dịch đó vào ống nghiệm đã đánh số.
+ Bước 6: đổ và ống nghiệm 400µl dung dịch hỗn hợp Phenol: chlorofom:

Tris-HCl 1M 10Mm 0.5ml
EDTA 0.5M 1Mm 0.1ml
H
2
O 49.9ml
b. Tiến hành nhân PCR
Quy trình phản ứng PCR: sau khi cho đủ các thành phần phản ứng và
DNA cần nhân vào ống PCR (các ống này được đánh số thứ tự theo các giống
lúa) sau đó cho vào trong máy nhân gen để chạy phản ứng PCR. Đặt chu kỳ
nhiệt cho phản ứng.
* Gen mùi thơm
- Sử dụng cặp mồi (theo Bradbury và cs., 2005)
ESP: 5’-TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG-3’
IFAP: 5’-CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC-3’
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen thơm
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 2 giây
2 94 5 giây
13
3 58 5 giây
4 72 5 giây
5 Lặp lại 30 lần từ bước 2
6 72 5 phút
7 4
* Gen waxy
Sử dụng cặp mồi (Ayres et al., 1997)
F 484: 5’-CTT TGT CTA TCT CAA GAC AC-3’
R 485: 5’ TTG CAG ATG TTC TTC CTG ATG-3’
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen Waxy
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian

cùng bằng 0.5- 1.5 mM.
Các Primer dùng trong PCR:
Gen Chỉ thị NS
T
Trình tự mồi Tài liệu
Xa4
Npb
181
11
F5'- ATC GAT CGA TCT TCA CGA
GG-3'
Yoshida et
al.1992
Npb 78 R5'- GTG CTA TAA AAG GAC TTC
GGG-3'
xa5 RG556 5
F5’-TAG CTG CTG CCG TGC TGT
GC-3’
R5’-AAT ATT TCA GTG TGC ATC
TC-3’
Xa7 P3 6
F5'- CAG CAA TTC ACT GGA GAT
GTG GTT-3'
Taura et
al.2003
R5'-CAT CAC GGT CAC CGC CAT
ATC GGA- 3'
Chu kỳ nhiệt
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7
Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian

- Quan sát vệt băng dưới đèn chiếu tia UV và chụp ảnh bản điện di.
16
PHẦN IV
KẾ HOẠCH, DỰ KIẾN
4.1 Dự kiến kết quả nghiên cứu
- Tuyển chọn được một số dòng giống chất lượng từ nguồn vật liệu địa
phương.
- Trong nguồn vật liệu đánh giá.
4.2 Tiến trình thực hiện đề tài
STT Thời gian thực hiện Nội dung công việc
1 2012 Tìm tài liệu liên quan đến vấn đề nghiên cứu
2 12/1/2013 Nhận đề tài thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
3 12/1 – 29/1/2013
Làm đề cương, hoàn chỉnh và nộp đề cương.
4 29/1 – 9/2/2013
+ Soạn giống, gieo mạ, theo dõi chăm sóc mạ.
+ Chuẩn bị đất bố trí thí nghiệm.
5 9/2 – 25/2
+ Bố trí cấy, định cây theo dõi, dặm lúa, chăm sóc
lúa thí nghiệm.
17
+ Đọc tài liệu viết tổng quan
6 25/2 – 25/4
+ Theo dõi thí nghiệm định kỳ các chỉ tiêu
+ Đọc tài liệu, viết xong tổng quan nộp thầy hướng
dẫn
7 25/4 – 5/5
Theo dõi lúa trỗ.
8 5/5 – 5/6
+ Theo dõi chín và lấy mẫu, thu hoạch.

Khoa học công nghệ và phát triển nông thôn 20 năm đổi mới, tập 1,
tr.311-325.
19