BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH
KHÁNG VI KHUẨN E. coli

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001-2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005
ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005
iii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
- Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các Thầy Cô đã luôn
tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi.
- TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang đã trực tiếp
hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- Các chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Đỗ Thị Châm, Dƣơng Ngọc Diễm, Võ Thị
Mỹ Duyên, Lạc Thị Thêm, Doãn Thị Sim thuộc phòng Miễn dịch viện
Pasteur Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực
hiện khoá luận.
- Thầy Lê Anh Phụng, cô Nguyễn Thị Kim Loan phụ trách phòng thí
nghiệm Vi Sinh và các thầy cô thuộc Bệnh xá Thú y đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
- Toàn thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời
gian làm đề tài.
Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo
điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.

đƣợc đánh giá qua phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (định tính) và phản ứng
ngƣng kết chậm trong ống nghiệm (định lƣợng). Ngoài ra để tăng cƣờng độ nhạy và độ
đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với
Staphylococcus aureus và hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn K88
+
.
Kết quả đạt đƣợc:
1. Cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày đều gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ.
2. Phát hiện đƣợc kháng thể trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm
14 ngày bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính.
3. Xác định đƣợc nồng độ S. aureus thích hợp để gắn với KHT nhằm tăng độ
nhạy của phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. KHT đƣợc xử lí gắn với
S. aureus (nồng độ 10
14
tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S. aureus là 1:4.
4. Hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở qui trình dài ngày cao hơn qui trình ngắn
ngày.
5. Tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh bằng cách tủa trong muối amonium
sulfate bão hòa.
6. Hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh.

v

MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii
Tóm tắt ................................................................................................................. iv
Mục lục ................................................................................................................. v

2.2. VI KHUẨN E. coli ........................................................................................ 14
2.2.1. Định nghĩa .............................................................................................. 14
2.2.2. Đặc tính sinh hóa .................................................................................... 14
2.2.3. Yếu tố kháng nguyên ............................................................................. 14
2.2.3.1. Kháng nguyên thân O ...................................................................... 14
2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K .............................. 15
2.2.3.3. Kháng nguyên lông roi H ............................................................... 15
2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE ............................ 15
2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH .............. 16
2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ ...................................... 17
2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) ........................... 17
2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT ........................................... 17
2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT .................................................................. 18
2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha ............................... 18
2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT ................ 19
2.6. PROTEIN A .................................................................................................. 19
3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .......................................... 21
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ........................................................................ 21
3.1.1. Thời gian thực nghiệm ........................................................................... 21
3.1.2. Địa điểm ................................................................................................. 21
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 21
3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ............................................................................ 21
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 22
3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ ............................................................. 22
3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm .......................................................................... 22
3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm ....................................................................... 22
vii
3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................. 23
3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh .................................................................. 25
3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà .............................. 26

4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh .............................................. 44
4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh ....................................... 44
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46
5.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 46
5.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 46
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 47
7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 49

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APC Antigen-presenting cell
(Tế bào trình diện kháng nguyên)
E. coli Escherichia coli
Ig Immunoglobulin
(Globulin miễn)
IL Interleukine
KHT Kháng huyết thanh
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
KN-KT Kháng nguyên – Kháng thể
MHC II Major histocompatibility complex class II antigens
(các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II)

gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG ........................................ 13
Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngoài
còn KT bị giữ lại .................................................................................. 17
H ình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên ............................................. 19
Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus .................................... 20
Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh ........................................................................... 26
Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm
tích ........................................................................................................ 27
Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ...................................................... 30
Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ........................................ 32
Hình 7.1 Thỏ nuôi thí nghiệm ............................................................................... 50
Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai ........................................................................... 50
Hình 7.3 Tiêm dƣới da .......................................................................................... 50
xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 3.1 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình ngắn ngày ........................ 23
Bảng 3.2 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình dài ngày (qui trình viện
Pasteur Tp. HCM) ................................................................................. 24
Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết
thanh của thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................ 33
Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết
thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 ............................................................. 34
Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh
thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................................ 35
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và
thỏ 4 ...................................................................................................... 36
Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở

xiii

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

SƠ ĐỒ TRANG
Sơ đồ 3.1 Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli ............................ 22
Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh ......................................... 25
Sơ đồ 3.3 Qui trình hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu ................................. 28
Sơ đồ 3.4 Qui trình gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus .... 29
Sơ đồ 3.5 Qui trình chuẩn bị dịch kháng nguyên thực hiện phản ứng ngƣng kết
chậm trong ống nghiệm ........................................................................ 31
1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong chăn nuôi việc chẩn đoán, phát hiện bệnh sớm để điều trị kịp thời sẽ làm
giảm đáng kể những thiệt hại gây ra về kinh tế cũng nhƣ sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.
Tùy theo từng tác nhân gây bệnh mà có các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh khác nhau.
Thông thƣờng để chẩn đoán bệnh do vi sinh vật ngƣời ta dùng phƣơng pháp cổ điển là
nuôi cấy phân lập tế bào vi sinh vật, định danh chúng bằng các phản ứng huyết thanh
học. Kĩ thuật hiện đại nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction) có độ nhạy và độ đặc
hiệu cao hơn các phƣơng pháp kinh điển do đó giúp chẩn đoán nhanh và chính xác
hơn. Nhƣng kĩ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên liệu riêng, đắt tiền, kĩ
thuật thực hiện còn phức tạp, cán bộ kĩ thuật phải có trình độ kĩ thuật nhất định.
Các kĩ thuật chẩn đoán miễn dịch học mà điển hình là kĩ thuật ELISA (Enzyme-
3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
2.1.1. Khái niệm miễn dịch
Miễn dịch là khả năng đề kháng của sinh vật chống lại một sinh vật khác và các

Kháng thể dịch thể hay immunoglobulin (Ig) là protein “dạng cầu” đƣợc tổng hợp
bởi tế bào tƣơng (plasma cell) khi bị kích thích bởi KN. Nó đƣợc tạo ra để giúp sinh
vật chống đỡ các yếu tố KN có hại xâm nhập vào cơ thể.
2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin
Phân tử Ig gồm một hay nhiều đơn
vị với cấu trúc tƣơng đối giống nhau.
Mỗi đơn vị là một phân tử protein có 4
chuỗi polypeptid giống nhau từng đôi
một: 2 chuỗi nhẹ và 2 chuỗi nặng,
chúng đƣợc nối với nhau bằng những
cầu nối disulfua (-S-S-) (hình 2.1).

Chuỗi nhẹ L (light chain)
Chuỗi nhẹ có trọng lƣợng phân tử
khoảng 23.000 Da. Có hai loại chuỗi
nhẹ chung cho tất cả các lớp Ig:
Chuỗi nhẹ Kappa (kí hiệu K
hay κ)
Chuỗi nhẹ Lambda (kí hiệu λ)
Tỉ lệ mang chuỗi nhẹ κ và λ của các Ig khác nhau giữa các loài.
Chuỗi nhẹ đƣợc chia thành hai phần dài bằng nhau:
 Phần hằng định: kí hiệu C
L
(constant) có tận cùng –COOH với trình tự acid
amin tƣơng đối không đổi.
 Phần thay đổi: kí hiệu V
L
(variable) có tận cùng là –NH
2
. Trật tự acid amin

Ngoài các phần bất biến và siêu biến, chuỗi nặng còn một nhóm glucid đƣợc gọi
là oligosaccharide có nhiệm vụ cố định bổ thể giúp cho kháng thể dễ dàng bám vào bề
mặt của tế bào thực bào và quyết định tính KN của phân tử KT.
Theo quan điểm ngày nay thì vùng siêu biến của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ tham
gia vào sự hình thành cấu trúc bổ sung đặc hiệu trong sự kết hợp với KN (paratop).
Paratop không phải là một đoạn peptid liên tục, dài mà chỉ là một (hoặc một số)
acid amin nằm cách quãng. Đó là những “điểm” mà paratop tiếp xúc với epitop, thông
thƣờng mỗi paratop có từ 3-6 “điểm” nhƣ vậy.
2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của thú [2] [13]
2.1.4.1. Loài thú
Đáp ứng miễn dịch càng tăng khi có sự khác biệt di truyền giữa thú gây miễn dịch
(túc chủ) với loài đƣợc sử dụng làm kháng nguyên càng lớn vì kháng nguyên sẽ có
nhiều epitop lạ đối với túc chủ.
Đối với hầu hết các kháng nguyên protein, thỏ là thú thuận tiện để gây miễn dịch
thực nghiệm.
2.1.4.2. Yếu tố di truyền
Khả năng đáp ứng miễn dịch của thú còn phụ thuộc vào yếu tố di truyền vì với
cùng một loại kháng nguyên nếu đƣa vào các cá thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn
dịch khác nhau. Thông thƣờng các thú lai khác dòng có khả năng kích thích miễn dịch
cao hơn các thú lai cùng dòng.

6
2.1.4.3. Kháng nguyên
a. Tính lạ của kháng nguyên


7
Ví dụ: D-amino acid là một kháng nguyên yếu vì enzyme của động vật hữu nhũ
không phân hủy amino acid dạng này.
e. Liều lượng kháng nguyên
Nếu lƣợng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngƣợc lại
nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch.
Ở các mũi nhắc nên giảm lƣợng kháng nguyên 2 – 3 lần so với gây mẫn cảm để
tăng ái lực của kháng thể cần tạo nên.
f. Đường xâm nhập của kháng nguyên vào cơ thể
Kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch mạnh nhất khi chúng đƣợc tiêm trực tiếp
vào hạch bạch huyết vùng kheo của thú. Tuy nhiên cách này đòi hỏi trình độ tay nghề
cao.
Tiêm kháng nguyên nhiều mũi dƣới da, trong da hoặc tiêm một mũi trong bắp thịt
đƣợc áp dụng rộng rãi hơn vì đơn giản dễ thực hiện và cho kết quả mong muốn.
Ngoài ra với các kháng nguyên mạnh (vi khuẩn, virus, tế bào…) khi đƣa vào
đƣờng mạch máu có thể dễ dàng gây ra đáp ứng miễn dịch. Nhƣng với kháng nguyên
hòa tan thì phải có qui trình gây đáp ứng miễn dịch thích hợp, tốt nhất là tiêm trong da,
dƣới da và phải tiêm nhắc lại nhiều lần.
g. Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên
Nếu cùng một lúc gây mẫn cảm nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì kháng
thể đặc hiệu đƣợc sinh ra tƣơng ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng
hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình. Hiện tƣợng này gọi là sự
cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng nguyên.
Tuy nhiên cũng có trƣờng hợp cùng một lúc gây mẫn cảm cho thú với hai loại
kháng nguyên: một liều mạnh, một liều nhẹ thì con thú có thể chỉ phản ứng với kháng
nguyên liều mạnh. Hiện tƣợng này gọi là sự cạnh tranh kháng nguyên, chỉ xảy ra ở hai
kháng nguyên có cấu trúc hóa học gần giống nhau.
2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch
Qui trình gây miễn dịch có ảnh hƣởng lớn đến đáp ứng miễn dịch đối với phân tử

tồn tại lâu hơn trong cơ thể túc chủ. Kháng nguyên đƣợc giải phóng dần dần có tác
dụng giống nhƣ kích thích miễn dịch nhiều lần.
Một số loại tá chất: Freund’s Complete Adjuvant (FCA) và Freund’s Incomplete
Adjuvant (FIA), Aluminum hydroxide (ALUM), Rabi Adjuvant System (RAS),
Syntex Adjuvant Formulation (SAF)… 9
2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể [3] [6] [8] [13]
2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể
a. Tế bào trình diện kháng nguyên (APC: antigen-presenting cell)
Tế bào trình diện kháng nguyên có 2 đặc tính: có các kháng nguyên phù hợp tổ
chức chính lớp II (Major histocompatibility complex class II antigens – MHC class II
antigens) trên bề mặt tế bào và tiết interleukine 1 (IL-1) (ngoài ra nó còn tiết nhiều
cytokine khác.
Có 2 nhóm tế bào trình diện kháng nguyên:
 Tế bào trình diện kháng nguyên “chuyên nghiệp” (“professional” APC): chủ
động bắt và trình diện KN. Bao gồm các tế bào: đại thực bào, tế bào tua
(dendritic cell), tế bào B.
 Các tế bào khác, chỉ trình diện kháng nguyên khi tế bào bị nhiễm.
Khi xâm nhập vào cơ thể các KN đƣợc các APC “chuyên nghiệp” tóm bắt bằng
cách thực bào (đại thực bào) hay gắn với các thụ quan đặc hiệu (specific receptor) Ig
trên bề mặt tế bào (tế bào B).
Đối với KN protein ngoại bào

+
trên bề mặt tế bào lympho T (T cell receptor –
TCR) và sự hiện diện của yếu tố đồng kích thích interleukin 1 (tùy loại tế bào lympho
T
H
). Khi đƣợc kích thích, tế bào T
H
tiết ra hỗn hợp các cytokine cần thiết cho sự tăng
sinh và biệt hóa tế bào B thành tế bào plasma sản xuất kháng thể.

c. Tế bào lympho B
Tế bào lympho B là tế bào sinh kháng thể, quá trình biệt hóa tế bào B thành tế bào
tƣơng (plasma cell) sản xuất kháng thể có thể chia thành 2 giai đoạn:
 Giai đoạn 1: các tế bào nguồn trong tủy xƣơng đƣợc biệt hóa thành tiền
lympho B, sau đó thành các lympho B chƣa chín và cuối cùng phát triển thành lympho
B chín với các immunoglobulin bề mặt SIg (Surface immunoglobulin). Giai đoạn này
không cần sự kích thích của kháng nguyên và sự có mặt của tế bào lympho T
H
. Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm
bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II
và biểu lộ trên bề mặt tế bào.
(trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13]

Hình 2-1 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, 11
 Giai đoạn 2: các tế bào lympho B chín biệt hóa thành tế bào tƣơng sản xuất
kháng thể. Quá trình này cần sự kích thích của kháng nguyên, một số interleukin và sự
kết hợp của tế bào T
H
với lympho B.
Tế bào plasma là những tế bào hình trứng, đƣờng kính 8-9 µm, có nhân tròn lập dị
với các chromatin không đồng dạng. Chúng có tế bào chất lớn với mạng lƣới nội chất
hạt dày đặc (hình 2.4).

Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào plasma

Samonella).
Trong khi một số biệt hóa thành tế bào plasma thì một số tế bào B khác chuyển
thành tế bào nhớ giúp cho đáp ứng lần sau với chính KN đó nhanh hơn và mạnh hơn.
Đáp ứng thứ phát: khi có sự tiếp xúc với kháng nguyên lần đầu và nếu cho tiếp
xúc lần sau với chính kháng nguyên đó thì KN gắn với các thụ thể tƣơng ứng là các
phân tử KT trên bề mặt của tế bào B nhớ làm tế bào nhớ tăng sinh và biệt hoá thành tế
bào plasma sản xuất KT do đó chúng ta sẽ thấy rõ hàm lƣợng kháng thể tăng nhanh và
cao hơn nhiều lần so với lần đầu.

Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng
này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh.
(http://www.uccs.edu/~rmelamed/MicroFall2002/Chapter%2017/Antibody%20Time%
20Course.jpg)